Name: fabrication of amyloid-&#946;-secreting alginate microbeads for use in modelling alzheimer's disease
Uploaded: 2019-07-06T12:30:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Amyloid-ÃŽÂ²-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить г-на Кажена Суреспарана, д-ра Джонатана Вубету, г-на Доминика Грудзински, г-на Чэнь Чжао и д-ра Тьерри Пилота за их помощь в оптимизации производства альгината микробов, клеточной культуры и обнаружения АЗ, а также полезных научных Обсуждения.

1. Подготовка
<ol><li>Приготовьте 100 мл альгинатного акционерного раствора на 4% (w/v).<ol>
<li>Взвесить 4,4 г альгинатной соли натрия и добавить сухой порошок в 100 мл солевого раствора HEPES (HBS, 20 мМ HEPES (0,477 г) с 150 мм NaCl (0,877 г) в деионизированной воде, позволяющей гидратации.</li>
		<li>Используйте магнитный мешалку на 500 оборотов в минуту (об/ ч) и нагревайте до 50 градусов по Цельсию, чтобы обеспечить полное альгинатное увлажнение. ПРИМЕЧАНИЕ: Альгинат может потребоваться один или два часа, чтобы быть полностью гидратированных. Чтобы сэкономить время, альгинатное решение можно сделать за день до протокола инкапсуляции и хранить при 4 градусах Цельсия до следующего дня. Когда альгинат был охлажден, тепло мягко до 37 градусов по Цельсию с помощью водяной ванны или горячей пластины и агитировать с магнитным мешалкой непосредственно перед использованием.</li>
		<li>Стерильный фильтр альгината раствора с помощью 0,22 мкм поры политетерсульфона (PES) фильтр перед использованием. Фильтрация рекомендуется при 37 градусах Цельсия, чтобы обеспечить легкий поток альгината. Вязкость увеличится, если температура может снизиться.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Подготовка 1000 мл 0,5 М CaCl2.<ol>
<li>Взвесить 55,49 г ангидроусов огороженного CaCl2 и растворить в 1000 мл HBS (20 мМ HEPES и 150 мм NaCl в 1000 мл деионизированной воды).</li>
		<li>Стерильный фильтр с использованием 0,22 мкм поры PES фильтр.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Приготовьте смесь растворения на 100 мл.<ol>
<li>Приготовьте раствор 100 мМ HEPES (23,83 г) и 500 мМ трехнадосоем цитрат агидрат (147,05 г) в фосфатно-буферном солине.</li>
		<li>Отрегулируйте к pH 7.4 используя NaOH или HCl.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Настройка системы инкапсуляции
<ol><li>Очистите ламинарный капот потока.<ol>
<li>Стерилизовать ламинарный капот потока, содержащего энкапселятор с помощью УФ-облучения с последующим распылением с 70% v/v этанола раствор.</li>
		<li>Промыть систему энкапселятора 10 мл 70% v/v этанола раствор а затем 10 мл стерильной деионизированной воды.</li>
		<li>Прикрепите сопло 300 мкм и повторите шаг 2.1.2.</li>
		<li>Спрей бутылку, содержащую фильтрованный раствор альгината, бутылку, содержащую фильтрованный раствор хлорида кальция и любые инструменты, оборудование и пустые культурные пластины, которые будут использоваться с 70% v/v этанол раствор и поместить их в ламинарный капот потока. Перед использованием, включите ультрафиолетовый свет снова в течение 30 минут, чтобы тщательно стерилизовать.</li>
		<li>Подготовьте мусорный стакан, наполненный дезинфицирующим раствором биологического класса, и поместите стакан в капот.</li>
		<li>Заполните стакан 100 мл стерильного раствора CaCl2 (aqueous) и добавьте в магнитный мешалку. Установите скорость перемешивания до 100 об/мин. Поместите стакан на магнитную платформу на высоте 18 см от кончика сопла. Этот стакан будет использоваться для сбора альгината бусин и позволяют их гелирования.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Подготовка клеток к инкапсуляции.<ol>
<li>Удалить клетки из инкубатора и отсоединить от почти сольственной колбы с помощью 0,25% трипсин-EDTA раствор и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 5-10 мин.</li>
		<li>Изолировать образец для оценки плотности клеток, а затем центрифуги оставшиеся клетки на 1000 об/ ч в течение 5 минут, чтобы получить клеточной гранулы.</li>
		<li>Приостановите действие гранул в HBS (20 мм HEPES и 150 мм NaCl) для удвоения конечной желаемой концентрации клеток (например, для конечной концентрации 1,5 х 106 ячеек/мл, повторное приостановление клеток в HBS для достижения концентрации 3 х 106 ячеек/мл).</li>
		<li>В 50 мл центрифуги трубки, смешать клеточной подвески в соотношении 1:1 с 4% (w/v) альгинат решение для получения окончательной подвески, содержащей желаемую концентрацию клеток (например, 1,5 х 106 клеток / мл) в 2% (w/v) альгинативный раствор.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Установите параметры инкапсуляции.<ol>
<li>Установите скорость машины-энкапселя до максимальной скорости экструзии (8,9 мл/мин), напряжение до 1,0 кВ и частоту до 5500 Гц. ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры были ранее оптимизированы для получения микробусов диаметром 550 мкм.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Изготовление
<ol><li>Изготовить микробусы.<ol>
<li>В шприцу объемом 20 мл загрузите 5 мл клеточной подвески и прикрепите шприц к энкапсулятору.</li>
		<li>Запустите инкапсулятор, активируя поток, который будет толкать клеточной суспензии через фидер. Поток капель будет экструдирован через сопло.</li>
		<li>Соберите первый 1 мл в стакане отходов, чтобы аннулировать первоначальный неравномерный поток.</li>
		<li>Продолжайте запускать оставшиеся 4 мл, позволяя каплям попадать в ванну для геля CaCl 2. Каждый миллилитр можно запустить отдельно (но последовательно) и собирать в четырех различных ваннах геля, если это необходимо. ПРИМЕЧАНИЕ: При контакте с гельационной ванной, альгинат в каплях мгновенно перекрестно сионные с ионами кальция в гельационной ванне и образуют сферические микробусы.</li>
		<li>Через минуту снимите шарик геля с магнитной платформы и дайте микробусам сидеть еще 4 минуты без возбуждения (время необходимо для полного гелирования через микробусы при комнатной температуре).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Извлекайете микробусы.<ol>
<li>Удалите любой большой альгинат мусора или артефактов с помощью пары стерильных пинцета, а затем использовать стерильный пластиковый пипетка для передачи в 74 мкм сетчатый фильтр для извлечения микробусов из гельатальной ванны.</li>
		<li>Перенесите микробусы в центрифужную трубку с использованием соответствующей культуры среды и дайте уравновесить в течение 5 минут в среде клеточной культуры.</li>
		<li>Передача в колбу, тарелку или чашку Петри для инкубации и дальнейших экспериментов. ПРИМЕЧАНИЕ: Геляционная ванна не должна использоваться повторно.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Тестирование и использование микробусов
<ol><li>Тест микробида качества.<ol>
<li>Чтобы оценить жизнеспособность клеток (или других биологических считываний) после инкапсуляции и культуры, осторожно нарушить microbeads освободить инкапсулированных клеток с помощью растворения смеси. ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимый объем смеси растворения зависит от количества микробусов, используемых в тесте. Предлагаемый рацион составляет 4 мл растворения смеси на каждые 1 мл инкапсулированных клеток. Этот шаг должен быть выполнен только на одной выборке сюда каждой популяции микробов.</li>
		<li>Инкубировать клетки в инкубаторе клеточной культуры дополняется 5% CO2 при 37 градусах по Цельсию в течение 10 мин.</li>
		<li>Оцените жизнеспособность клеток в настоящее время в растворе, как обычно, окрашивая клетки с трипан синим и с помощью гемоситометра камеры. ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании автоматизированных счетчиков клеток для оценки жизнеспособности клеток следует соблюдать осторожность, чтобы избежать альгината артефактов, мешающих подсчетам. В этих случаях рекомендуется подсчет налальных ячеек.</li>
		<li>Для оценки устойчивости микробусов измерьте средний диаметр выборки от каждой популяции микробидов в течение времени с помощью микроскопа и программного обеспечения для визуализации. Резкие последующие колебания в диаметре могут свидетельствовать о деградации альгината.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Используйте микрошарики для обнаружения секретированных АЗ.<ol>
<li>Образец среды культуры клеток из 7PA2 ячеек культивируется в стандартных условиях (2D) с интервалом 24 ч и хранить при -20 градусов по Цельсию для дальнейшего анализа.</li>
		<li>Образец среды культуры клеток из инкапсулированных 7PA2 ячеек культивируется в стандартных условиях (3D) с интервалом 24 ч и хранится при -20 градусов по Цельсию для дальнейшего анализа.</li>
		<li>Обнаружить секрецию АЗ из 7PA2 клеток в собранные условные носители с помощью фермент-связанных иммуносорбентных анализ (ELISA) (Рисунок 4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Используйте микробусы для дальнейшего изучения в соответствующих приложениях. ПРИМЕЧАНИЕ: Инкапсулированные 7PA2 клетки могут быть использованы для оценки воздействия устойчивого секреции АЗ в любой или модели.<ol>
<li>Для микробов прививок внутри гиппокампа крысы в мозге, генерировать 1 мм толщиной корональных участков мозга крысы и использовать хирургические инструменты для вставки микробусов в нужную область (Рисунок 5).</li>
		<li>Инкапсулировать различные типы клеток в альгината микробусы после описанных протоколов для оценки устойчивого выпуска биомолекул, представляющих интерес. Соответствующие системы in vitro и in vivo могут быть дополнительно смоделированы.</li>
		<li>Обнаружить экспрессию мембранных маркеров инкапсулированных клеток с помощью цитометрии потока и/или иммунофлуоресценции. ПРИМЕЧАНИЕ: Пример использования аналогичного метода для изготовления микробусов моделирования ранних стадиях роста опухолевой массы и экспрессии биомаркеров описывается Риос 20.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hardy, J. A., Higgins, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease:+the+amyloid+cascade+hypothesis.">Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis.</a> Science. 256, 184-185 (1992).</li><li>Karthick, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+effect+of+oligomeric+amyloid-&#946;+(1-42)-induced+hippocampal+neurodegeneration+in+rat+model+of+Alzheimer's+disease.">Time-dependent effect of oligomeric amyloid-&#946; (1-42)-induced hippocampal neurodegeneration in rat model of Alzheimer's disease.</a> Neurological Research. 41 (2), 139-150 (2018).</li><li>Watremez, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilized+Low-n+Amyloid-&#946;+Oligomers+Induce+Robust+Novel+Object+Recognition+Deficits+Associated+with+Inflammatory,+Synaptic,+and+GABAergic+Dysfunction+in+the+Rat.">Stabilized Low-n Amyloid-&#946; Oligomers Induce Robust Novel Object Recognition Deficits Associated with Inflammatory, Synaptic, and GABAergic Dysfunction in the Rat.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 62 (1), 213-226 (2018).</li><li>Brouillette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotoxicity+and+memory+deficits+induced+by+soluble+low-molecular-weight+amyloid-&#946;1-42+oligomers+are+revealed+in+vivo+by+using+a+novel+animal+model.">Neurotoxicity and memory deficits induced by soluble low-molecular-weight amyloid-&#946;1-42 oligomers are revealed in vivo by using a novel animal model.</a> Journal of Neurosciences. 32 (23), 7852-7861 (2012).</li><li>Solana, C., Tarazona, R., Solana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosenescence+of+Natural+Killer+Cells,+Inflammation,+and+Alzheimer's+Disease.">Immunosenescence of Natural Killer Cells, Inflammation, and Alzheimer's Disease.</a> International Journal of Alzheimer's Disease. , 3128758 (2018).</li><li>Sturchler-Pierrat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+amyloid+precursor+protein+transgenic+mouse+models+with+Alzheimer+disease-like+pathology.">Two amyloid precursor protein transgenic mouse models with Alzheimer disease-like pathology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (24), 13287-13292 (1997).</li><li>Tomiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+amyloid+beta+oligomers:+their+contribution+to+synaptic+alteration,+abnormal+tau+phosphorylation,+glial+activation,+and+neuronal+loss+in+vivo.">A mouse model of amyloid beta oligomers: their contribution to synaptic alteration, abnormal tau phosphorylation, glial activation, and neuronal loss in vivo.</a> Journal of Neurosciences. 30 (14), 4845-4856 (2010).</li><li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+App+knock-in+mouse+models+of+Alzheimer's+disease.">Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease.</a> Nature Neurosciences. 17 (5), 661-663 (2014).</li><li>Oddo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-Transgenic+Model+of+Alzheimer's+Disease+with+Plaques+and+Tangles:+Intracellular+A+and+Synaptic+Dysfunction.">Triple-Transgenic Model of Alzheimer's Disease with Plaques and Tangles: Intracellular A and Synaptic Dysfunction.</a> Neuron. 39 (3), 409-421 (2003).</li><li>Leon, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Transgenic+Rat+Model+with+a+Full+Alzheimer's-Like+Amyloid+Pathology+Displays+Pre-Plaque+Intracellular+Amyloid-&#946;-Associated+Cognitive+Impairment.">A Novel Transgenic Rat Model with a Full Alzheimer's-Like Amyloid Pathology Displays Pre-Plaque Intracellular Amyloid-&#946;-Associated Cognitive Impairment.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 20 (1), 113-126 (2010).</li><li>Prince, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dementia+UK:+Second+Edition+-+Overview.">Dementia UK: Second Edition - Overview.</a> Alzheimer's Society. , 61 (2007).</li><li>Cavanaugh, S. E., Pippin, J. J., Barnard, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Alzheimer+disease:+historical+pitfalls+and+a+path+forward.">Animal models of Alzheimer disease: historical pitfalls and a path forward.</a> Alternatives to animal experimentation. 31 (3), 279-302 (2014).</li><li>Oakley, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraneuronal+&#946;-Amyloid+Aggregates,+Neurodegeneration,+and+Neuron+Loss+in+Transgenic+Mice+with+Five+Familial+Alzheimer's+Disease+Mutations:+Potential+Factors+in+Amyloid+Plaque+Formation.">Intraneuronal &#946;-Amyloid Aggregates, Neurodegeneration, and Neuron Loss in Transgenic Mice with Five Familial Alzheimer's Disease Mutations: Potential Factors in Amyloid Plaque Formation.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (40), 10129-10140 (2006).</li><li>Forny-Germano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+Disease-Like+Pathology+Induced+by+Amyloid-&#946;+Oligomers+in+Nonhuman+Primates.">Alzheimer's Disease-Like Pathology Induced by Amyloid-&#946; Oligomers in Nonhuman Primates.</a> Journal of Neuroscience. 34 (41), 13629-13643 (2014).</li><li>Masliah, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+expression+of+synaptic+proteins+occurs+early+during+progression+of+Alzheimer's+disease.">Altered expression of synaptic proteins occurs early during progression of Alzheimer's disease.</a> Neurology. 56 (1), 127-129 (2001).</li><li>Lepelletier, F. X., Mann, D. M. A., Robinson, A. C., Pinteaux, E., Boutin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+changes+in+extracellular+matrix+in+Alzheimer's+disease.">Early changes in extracellular matrix in Alzheimer's disease.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (2), 167-182 (2017).</li><li>Calafiore, R., Basta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+application+of+microencapsulated+islets:+Actual+prospectives+on+progress+and+challenges.">Clinical application of microencapsulated islets: Actual prospectives on progress and challenges.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 67-68, 84-92 (2014).</li><li>Lim, F., Sun, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microencapsulated+islets+as+bioartificial+endocrine+pancreas.">Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas.</a> Science. 210 (4472), 908-910 (1980).</li><li>Tran, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+hydrogel+protects+encapsulated+hepatic+HuH-7+cells+against+hepatitis+C+virus+and+other+viral+infections.">Alginate hydrogel protects encapsulated hepatic HuH-7 cells against hepatitis C virus and other viral infections.</a> PLoS One. 9 (10), 109969 (2014).</li><li>Rios de la Rosa, J. M., Wubetu, J., Tirelli, N., Tirella, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorectal+tumor+3D+in+vitro+models:+advantages+of+biofabrication+for+the+recapitulation+of+early+stages+of+tumour+development.">Colorectal tumor 3D in vitro models: advantages of biofabrication for the recapitulation of early stages of tumour development.</a> Biomedical Physics &amp; Engineering Express. 4 (4), 045010 (2018).</li><li>Tirella, A., Orsini, A., Vozzi, G., Ahluwalia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+diagram+for+microfabrication+of+geometrically+controlled+hydrogel+scaffolds.">A phase diagram for microfabrication of geometrically controlled hydrogel scaffolds.</a> Biofabrication. 1 (4), 045002 (2009).</li><li>Smalley, K. S. M., Lioni, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+ins't+flat:+Taking+cancer+biology+to+the+next+dimension.">Life ins't flat: Taking cancer biology to the next dimension.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 42 (8-9), 242-247 (2006).</li><li>Podlisny, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+secreted+amyloid+beta-protein+into+sodium+dodecyl+sulfate-stable+oligomers+in+cell+culture.">Aggregation of secreted amyloid beta-protein into sodium dodecyl sulfate-stable oligomers in cell culture.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (16), 9564-9570 (1995).</li><li>Portelius, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+characterization+of+amyloid-&#946;+species+in+the+7PA2+cell+model+of+Alzheimer's+disease.">Mass spectrometric characterization of amyloid-&#946; species in the 7PA2 cell model of Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 33 (1), 85-93 (2013).</li><li>Welzel, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+amyloid+&#946;-proteins+in+a+cell+culture+model+include+N-terminally+extended+peptides+that+impair+synaptic+plasticity.">Secreted amyloid &#946;-proteins in a cell culture model include N-terminally extended peptides that impair synaptic plasticity.</a> Biochemistry. 53 (24), 3908-3921 (2014).</li><li>O'Hare, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orally+bioavailable+small+molecule+drug+protects+memory+in+Alzheimer's+disease+models.">Orally bioavailable small molecule drug protects memory in Alzheimer's disease models.</a> Neurobiology of Aging. 34 (4), 1116-1125 (2013).</li><li>Nedovi&#263;, V., Willaert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+Cell+Immobilisation+Biotechnology.">Fundamentals of Cell Immobilisation Biotechnology.</a> Methods and Technologies for Cell Immobilisation/Encapsulation. , 185-204 (2004).</li><li>Omer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+Normoglycemia+in+Rats+Receiving+Transplants+with+Encapsulated+Islets.">Long-term Normoglycemia in Rats Receiving Transplants with Encapsulated Islets.</a> Transplantation. 79 (1), 52-58 (2005).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Метод, изложенный в этой статье, полезен для инкапсуляции клеток, достигающих узкого распределения размеров альгинатных микробусов27. Это также дает преимущество выращивания клеток в иммуноизолированной среде17,19, защищая их от внешнего стресса. Кроме того, инкапсуляция клеток в альгинате более точно имитирует физиологические условия, особенно в отношении клеточных взаимодействий и матричной жесткости20. Все эти факторы имеют особенно важное значение для последующего использования в соответствующих приложениях, таких как in vivo engraftment, исключая потенциальные иммунные реакции в окружающих тканях17. Кроме того, основным преимуществом этого протокола является легкая настройка в зависимости от приложения интереса: можно изменить протокол и оптимизировать параметры для изготовления больших или меньших, а также более мягкую или жесткую бусинку. Описанный метод используется для изготовления бисера достаточно мал, чтобы быть введены с минимально инвазивных методов, и достаточно большой, чтобы разместить ряд клеток и обеспечить достаточное освобождение АЗ, чтобы привести к наблюдаемым поведенческих и патологических эффектов при инъекциях в животных моделях.
Успех этого протокола зависит от ряда важных шагов. Тщательная обработка клеток и оптимальные методы культивирования клеток важны для поддержания жизнеспособности клеток и функции20,28. Использование стандартных условий культуры обеспечивает сохранение нормальной функции 7PA2 клеток, как наблюдается. Это позволяет получить аналогичный профиль выпуска для АЗ1-42 из инкапсулированных ячеек по сравнению с 2D культурами. Кроме того, для оптимальной работы протокола, раствор с низкой вязкостью гарантирует лучшие результаты по сравнению с высоковязким альгинативным раствором. Это гарантирует, что однородная ламинальная струя выдавливается через сопло и равномерное распределение клеток в матрице сфабрикованных бусин27. Материалы, используемые для инкапсулирования клеток, должны иметь очень быстрый механизм гелирования, позволяющий удерживать форму.
Другим важным шагом в этом протоколе является обработка изготовленных микробусов после гелирования. Здесь мы показываем извлечения микробусов с помощью большой проемной пластиковой пипетки для передачи бисера. Кроме того, заливка раствора хлорида кальция, содержащего микробусы, в сетчатый фильтр может быть использован адля бисера. Для составления микробусов можно использовать серологическую пипетку (5, 10 или 25 мл), а затем промывать через сетчатый фильтр вместо заливки. Преимуществом этого является более высокая уверенность в бесплодии процедуры по сравнению с заливкой. Тем не менее, ограничения заключается в том, что некоторые бусы могут быть искажены, если они сжаты пипеткой, в дополнение к рискуя более низкой урожайности, если большая часть микробусов не спасены.
Этот подход был использован для инкапсулирования различных клеточных линий для моделирования и изучения различных заболеваний (например, высвобождение инсулина из инкапсуляционного поджелудочного газлета). Новизной нашего подхода является прививка микробусов, генерируемых с помощью этого протокола в качестве полезного метода в моделировании важных аспектов болезни Альцгеймера in vivo. При сравнении профиля выпуска АЗ из инкапсулированных клеток(Рисунок4) с уровнями АЗ, генерируемых инъекцией болуса (например, о том, что сообщалось в других исследованиях3,26), более хроническим и устойчивым высвобождение АЗ может быть Ожидал. Рисунок 6 иллюстрирует прогнозируемую тенденцию, которая может быть достигнута. Использование этой системы для моделирования in vivo более актуально для того, как болезнь прогрессирует и может быть более полезным в открытии и разработке лекарств.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig6.jpg"> Рисунок 6 : Прогнозируемый профиль выпуска АЗ1-42 из инкапсулированных 7PA2 клеток по сравнению с инъекцией болюса. Профиль выпуска АЗ из привязатых 7PA2-содержащих микробусов позволяет проверить воздействие хронических и устойчивых АЗ в животной модели, относящих ся. И наоборот, инъекция болуса создаст всплеск уровня АЗ в течение короткого периода времени, а затем быстрое обезвреживание АЗ от мозга. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:848px;" width="847">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">&#181;Manager software</td>
			<td style="width:261px;">Vale Lab, UCSF, USA</td>
			<td style="width:100px;">v.1.46</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">0.22 um PES filter</td>
			<td style="width:261px;">Merck, UK</td>
			<td style="width:100px;">SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">15mm Netwell insert 74 um mesh filter</td>
			<td style="width:261px;">Constar, usa</td>
			<td style="width:100px;">#3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Alginic acid sodium salt from brown algae</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td style="width:100px;">A0682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td style="width:100px;">C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:341px;">CellTiter96&#160; AQueous One Solution cell proliferation assay</td>
			<td style="width:261px;">Promega, USA</td>
			<td style="width:100px;">G3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Encapsulator</td>
			<td style="width:261px;">Inotech</td>
			<td style="width:100px;">IE-50</td>
			<td>serial no. 05.002.01-2005</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">HEPES</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td style="width:100px;">H4024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Hu A&#946; 1-42 ELISA</td>
			<td style="width:261px;">ThermoFisher, UK</td>
			<td style="width:100px;">KHB3441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:261px;">ImageJ</td>
			<td style="width:100px;">v1.49p</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Inverted light microscope</td>
			<td style="width:261px;">Olympus</td>
			<td style="width:100px;">CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Leica microscope</td>
			<td style="width:261px;">Leica microsystems, UK</td>
			<td style="width:100px;">DMI6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Neo sCMOS Camera</td>
			<td style="width:261px;">Ander, UK</td>
			<td align="right" style="width:100px;">5.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td style="width:100px;">D1408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td align="right" style="width:100px;">433209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Trispdium citrate dihydrate</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td style="width:100px;">W302600-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td style="width:100px;">T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of amyloid-&#946;-secreting alginate microbeads for use in modelling alzheimer's disease

Согласно гипотезе амилоидного каскада, самым ранним триггером в развитии болезни Альцгеймера (АД) является накопление токсичных фрагментов амилоида-з, что в конечном итоге приводит к классическим особенностям болезни: амилоидные бляшки, нейрофибрилларные клубки и синаптические и нейрональные потери. Отсутствие соответствующих нетрансгенных доклинических моделей, отражающих прогрессирование заболевания, является одним из основных факторов, препятствующих открытию эффективных лекарственных препаратов. С этой целью мы разработали протокол для изготовления альгинатных микробусов, содержащих амилоидно-секретные клетки, полезные для изучения последствий хронического производства АЗ.
Китайский хомяк клетки яичников ранее трансфицировали с человеческим геном APP, выделяя АЗ (т.е., 7PA2 клеток), были использованы в этом исследовании. Трехмерная (3D) модель in vitro для устойчивого высвобождения АЗ была изготовлена путем инкапсуляции 7PA2 клеток в альгинате. Этот процесс был оптимизирован для целевой диаметра биса 500-600 мкм для дальнейших исследований in vivo. Оптимизация инкапсуляции клеток 7PA2 в альгинате была проведена изменяя параметры изготовления, например, концентрацию альгината, скорость потока геля, электростатический потенциал, частота вибрации головы, раствор гелеобразования. Уровни секретируемых АЗ были проанализированы с течением времени и сопоставлены между альгинатными бусинами и стандартными методами клеточной культуры (до 96 ч).
Было установлено, что концентрация 1,5 х 106 7PA2 клеток/мл и концентрация альгината 2% (w/v) буферизированы с HEPES и последующее гелирование в 0,5 М хлорида кальция в течение 5 минут. Изготовленные микробусы были 1) равномерного размера, 2) со средним диаметром 550 мкм, 3), содержащий около 100-150 клеток на микробус и 4), способных выделять АЗ.
В заключение, наш оптимизированный метод для производства стабильных альгинатных микробусов, содержащих амилоидные клетки 7PA2, может позволить моделирование важных аспектов АД как in vitro, так и in vivo.

Клетки 7PA2 успешно инкапсулированы в альгинатные микробусы После приготовления с помощью этого протокола успешно генерируются однородные и сферические альгинатные микробусы. Изображения на рисунке 2А ниже демонстрируют пример того, как изменение одного из параметров (т.е. напряжения) изменяет поток и дисперсию потока альгината. Рисунок 2 B показывает пример полученных альгинатных бусин сразу после процесса гелирования.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig2.jpg"> Рисунок 2 : Оптимизация метода изготовления. (A) Фотографии, показывающие изменения в дисперсии потока. (B) Ярко-поле изображение, показывающее альгинатные сферические микробусы сразу после изготовления. (C) Пример шага оптимизации: настройка выбранных параметров изготовления для достижения целевого размера микробида. Выбранные графики, чтобы проиллюстрировать взаимосвязь между каждым параметром и размером резцирующихся микробусов (распределение размера по крайней мере n и 100 микробусов). Обратите внимание, что насадка внутреннего диаметра, вязкость выброшенного раствора и условия гелевания также могут влиять на размер изготовленных бусин. Бары ошибок представляют S.D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Описанный протокол является гибким и позволяет изготавливать различные размеры альгинатных микробусов, изменяющихся по составу в зависимости от применения. На рисунке 2C, мы сообщаем о влиянии альгината скорость потока, напряжения и частоты на размер микробида с помощью 2% (w/v) альгината раствора в HEPES (pH 7.2) экструдированный через сопло 300 мкм.
Поскольку область применения этого исследования заключалась в производстве микробусов, которые могут быть встроены в мозг крысы, мы скорректировали параметры изготовления, чтобы получить средний диаметр микробуса в диапазоне 500-600 мкм. Для целей контроля качества метод был оптимизирован, чтобы иметь минимальную изменчивость среди популяции сфабрикованных бусин (т.е. узкое распределение размеров). Пожалуйста, обратите внимание, что (1) произведенные бусы могут быть введены в мозг крысы с помощью шприца Гамильтон оснащен 20G иглы; и (2) одно полушарие мозга крысы может вместить до двух или трех бусин такого размера.
После оптимизации инкапсуляция 7PA2 клеток в концентрации 1,5 х 106 клеток/мл, взвешенных в 2% (w/v) альгинативном растворе, буферизированном с HEPES и сброшенной в ванне гелеобразования хлорида кальция 0,5 М, дала желаемые микробусы. Рисунок 3 Ниже показаны инкапсулированные 7PA2 клетки равномерно распределены в microbeads после одного дня в стандартных условиях культуры клетки. Пролиферация клеток 7PA2 была протестирована с использованием асссеа МТС в рамках протокола производителя. Не было существенной разницы между поведением клеток 7PA2, выращенных с альгинатом или без него в течение семидневного периода(рисунок 3B). При инкубации инкубированных клеток в стандартных условиях культуры, клетки, как ожидается, будет продолжать размножаться в течение всего эксперимента, и небольшие степени побега клеток можно ожидать, как в результате, как сообщается в других работах28. Эффекты этого могут быть смягчены путем инкапсулирования при меньшей плотности клеток или снижения концентрации сыворотки, в которой инкубируются микробусы.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig3.jpg"> Рисунок 3 : Инкапсулированные 7PA2 ячейки. (A) Ярко-поле изображение инкапсулированных 7PA2 клеток, показывающих равномерное распределение клеток по всей альгинатной микробад. Параметры изготовления были установлены для получения 150 7PA2 ячеек на бис. За 7 дней культуры не наблюдалось существенных изменений в альгинатных бусинах. (B) Не было отмечено разницы между общим распространением 7PA2 клеток, инкубированных с альгинатом против клеток, инкубированных без альгината. 7PA2 клетки растут и мигрируют по объему альгината шариков; снижение концентрации сыворотки можно считать замедлением роста клеток. Бары ошибок представляют S.D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Alginate microbeads инкапсуляции 7PA2 клетки стабильны с течением времени Для исследования размера и формы полученных альгинатных микробусов после изготовления и гелирования был проведен анализ микроскопа. Средний диаметр микробусов, полученных с помощью выбранного протокола, составляет 550 и 2 мкм.
Теоретически количество клеток, ожидаемых в микробане диаметром 550 мкм, можно рассчитать следующим образом:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597eq1.jpg">
где V и объем и радиус r. Объем одного микробида составляет 8,8 х 10-5 мл; Таким образом, количество клеток на микробус на момент инкапсуляции - 1,5 х 106) х (8,8 х 10-5) - 130 клеток.
Экспериментально мы подсчитали количество инкапсулированных ячеек сразу после изготовления. Alginate шарики были мягко нарушены с помощью растворения смеси и клетки были окрашены с трипан синий раствор. Оценка жизнеспособности и подсчет клеток проводилась с помощью гемоситометра; Полученные результаты показали, в среднем 116 и 17 живых клеток на микробус (n No 5, данные не сообщается). Как и ожидалось, незначительное различие между теоретическим и экспериментальным количеством клеток сразу же после инкапсуляции наблюдалось. Для некоторых приложений, и в частности для определения количества выпущенных АЗ с течением времени, важно предсказать количество клеток, инкапсулированных в каждом альгинатном бисяре.
Интересно, что процесс инкапсуляции не оказывает существенного влияния на жизнеспособность клеток. Результаты представлены в предыдущей работе, в которой колоректальные раковые клетки (т.е. HCT-116) были инкапсулированы с помощью аналогичного метода, без каких-либо различий в жизнеспособности клеток в альгинатиальных микробусов по сравнению с 2D-контролем20.
Для измерения стабильности альгината, используемого в процессе инкапсуляции, мы измерили диаметры микробов в течение 14-дневного периода (n no 100). Не было отмечено никаких изменений среднего диаметра через 14 дней после инкапсуляции по сравнению с сразу после инкапсуляции (данные не сообщаются).
Инкапсулированные 7PA2 ячейки высвобождают АЗ с течением времени Условные средства массовой информации, проанализированные из 2D и 3D культур 7PA2 клеток, показывают постоянное увеличение уровня АЗ1-42. Средства массовой информации клеточной культуры были отобраны каждые 24 ч и до четырех дней, и проанализированы с помощью ELISA. Наши данные показывают, что скорость высвобождения АЗ1-42 из микробусов (3D) аналогична по профилю, высвобожденного из 2D-культуры (рисунок 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig4.jpg"> Рисунок 4 : Коэффициент секрецииА1-42 из 7PA2 ячеек. (A) Выпуск АЗ (% нормализованный после 4 дней) от 2D и 3D in vitro модели имеет аналогичный профиль. Обе модели показывают постоянное увеличение уровня АЗ в течение четырехдневного периода, и, как ожидается, устойчивая концентрация не достигается. (B) Концентрация А1-42 нормализовалась к первоначальному номеру ячейки, показывая аналогичную секрецию АЗ1-42 с течением времени, независимо от методов культивирования. Ни наличие альгината, ни процесс инкапсуляции (3D-модель in vitro) не изменяют секрецию АЗ1-42. Бары ошибок представляют S.D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Потенциальное применение инкапсулированных 7PA2 ячеек Сообщаем, что 7PA2 клетки, инкапсулированные в альгинатных микробусах, могут эффективно использоваться для устойчивого высвобождения АЗ1-42,и, следовательно, использоваться для проверки влияния хронической секреции АЗ в любой доклинической модели. На рисунке 5 ниже мы показываем преимущества использования альгинатных микробусов, которые могут быть легко введены и расположены в мозгу крысы. Разделы Ex vivo здесь используются для иллюстраций, сравнивая миллиметровый альгинатный шарик и изготовленные альгинатные микробусы.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig5.jpg"> Рисунок 5 : Использование микробусов для соответствующих доклинических применений. Микробусы для прививки в мозг крысы должны быть достаточно малы, чтобы быть встроенным, не создавая поражения слишком велики, чтобы избежать повреждения мозга паренхимы и отрицательно влияет на нормальную функцию мозга. Изображение (A) показывает сравнение размера между миллиметровым масоном и бисом микрометрового масштаба бок о бок. (B) Имплантация миллиметрового масштаба бибы в головном мозге для in vivo целей не будет работать. Изображение (C) показывает микробус, изготовленный с помощью этого протокола. Размер подходит для вставки в гиппокамп крысы, не оказывая пагубного влияния на нормальную физиологию. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
На приведенных выше изображениях подчеркивается важность контроля размера микробуса для таких исследований. Здесь мы демонстрируем преимущество использования микробусов диаметром менее 600 мкм. Это позволяет использовать минимально инвазивные инъекции (например, шприц Гамильтона), чтобы лучше контролировать расположение инъекционных бусин в головном мозге.
Таким образом, инкапсуляция 7PA2 клеток дает контроль над размером микробусов, количество инкапсулированных клеток и предсказание АЗ выделяется из микробусов (например, концентрация, профиль выпуска). Контроль размера микробусов имеет важное значение по двум причинам: 1) для того, чтобы позволить точно настроить контроль над концентрацией выпущенных АЗ, и 2) для имплантации в контролируемой области мозга крысы. Полученные здесь результаты описывают поверхностную настройку альгинатных микробусов и подчеркивают потенциальные применения для дальнейших исследований.

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Amyloid-ÃŽÂ²-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease at JoVE.com

Fabrication of Amyloid-ÃƒÅ½Ã‚Â²-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

Изготовление амилоидных микробусов для использования в моделировании болезни Альцгеймера

Этот протокол иллюстрирует метод инкапсуляции клеток путем быстрого физического гелирования альгината для обездвиживания клеток. Полученные микробусы позволяют контролировать и устойчивое секрецию амилоида- q с течением времени и могут быть использованы для изучения эффектов секретированных амилоидов в in vitro и in vivo моделях.

According to the amyloid cascade hypothesis, the earliest trigger in the development of Alzheimer&#8217;s disease (AD) is the accumulation of toxic ...

Этот протокол объясняет изготовление микробусов, которые будут использоваться для контроля скорости выпуска и количество амилоидов, который является белок интереса. Микробусы будут обездвиживать клетки в подходящий биоматериал, и это укроет их от окружающей среды, а также позволяет им обмениваться побочными продуктами и питательными веществами с окружающей средой. Инкапсуляция клеток с помощью этого метода обеспечивает жесткий контроль размера микробусов, а также количества клеток, и мы делаем это, регулируя различные параметры изготовления.Таким образом, инкапсуляция клеток, описанных в этом протоколе, даст нам больше хронического высвобождения амилоидов для использования как в пробирке, так и в системах in vivo, и идея будет в том, что это даст нам лучшее понимание механизмов заболевания, а также позволит нам протестировать новые методы лечения. Этот метод может быть использован для формулирования контролируемой системы и изучения выпуска любых биомолекул для многих типов клеток, будь то в одиночку или в сочетании. Для начала удалите из инкубатора почти стеченную колбу.Лечить клетки с 0,25%трипсина-ЭДТА раствора и инкубировать при 37 C в течение пяти-десяти минут, чтобы отделить клетки. После добавления DMEM/F12 среды, собирать клетки в 50 миллилитров трубки. Центрифуга клетки при 1000 об/мин в течение пяти минут.Удалите супернатант и повторно приостановите гранулы в буферированном солевом растворе HEPES, чтобы удвоить окончательную желаемую концентрацию клеток. В 50 миллилитровой центрифуге трубки, смешать эту подвеску клетки в соотношении один к одному с 4%вес и объем альгинат решение для получения окончательной подвески, содержащей желаемую концентрацию клеток в 2%веса и объема альгината раствора. Чтобы установить параметры инкапсуляции, установите скорость инкапсуляторной машины до максимальной скорости экструзии, а затем установите напряжение и частоту.Для изготовления микробусов в шприце 20 миллилитров загрузите пять миллилитров клеточно-альгинатной подвески и прикрепите шприц к инкапсулятору. Чтобы начать инкапсулятор, активируйте поток, который будет толкать клеточно-альгинатную подвеску через кормушки, и поток капель будет выдавливаться через сопло. Соберите первый миллилитр в стакане отходов, чтобы избежать первоначального не однородного потока.Затем продолжайте запускать оставшиеся четыре миллилитров, позволяя каплям попасть в ванну гелиции хлорида кальция. При контакте с гелеобразной баней альгинат в каплях мгновенно пересекается с ионами кальция в гелеобразной ванне, образуя сферические микробусы. Через минуту снимите гелеобразный стакан с магнитной платформы и дайте микробусу отдохнуть еще четыре минуты без агитации, чтобы завершить их гелеобразование при комнатной температуре.Для извлечения микробусов сначала используйте пару стерильных пинцетов для удаления любых крупных альгинатных обломков или артефактов. После разрезания конца пластиковой пипетки, использовать его для передачи микробусов из гелеобразной ванны в 74 микрометровый фильтр сетки, удерживаемый над стаканом отходов. Чтобы обеспечить успех, мы всегда разрезаем конец пластиковой пипетки, чтобы избежать повреждения микробусов, и мы делаем это каждый раз, когда мы переаднося бисер из одного сосуда в другой после инкапсуляции.Переверните сетчатый фильтр над центрифугой трубки. Pipette соответствующей среде культуры над ним, чтобы вымыть бисер вниз трубку и дать им равновесный в этой среде в течение пяти минут. Затем перенесите их в колбу, ранее заполненную соответствующей средой для инкубации и дальнейших экспериментов.Чтобы оценить жизнеспособность клеток после инкапсуляции и культуры, добавьте растворение смеси, чтобы мягко нарушить микробусы и освободить инкапсулированные клетки. Инкубировать клетки в инкубаторе клеточной культуры, дополненном 5%-ным углекислым газом при 37 С в течение 10 минут с нежным возбуждением. Оцените жизнеспособность клеток этих клеток, окрашивая их трипан-синим цветом и используя гемоцитометровую камеру.Для оценки стабильности микробусов, измерить средний диаметр для образца из каждой популяции микробусов в течение курса времени с помощью микроскопа и изображений программного обеспечения. После приготовления с помощью этого протокола были успешно сгенерированы однородные и сферические альгинатные микробусы. После одного дня в стандартных условиях культуры клеток, инкапсулированные 7PA2 клетки равномерно распределены в микробусах.Когда 7PA2 пролиферации клеток был протестирован с помощью анализа МТС, не было существенной разницы между поведением 7PA2 клеток, выращенных с или без альгината в течение семи дней. Условные средства массовой информации, проанализированные из 2D и 3D культур 7PA2 клеток показали постоянное увеличение уровня амилоид-бета 1-42 в обеих культурах. Скорость высвобождения амилоид-бета 1-42 из микробусов, или 3D-культуры, аналогична по профилю, что и выпущенная из 2D-культуры.7PA2 клетки инкапсулированы в альгинат микробусы могут быть эффективно использованы для устойчивого выпуска амилоид-бета. Microbeads для engraftment в мозге крысы должны быть малы достаточно для того чтобы быть врезано без создавать большое повреждение. Имплантация шарика миллиметрового масштаба в головном мозге для целей in vivo не будет работать, в то время как микробус, изготовленный с помощью этого протокола, имеет подходящий размер для вставки в гиппокампе крысы.Чтобы убедиться, что у нас есть равномерное распределение клеток в конечном продукте, важно тщательно смешивать клетки в клеточной алгинатной суспензии, и это гарантирует равномерное высвобождение амилоида из каждой микробусы.

Research

JoVE Journal

Biology

Fabrication of Amyloid-&#946;-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.

Gibberella zeae аскоспор Производство и коллекция для Microarray эксперименты.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

Использование Rotorod как метод Качественный анализ Прогулка по Крыса

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication

Микро-диск массива при хроническом В естественных условиях Запись: Drive Изготовление

Chronic recording of large populations of neurons is a valuable technique for studying the function of neuronal circuits in awake behaving rats. ...

The use of Biofeedback in Clinical Virtual Reality: The INTREPID Project

Использование биологической обратной связи в клинической Виртуальная реальность: Проект INTREPID

Generalized anxiety disorder (GAD) is a psychiatric disorder characterized by a constant and unspecific anxiety that interferes with daily-life ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Выделение Рибосома связанных стадии становления Полипептиды<em&gt; В пробирке</em&gt;, Чтобы определить Поступательное сайтов Пауза Наряду мРНК

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Использование МЭСМ последовательности арест как средство изолировать Рибосома связанных полипептидов

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

Изготовление и использование микроокружения микрочипов (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

Регулярный уход и обслуживание данио рерио (<em&gt; Данио рерио</em&gt;) Лаборатория: введение

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Использование Хемостаты в Микробная системной биологии

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

Протеолитически деградированных альгинат гидрогели и гидрофобных микробиореакторов для инкапсуляции порцина Ооцита

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of ...