Name: fabrication of amyloid-&#946;-secreting alginate microbeads for use in modelling alzheimer's disease
Uploaded: 2019-07-06T12:30:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Amyloid-ÃŽÂ²-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease at JoVE.com

लेखकों को श्री काजेन Suresparan, डॉ जोनाथन Wubetu, श्री Dominik Grudzinski, मिस चेन झाओ, और डॉ Thierry पायलट alginate microbead निर्माण, सेल संस्कृति और एजेड का पता लगाने के अनुकूलन में उनकी मदद के लिए धन्यवाद करना चाहते हैं, और उपयोगी वैज्ञानिक चर्चा.

1. तैयारी
<ol><li>$4% (w/v) alginate स्टॉक समाधान के 100 एमएल तैयार करें।<ol>
<li>4.4 ग्राम एल्जिनेट सोडियम नमक का वजन करें और सूखे पाउडर को 100 एमएल में HEPES-बफरेड नमकीन (एचबीएस, 20 एम एम हेप्स (0.477 ग्राम) के साथ 150 एम एम NaCl (0.877 ग्राम) के साथ डीऑनीकृत जल जलयोजन की अनुमति दें।</li>
		<li>$ 500 क्रांतिप्रति मिनट (rpm) पर एक चुंबकीय उत्तेजक का प्रयोग करें और पूरी alginate जलयोजन की अनुमति देने के लिए 50 डिग्री सेल्सियस तक गर्मी. नोट: alginate पूरी तरह से हाइड्रेटेड होने के लिए एक या दो घंटे की आवश्यकता हो सकती है। समय पर बचाने के लिए, alginate समाधान encapsulation प्रोटोकॉल के अग्रिम में एक दिन बनाया जा सकता है और अगले दिन तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत. जब alginate ठंडा किया गया है, धीरे से 37 डिग्री सेल्सियस के लिए एक पानी स्नान या एक गर्म थाली का उपयोग कर गर्मी और तुरंत उपयोग करने से पहले एक चुंबकीय उत्तेजक के साथ आंदोलन.</li>
		<li>उपयोग करने से पहले 0.22 मीटर पोर polyethersulfone (PES) फिल्टर का उपयोग करके अल्जिनेट समाधान को स्टराइल फ़िल्टर करें। alginate के आसान प्रवाह की अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर फ़िल्टरिंग की सिफारिश की जाती है। यदि तापमान में गिरावट आने दी जाती है तो चिपचिपापन बढ़ जाएगा।</li>
	</ol>
</li>
	<li>0.5 एम CaCl2के 1,000 एमएल तैयार करें।<ol>
<li>55.49 ग्राम एनहाइड्रोस केसीएल2 का वजन करें और एचबीएस के 1,000 एमएल (20 एमएम हैप्स और 150 एमएल नैक्ल में 1,000 एमएल डीनीकृत जल) में घुल जाते हैं।</li>
		<li>एक 0.22 डिग्री pores पीएस फिल्टर का उपयोग कर बाँझ फिल्टर.</li>
	</ol>
</li>
	<li>विघटन मिश्रण के 100 एमएल तैयार करें।<ol>
<li>फॉस्फेट-बफर्ड लवण में 100 मीटर हैप्स (23.83 ग्राम) और 500 मीटर ट्राइसोडियम साइट्रेट डाइहाइड्रेट (147.05 ग्राम) घोल तैयार करें।</li>
		<li>पीएच 7.4 NaOH या एचसीएल का उपयोग करने के लिए समायोजित करें।</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. encapsulation प्रणाली की स्थापना
<ol><li>स्तरीय प्रवाह हुड साफ करें।<ol>
<li>यूवी जोखिम का उपयोग कर encapsulator युक्त laminar प्रवाह हुड स्टरलाइज़ 70% v/v इथेनॉल समाधान के साथ छिड़काव के बाद।</li>
		<li>एनकैप्स्युलेटर प्रणाली को 70% v/v इथेनॉल विलयन के 10 एमएल के साथ फ्लश करें जिसके बाद 10 एमएल बाँझ deionized पानी का उपयोग किया गया है।</li>
		<li>300 डिग्री मीटर नोजल संलग्न करें और चरण 2.1.2 दोहराएँ।</li>
		<li>फ़िल्टरकिए गए ऐल्जिनेट समाधान युक्त बोतल स्प्रे करें, फ़िल्टर किए गए कैल्शियम क्लोराइड समाधान और किसी भी उपकरण, उपकरण और खाली संस्कृति प्लेटों वाली बोतल का उपयोग 70% v/v इथेनॉल समाधान के साथ किया जाएगा और उन्हें लेमिनर प्रवाह हुड में रखें। उपयोग करने से पहले, एक यूवी प्रकाश पर फिर से 30 मिनट के लिए स्विच करने के लिए अच्छी तरह से बाँझ.</li>
		<li>एक जैविक ग्रेड कीटाणुनाशक समाधान से भरा एक अपशिष्ट बीकर तैयार करें और बीकर को हुड में रखें।</li>
		<li>बाँझ CaCl2 (जलीय) समाधान के 100 एमएल के साथ एक बीकर भरें और एक चुंबकीय उत्तेजक में जोड़ें। 100 आरपीएम के लिए सरगर्मी की गति सेट करें। नोजल की नोक से 18 सेमी की ऊंचाई पर बीकर को चुंबकीय मंच पर रखें। इस बीकर alginate मोती इकट्ठा करने और उनके जेलेशन की अनुमति देने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.</li>
	</ol>
</li>
	<li>encapsulation के लिए कोशिकाओं को तैयार करें.<ol>
<li>इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को निकालें और 0.25% ट्रिप्सिन-EDTA समाधान का उपयोग करके निकट-प्रवाही फ्लास्क से अलग करें और 5-10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।</li>
		<li>कोशिका घनत्व के आकलन के लिए एक नमूना अलग करें और फिर एक सेल गोली प्राप्त करने के लिए 5 मिनट के लिए 1,000 आरपीएम पर शेष कोशिकाओं को अपकेंद्रण करें।</li>
		<li>HBS में गोली को पुन: निलंबित (20 एमएम HEPES और 150 एमएम NaCl) अंतिम वांछित सेल एकाग्रता डबल करने के लिए (उदाहरण के लिए, 1.5 x 106 कोशिकाओं /</li>
		<li>50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में, सेल निलंबन को $4% (w/v) एल्जिनेट समाधान के साथ 1:1 अनुपात में मिलाएं ताकि वांछित सेल सांद्रता (उदा., 1.5 x 106 सेल/एमएल) को $2% (w/v) ऐग्जिनेट समाधान में शामिल किया जा सके।</li>
	</ol>
</li>
	<li>encapsulation पैरामीटर सेट करें।<ol>
<li>encapsulator मशीन की गति अधिकतम बाहर निकालना गति (8.9 लाख/मिनट), वोल्टेज करने के लिए 1.0 केवी और आवृत्ति के लिए 5,500 हर्ट्ज के लिए सेट करें। नोट: इन मापदंडों पहले व्यास में 550 डिग्री मीटर के microbeads प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया गया.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. निर्माण
<ol><li>माइक्रोबीड्स तैयार करें।<ol>
<li>20 एमएल सिरिंज में, सेल-एल्गिनेट निलंबन के 5 एमएल लोड करें और एनकैप्स्युलेटर में एक सिरिंज संलग्न करें।</li>
		<li>प्रवाह को सक्रिय करके encapsulator शुरू करें जो फीडर के माध्यम से सेल-एग्निनेट निलंबन को धक्का देगा। नोजल के माध्यम से बूंदों की एक धारा को बाहर निकाल दिया जाएगा।</li>
		<li>प्रारंभिक गैर-यूनिफ़ॉर्म स्ट्रीम को शून्य करने के लिए अपशिष्ट बीकर में पहले 1 एमएल एकत्र करें।</li>
		<li>बूंदों CaCl2 जेलेशन स्नान में गिर करने के लिए अनुमति शेष 4 एमएल चलाने के लिए जारी रखें। प्रत्येक मिलीलीटर अलग से चलाया जा सकता है (लेकिन क्रमिक रूप से) और यदि आवश्यक हो तो चार अलग-अलग जेलेशन स्नान में एकत्र किया जा सकता है। नोट: जेलेशन स्नान के साथ संपर्क करने पर, बूंदों में alginate तुरन्त जेलेशन स्नान में कैल्शियम आयनों के साथ पार से लिंक और गोलाकार microbeads फार्म होगा.</li>
		<li>एक मिनट के बाद, चुंबकीय मंच से जेलेशन बीकर को हटा दें और माइक्रोबीड्स को आंदोलन के बिना एक और 4 मिनट के लिए बैठने की अनुमति दें (कमरे के तापमान पर माइक्रोबीड्स में पूरा जेलेशन की अनुमति देने के लिए आवश्यक समय)।</li>
	</ol>
</li>
	<li>माइक्रोबीड्स प्राप्त करें।<ol>
<li>बाँझ tweezers की एक जोड़ी का उपयोग कर किसी भी बड़े alginate मलबे या कलाकृतियों निकालें, और फिर जेलेशन स्नान से microbeads पुनः प्राप्त करने के लिए एक 74 डिग्री मीटर जाल फिल्टर करने के लिए स्थानांतरित करने के लिए एक बाँझ प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करें।</li>
		<li>उपयुक्त संस्कृति माध्यम का उपयोग कर एक अपकेंद्रण ट्यूब में microbeads स्थानांतरण और सेल संस्कृति माध्यम में 5 मिनट के लिए बराबर करने के लिए अनुमति देते हैं।</li>
		<li>ऊष्मायन और आगे के प्रयोगों के लिए एक फ्लास्क, प्लेट या पेट्री डिश में स्थानांतरण। नोट: जेलेशन स्नान पुन: उपयोग नहीं किया जाना चाहिए।</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. परीक्षण और microbeads का उपयोग
<ol><li>परीक्षण microbead गुणवत्ता.<ol>
<li>encapsulation और संस्कृति के बाद सेल व्यवहार्यता (या अन्य जैविक readouts) का आकलन करने के लिए, धीरे विघटन मिश्रण का उपयोग कर encapsulated कोशिकाओं को जारी करने के लिए microbeads को बाधित. नोट: विघटन मिश्रण की आवश्यक मात्रा प्रति परीक्षण इस्तेमाल microbeads की संख्या पर निर्भर है. एक सुझाव दिया राशन encapsulated कोशिकाओं के हर 1 एमएल करने के लिए विघटन मिश्रण के 4 एमएल है। इस चरण में केवल एक नमूना fro प्रत्येक microbead आबादी पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए.</li>
		<li>एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए पूरक।</li>
		<li>trypan नीले रंग के साथ कोशिकाओं को धुंधला और एक हीमोसाइटोमीटर कक्ष का उपयोग करके हमेशा की तरह समाधान में अब कोशिकाओं के लिए सेल व्यवहार्यता का अनुमान. नोट: यदि सेल व्यवहार्यता के आकलन के लिए स्वचालित सेल काउंटरों का उपयोग कर, देखभाल की गिनती के साथ हस्तक्षेप alginate कलाकृतियों से बचने के लिए लिया जाना चाहिए. उन मामलों में, नौल सेल गिनती की सलाह दी है.</li>
		<li>microbead स्थिरता का आकलन करने के लिए, एक माइक्रोस्कोप और इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक समय पाठ्यक्रम पर प्रत्येक microbead आबादी से एक नमूने के लिए औसत व्यास को मापने. व्यास में नाटकीय बाद में भिन्नता एंजिनेट अवक्रमण का संकेत हो सकता है।</li>
	</ol>
</li>
	<li>स्रावित एजेड का पता लगाने के लिए माइक्रोबीड्स का उपयोग करें।<ol>
<li>7PA2 कोशिकाओं से नमूना सेल संस्कृति मीडिया मानक स्थितियों में सुसंस्कृत (2 डी) 24 एच अंतराल पर और आगे के विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.</li>
		<li>नमूना सेल संस्कृति मीडिया से encapsulated 7PA2 कोशिकाओं मानक शर्तों में सुसंस्कृत (3 डी) 24 एच अंतराल पर और आगे के विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.</li>
		<li>एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख (एलिसा) द्वारा एकत्र किए गए वातानुकूलित मीडिया में 7PA2 कोशिकाओं से एजेड के स्राव का पता लगाएँ (एलिसा) (चित्र4)।</li>
	</ol>
</li>
	<li>प्रासंगिक अनुप्रयोगों में आगे अध्ययन के लिए microbeads का प्रयोग करें. नोट: Encapsulated 7PA2 कोशिकाओं को किसी भी या मॉडल में निरंतर एजेड स्राव के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।<ol>
<li>दिमाग में चूहे हिप्पोकैम्पस के भीतर microbead engraftment के लिए, चूहे मस्तिष्क के 1 मिमी मोटी कोरोनल वर्गों उत्पन्न करते हैं और वांछित क्षेत्र में microbeads डालने के लिए शल्य चिकित्सा उपकरणों का उपयोग करें (चित्र 5)।</li>
		<li>ब्याज के जैव अणुओं की निरंतर रिहाई का आकलन करने के लिए वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए alginate microbeads में विभिन्न सेल प्रकार encapsulate. इन विट्रो और विवो सिस्टम में प्रासंगिक आगे मॉडलिंग की जा सकती है।</li>
		<li>प्रवाह साइटोमेट्री और/या इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके encapsulated कोशिकाओं के झिल्ली-बाउंड मार्करों की अभिव्यक्ति का पता लगाएं। नोट: ट्यूमर जन विकास और biomarker अभिव्यक्ति के प्रारंभिक चरणों मॉडलिंग microbeads के निर्माण के लिए एक समान विधि के उपयोग का एक उदाहरण Rios 20द्वारा वर्णित है.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

इस आलेख में उल्लिखित विधि कोशिकाओं को एल्जिनेट माइक्रोबीड्स27के संकीर्ण आकार के वितरण को प्राप्त करने के लिए उपयोगी है . यह भी एक प्रतिरक्षा अलग वातावरण में बढ़ती कोशिकाओं का लाभ affords17,19,उन्हें बाहरी तनाव से बचाने के. इसके अतिरिक्त, alginate में कोशिकाओं के encapsulation और अधिक बारीकी से शारीरिक स्थितियों की नकल, विशेष रूप से सेल से सेल बातचीत और मैट्रिक्स कठोरता20के संबंध में. ये सभी कारक प्रासंगिक अनुप्रयोगों में बाद में उपयोग के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं, जैसे विवो engraftment में, आसपास के ऊतकों में संभावित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को रोकना17. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल का एक प्रमुख लाभ ब्याज के आवेदन के अनुसार आसान tuneability है: यह प्रोटोकॉल को संशोधित करने और बड़े या छोटे के निर्माण के लिए मानकों का अनुकूलन संभव है, और नरम या stiffer मोती. वर्णित विधि कम से कम इनवेसिव तरीकों के साथ इंजेक्शन किया जा करने के लिए पर्याप्त छोटे मोती बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है, और पर्याप्त रूप से कोशिकाओं की एक संख्या की मेजबानी और अवलोकन व्यवहार और रोग प्रभाव में परिणाम के लिए एजेड की एक पर्याप्त रिलीज प्रदान करने के लिए पर्याप्त बड़ी पशु मॉडल में इंजेक्शन पर.
इस प्रोटोकॉल की सफलता महत्वपूर्ण चरणों की एक संख्या पर निर्भर है. सेल व्यवहार्यता बनाए रखने और कार्य20,28को बनाए रखने के लिए सावधान सेल हैंडलिंग और इष्टतम सेल पुलिंग तकनीकें महत्वपूर्ण हैं . मानक संस्कृति की स्थिति का उपयोग 7PA2 कोशिकाओं के सामान्य समारोह के संरक्षण सुनिश्चित करता है, के रूप में मनाया. यह 2D संस्कृतियों के साथ तुलना करते समय encapsulated कोशिकाओं से A$1-42 के लिए एक समान रिलीज़ प्रोफ़ाइल की अनुमति देता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल के लिए बेहतर काम करने के लिए, एक कम viscosity alginate समाधान एक उच्च चिपचिपापन alginate समाधान के साथ तुलना में बेहतर परिणाम की गारंटी देता है. यह सुनिश्चित करता है कि एक समरूप स्तरीय जेट नोजल के माध्यम से बाहर निकाल दिया जाता है और गढ़े हुए मोती27के मैट्रिक्स के भीतर कोशिकाओं का भी वितरण होता है . कोशिकाओं encapsulate करने के लिए इस्तेमाल सामग्री एक बहुत तेजी से जेलेशन तंत्र होना चाहिए, आकार की अवधारण की अनुमति.
इस प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम gelation के बाद गढ़े microbeads की हैंडलिंग है. यहाँ, हम मोती हस्तांतरण करने के लिए एक बड़े एपर्चर प्लास्टिक पाइपेट का उपयोग करके microbeads की पुनर्प्राप्ति दिखा. वैकल्पिक रूप से, एक जाल फिल्टर में microbeads युक्त कैल्शियम क्लोराइड समाधान डालने मनका पुनर्प्राप्ति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक बड़े (5, 10 या 25 एमएल) serological pipette microbeads आकर्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और फिर डालने के बजाय जाल फिल्टर के माध्यम से धोया. इस का लाभ डालने की तुलना में प्रक्रिया की बाँझपन में एक उच्च विश्वास है. हालांकि, सीमाओं की है कि कुछ मोती विकृत हो सकता है अगर वे pippette द्वारा संकुचित कर रहे हैं, एक कम उपज जोखिम के अलावा अगर microbeads का एक बड़ा अनुपात बचाया नहीं कर रहे हैं.
इस दृष्टिकोण मॉडल और विभिन्न रोगों का अध्ययन करने के लिए विभिन्न सेल लाइनों encapsulate करने के लिए इस्तेमाल किया गया है (जैसे, इंसुलिन की रिहाई से encapsulated अग्नाशयी islet). हमारे दृष्टिकोण की नवीनता vivo में अल्जाइमर रोग के महत्वपूर्ण पहलुओं मॉडलिंग में एक उपयोगी विधि के रूप में इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पन्न microbeads के engraftment है. जब एक बोलस इंजेक्शन द्वारा उत्पन्न एजेड के स्तर तक (चित्र 4) से एजेड की रिलीज़ प्रोफ़ाइल की तुलना करते समय (जैसे कि अन्य अध्ययनों में रिपोर्ट किया गया3,26), एजेड का अधिक पुराना और निरंतर रिलीज हो सकता है अपेक्षित. चित्र 6 में उन अनुमानित प्रवृत्ति को दिखाया गया है जो प्राप्त की जा सकती हैं। विवो मॉडलिंग में इस प्रणाली का उपयोग करने के लिए जिस तरह से रोग की प्रगति के लिए और अधिक उपयोगी हो सकता है दवा की खोज और विकास के लिए प्रासंगिक है.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig6.jpg"> चित्र 6 : एक बोलस इंजेक्शन के साथ तुलना में encapsulated 7PA2 कोशिकाओं से एजेड1-42 की अनुमानित रिलीज प्रोफ़ाइल। engrafted 7PA2 युक्त microbeads से एजेड रिलीज की प्रोफ़ाइल ई. के लिए प्रासंगिकता के एक पशु मॉडल में पुरानी और निरंतर एजेड के प्रभाव के परीक्षण की अनुमति देता है. इसके विपरीत, एक बोलस इंजेक्शन समय की एक छोटी अवधि में एजेड स्तर में एक कील पैदा करेगा, मस्तिष्क से एजेड की एक तेजी से निकासी के बाद. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig6large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:848px;" width="847">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">&#181;Manager software</td>
			<td style="width:261px;">Vale Lab, UCSF, USA</td>
			<td style="width:100px;">v.1.46</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">0.22 um PES filter</td>
			<td style="width:261px;">Merck, UK</td>
			<td style="width:100px;">SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">15mm Netwell insert 74 um mesh filter</td>
			<td style="width:261px;">Constar, usa</td>
			<td style="width:100px;">#3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Alginic acid sodium salt from brown algae</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td style="width:100px;">A0682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td style="width:100px;">C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:341px;">CellTiter96&#160; AQueous One Solution cell proliferation assay</td>
			<td style="width:261px;">Promega, USA</td>
			<td style="width:100px;">G3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Encapsulator</td>
			<td style="width:261px;">Inotech</td>
			<td style="width:100px;">IE-50</td>
			<td>serial no. 05.002.01-2005</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">HEPES</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td style="width:100px;">H4024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Hu A&#946; 1-42 ELISA</td>
			<td style="width:261px;">ThermoFisher, UK</td>
			<td style="width:100px;">KHB3441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:261px;">ImageJ</td>
			<td style="width:100px;">v1.49p</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Inverted light microscope</td>
			<td style="width:261px;">Olympus</td>
			<td style="width:100px;">CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Leica microscope</td>
			<td style="width:261px;">Leica microsystems, UK</td>
			<td style="width:100px;">DMI6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Neo sCMOS Camera</td>
			<td style="width:261px;">Ander, UK</td>
			<td align="right" style="width:100px;">5.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td style="width:100px;">D1408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td align="right" style="width:100px;">433209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Trispdium citrate dihydrate</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td style="width:100px;">W302600-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td style="width:100px;">T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of amyloid-&#946;-secreting alginate microbeads for use in modelling alzheimer's disease

एमिलॉयड झरना परिकल्पना के अनुसार, अल्जाइमर रोग (एडी) के विकास में जल्द से जल्द ट्रिगर विषाक्त एमिलॉयड-जेड (एजेड) टुकड़े का संचय है, जो अंततः बीमारी की शास्त्रीय विशेषताओं के लिए अग्रणी है: एमिलॉयड प्लेक, न्यूरोफाइब्रिलरी उलझनऔर सिनैप्टिक और न्यूरोनल हानि। प्रासंगिक गैर ट्रांसजेनिक पूर्व नैदानिक मॉडल रोग प्रगति के चिंतनशील की कमी प्रभावी दवा उपचार की खोज में बाधा मुख्य कारकों में से एक है। इस उद्देश्य के लिए, हमने पुराने एजेड उत्पादन के प्रभावों के अध्ययन के लिए उपयोगी एमिलॉयड-स्रावित कोशिकाओं वाले ऐजिनेट माइक्रोबीड्स के निर्माण के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है।
चीनी हम्सटर अंडाशय कोशिकाओं को पहले एक मानव एपीपी जीन के साथ transfected, एजेड (यानी, 7PA2 कोशिकाओं) स्रावित, इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया. एजेड की निरंतर रिहाई के लिए इन विट्रो मॉडल में एक तीन आयामी (3 डी) alginate में 7PA2 कोशिकाओं के encapsulation द्वारा निर्मित किया गया था. इस प्रक्रिया को विवो अध्ययन में आगे के लिए 500-600 मीटर के मनका व्यास को लक्षित करने के लिए अनुकूलित किया गया था। alginate में 7PA2 सेल encapsulation के अनुकूलन निर्माण मानकों में फेरबदल किया गया था, जैसे, alginate एकाग्रता, जेल प्रवाह दर, स्थिर स्टैकुलिक क्षमता, सिर कंपन आवृत्ति, जेलिंग समाधान. स्रावित एजेड के स्तर का समय के साथ विश्लेषण किया गया और एल्गिनेट मोती और मानक सेल संस्कृति विधियों (96 ज तक) के बीच तुलना की गई।
1.5 x 106 7PA2 कोशिकाओं/एमएल की सांद्रता और 2% (w/v) की एक alginate एकाग्रता HEPES के साथ बफर और बाद में जेलेशन में 0.5 एम कैल्शियम क्लोराइड के लिए 5 मिनट के लिए सबसे स्थिर microbeads गढ़ना पाया गया. गढ़े microbeads थे 1) वर्दी आकार के, 2) 550 डिग्री की एक औसत व्यास के साथ, 3) माइक्रोबीड प्रति 100-150 कोशिकाओं के बारे में युक्त और 4) एजेड स्रावित करने में सक्षम.
अंत में, स्थिर alginate microbeads के उत्पादन के लिए हमारे अनुकूलित विधि amyloid उत्पादक 7PA2 कोशिकाओं युक्त दोनों इन विट्रो में और विवो में ई. के महत्वपूर्ण पहलुओं की मॉडलिंग सक्षम हो सकता है.

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Fabrication of Amyloid-ÃƒÅ½Ã‚Â²-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

अल्जाइमर रोग मॉडलिंग में उपयोग के लिए एमिलॉयड-जेड-सीक्रेटिंग अल्जीनेट माइक्रोबीड्स का निर्माण

इस प्रोटोकॉल कोशिकाओं को स्थिर करने के लिए alginate के तेजी से शारीरिक जेलेशन द्वारा एक सेल encapsulation विधि दिखाता है. प्राप्त माइक्रोबीड्स समय के साथ एमिलॉयड-जेड के नियंत्रित और निरंतर स्राव की अनुमति देते हैं और इन विट्रो में और विवो मॉडल में स्रावित एमिलॉयड-जेड के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

According to the amyloid cascade hypothesis, the earliest trigger in the development of Alzheimer&#8217;s disease (AD) is the accumulation of toxic ...

यह प्रोटोकॉल माइक्रोमोतियों के निर्माण को बताता है, जिसका उपयोग रिलीज की दर और एमिलॉयड की मात्रा को नियंत्रित करने में मदद करने के लिए किया जाएगा जो ब्याज का प्रोटीन है। माइक्रोमोतियों एक उपयुक्त जैव सामग्री में कोशिकाओं को स्थिर करेगा और यह उन्हें अपने आसपास के वातावरण से आश्रय होगा, साथ ही उन्हें अपने आसपास के वातावरण के साथ byproducts और पोषक तत्वों का आदान प्रदान करने की अनुमति। इस तकनीक का उपयोग करके कोशिकाओं को एनकैप्सुलेट करने से माइक्रोमोतियों के आकार के साथ-साथ सेल संख्या का तंग नियंत्रण सुनिश्चित होता है, और हम विभिन्न निर्माण मापदंडों को समायोजित करके ऐसा करते हैं।तो इस प्रोटोकॉल में वर्णित कोशिकाओं को encapsulating हमें एमीलॉयड की एक पुरानी रिहाई के अधिक देने के लिए दोनों में विट्रो और वीवो सिस्टम में उपयोग करेंगे, और विचार यह होगा कि हमें रोग के तंत्र की एक बेहतर समझ दे और भी हमें नए उपचार का परीक्षण करने की अनुमति होगी । इस विधि का उपयोग नियंत्रित प्रणाली तैयार करने और कई सेल प्रकारों के लिए किसी भी जैव अणुओं की रिहाई का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, चाहे वह अकेले हो या संयोजन में। शुरू करने के लिए, इनक्यूबेटर से एक निकट-कॉन्फ्लूंट फ्लास्क निकालें।कोशिकाओं को अलग करने के लिए पांच से 10 मिनट के लिए 0.25% ट्राइप्सिन-ईडीटीए समाधान और 37 सी पर इनक्यूबेट के साथ कोशिकाओं का इलाज करें। DMEM/F12 मध्यम जोड़ने के बाद, एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा । पांच मिनट के लिए 1000 आरपीएम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें।सुपरनेट को निकालें और अंतिम वांछित कोशिका एकाग्रता को दोगुना करने के लिए हेपेस बफर खारा में गोली को फिर से निलंबित करें। एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में, 2% वजन और मात्रा एल्गिनेट समाधान में वांछित सेल एकाग्रता वाले अंतिम निलंबन प्राप्त करने के लिए 4% वजन और वॉल्यूम एल्गिनेट समाधान के साथ एक से एक अनुपात में इस सेल निलंबन को मिलाएं। एनकैप्सुलेशन पैरामीटर सेट करने के लिए, एनकैप्सुलेटर मशीन की गति को अधिकतम एक्सट्रूज़न गति तक सेट करें, और फिर वोल्टेज और आवृत्ति सेट करें।माइक्रोमोतियों को गढ़ने के लिए, 20 मिलीलीटर सिरिंज में, सेल-एल्गिनेट निलंबन के पांच मिलीलीटर लोड करें और एनकैप्सुलेटर को एक सिरिंज संलग्न करें। एनकैप्सुलेटर शुरू करने के लिए, प्रवाह को सक्रिय करें जो फीडर के माध्यम से सेल-एल्गिनेट निलंबन को धक्का देगा, और बूंदों की एक धारा को नोजल के माध्यम से निकाला जाएगा। प्रारंभिक गैर वर्दी धारा से बचने के लिए अपशिष्ट बीकर में पहला एक मिलीलीटर ले लीजिए।फिर शेष चार मिलीलीटर चलाना जारी रखें जिससे बूंदों को कैल्शियम क्लोराइड जेलेशन बाथ में गिरने की अनुमति मिले। जेलेशन बाथ के संपर्क में रहने पर, बूंदों में एल्गिनेट तुरंत जेलेशन बाथ में कैल्शियम आयनों के साथ क्रॉस-लिंक होता है, जिससे गोलाकार माइक्रोमोतियों का गठन होता है। एक मिनट के बाद, चुंबकीय मंच से जेलेशन बीकर को हटा दें और माइक्रोमोतियों को कमरे के तापमान पर अपने जेलेशन को पूरा करने के लिए आंदोलन के बिना एक और चार मिनट तक आराम करने की अनुमति दें।माइक्रोमोतियों को पुनः प्राप्त करने के लिए, पहले किसी भी बड़े एल्गिनेट मलबे या कलाकृतियों को हटाने के लिए बाँझ चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करें। प्लास्टिक पिपेट के अंत को काटने के बाद, इसका उपयोग माइक्रोमोतियों को जेलेशन बाथ से अपशिष्ट बीकर पर आयोजित 74 माइक्रोमीटर मेश फिल्टर में स्थानांतरित करने के लिए करें। सफलता सुनिश्चित करने के लिए, हम हमेशा माइक्रोमोतियों को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए एक प्लास्टिक पिपेट के अंत में कटौती करते हैं और हम हर बार जब हम एनकैप्सुलेशन के बाद एक पोत से दूसरे में मोती स्थानांतरित करते हैं।एक अपकेंद्रित्र ट्यूब पर जाल फिल्टर उलटा। इस पर उपयुक्त संस्कृति माध्यम पिपेट करने के लिए ट्यूब के नीचे मोती धोने और उन्हें पांच मिनट के लिए उस माध्यम में संतुलन करने के लिए अनुमति देते हैं । फिर उन्हें पहले इनक्यूबेशन और आगे के प्रयोगों के लिए उपयुक्त माध्यम से भरे हुए फ्लास्क में स्थानांतरित करें।एनकैप्सुलेशन और संस्कृति के बाद कोशिका व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए, माइक्रोमोतियों को धीरे-धीरे बाधित करने और एनकैप्सुलेटेड कोशिकाओं को छोड़ने के लिए विघटन मिश्रण जोड़ें। एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को इनक्यूबेट कोमल आंदोलन के साथ 10 मिनट के लिए ३७ सी पर 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ पूरक । इन कोशिकाओं की कोशिका व्यवहार्यता का अनुमान लगाना उन्हें ट्राइपैन ब्लू के साथ धुंधला करके और एक हीमोसाइटोमीटर कक्ष का उपयोग करके।माइक्रोमोतियों की स्थिरता का आकलन करने के लिए, माइक्रोस्कोप और इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एक समय पाठ्यक्रम में प्रत्येक माइक्रोबीड आबादी से एक नमूने के लिए औसत व्यास को मापें। तैयारी के बाद, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके एक समान और गोलाकार एल्गिनेट माइक्रोमोतियों को सफलतापूर्वक उत्पन्न किया गया था। मानक कोशिका संस्कृति की स्थिति में एक दिन के बाद, समझाया 7PA2 कोशिकाओं को समान रूप से माइक्रोमोतियों में वितरित किया गया ।जब 7PA2 सेल प्रसार एक MTS परख का उपयोग कर परीक्षण किया गया था, वहां 7PA2 कोशिकाओं के व्यवहार के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर के साथ या एक सात दिन की अवधि में एल्गिनेट के बिना हो गया था । वातानुकूलित मीडिया 7PA2 कोशिकाओं के 2D और 3 डी संस्कृतियों से विश्लेषण दोनों संस्कृतियों में एमिलॉयड-बीटा 1-42 के स्तर में लगातार वृद्धि का पता चला । माइक्रोमोतियों, या 3 डी संस्कृति से एमिलॉयड-बीटा 1-42 की रिहाई की दर, प्रोफाइल में 2डी संस्कृति से जारी समान है।7PA2 कोशिकाओं एल्गिनेट माइक्रोमोतियों में समझाया प्रभावी ढंग से एमिलॉयड-बीटा की निरंतर रिहाई के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । चूहे के मस्तिष्क में engraftment के लिए माइक्रोमोतियों को एक बड़े घाव बनाने के बिना एम्बेडेड होने के लिए काफी छोटा होना चाहिए। वीवो उद्देश्यों में मस्तिष्क के भीतर एक मिलीमीटर-स्केलेड मनका प्रत्यारोपित करना काम नहीं करेगा, जबकि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके गढ़े गए एक माइक्रोमोतियों में चूहे के हिप्पोकैम्पस के भीतर सम्मिलन के लिए उपयुक्त आकार है।यह सुनिश्चित करने के लिए कि हमें अंतिम उत्पाद में कोशिकाओं का एक भी वितरण मिला है, सेल एल्गिनेट निलंबन में कोशिकाओं को अच्छी तरह से मिलाना महत्वपूर्ण है, और यह प्रत्येक माइक्रोमोतियों से एमिलॉयड की एक समान रिहाई की गारंटी देता है।

Research

JoVE Journal

Biology

Fabrication of Amyloid-&#946;-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.

Gibberella zeae Ascospore माइक्रोएरे प्रयोगों के लिए उत्पादन और संग्रह.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

के गुणात्मक विश्लेषण के लिए एक विधि चूहा में चलना के रूप में Rotorod का प्रयोग

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication

चिरकारी के लिए लघु ड्राइव सरणी Vivo में रिकॉर्डिंग: ड्राइव निर्माण

Chronic recording of large populations of neurons is a valuable technique for studying the function of neuronal circuits in awake behaving rats. ...

The use of Biofeedback in Clinical Virtual Reality: The INTREPID Project

नैदानिक ​​आभासी वास्तविकता में Biofeedback का उपयोग: निडर परियोजना

Generalized anxiety disorder (GAD) is a psychiatric disorder characterized by a constant and unspecific anxiety that interferes with daily-life ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Ribosome बाध्य नवजात polypeptides का अलगाव<em&gt; इन विट्रो में</em&gt; MRNA के साथ translational रोकें ब्लॉग की पहचान के लिए

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

SECM गिरफ्तार अनुक्रम एक ribosome बाध्य polypeptides पृथक उपकरण के रूप में का उपयोग

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

निर्माण और microenvironment प्रोटीन के उपयोग (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

नियमित और एक Zebrafish की देखभाल और रखरखाव (<em&gt; Danio rerio</emएक परिचय:&gt;) प्रयोगशाला

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

माइक्रोबियल सिस्टम्स बायोलॉजी में Chemostats का प्रयोग करें

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

पोर्सिन ओसाइट एनकैप्सुलेशन के लिए प्रोटियोलिटीली अवक्रमित एल्गिनेट हाइड्रोगेल्स और हाइड्रोफोबिक माइक्रोबायोरेक्टर

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of ...