Name: fabrication of amyloid-&#946;-secreting alginate microbeads for use in modelling alzheimer's disease
Uploaded: 2019-07-06T12:30:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Amyloid-ÃŽÂ²-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease at JoVE.com

Författarna vill tacka herr kajen suresparan, Dr Jonathan wubetu, herr Dominik Grudzinski, Miss Chen Zhao, och Dr Thierry pilot för deras hjälp i optimering av natriumalginat rese Fabrication, cellkultur och Aβ upptäckt, och användbara vetenskapliga Diskussioner.

1. förberedelser
<ol><li>Förbered 100 ml av ~ 4% (w/v) natriumalginat stamlösning.<ol>
<li>Väg 4,4 g alginat natriumsalt och tillsätt torrt pulver till 100 mL HEPES-buffrad saltlösning (HBS, 20 mM HEPES (0,477 g) med 150 mM NaCl (0,877 g) i avjoniserat vatten som möjliggör återfuktning.</li>
		<li>Använd en magnetisk omrörare på ~ 500 varv per minut (rpm) och värme till upp till 50 ° c för att möjliggöra fullständig alginat hydrering. Anmärkning: alginat kan behöva en eller två timmar för att vara helt hydrerad. För att spara i tid, natriumalginat lösning kan göras upp en dag i förväg inkapsling protokollet och lagras vid 4 ° c till nästa dag. När alginat har kylts, värm försiktigt till 37 ° c med hjälp av ett vattenbad eller en värmeplatta och agitera med en magnetisk omrörare omedelbart före användning.</li>
		<li>Sterilt filter alginatlösningen med hjälp av ett 0,22 μm pore polyetersulfon (PES) filter före användning. Filtrering rekommenderas vid 37 ° c för att möjliggöra enkelt flöde av alginat. Viskositeten kommer att öka om temperaturen tillåts sjunka.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Förbered 1 000 mL av 0,5 M CaCl2.<ol>
<li>Väg 55,49 g vattenfri CaCl2 och lös i 1 000 ml HBS (20 mm Hepes och 150 mm NaCl i 1 000 ml avjoniserat</li>
		<li>Sterilt filter med ett pore PES-filter på 0,22 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bered 100 mL upplösnings blandning.<ol>
<li>Bered en 100 mM HEPES (23,83 g) och 500 mM Trinatriumcitratdihydrat (147,05 g) i fosfatbuffrad saltlösning.</li>
		<li>Justera till pH 7,4 med NaOH eller HCl.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ställa in inkapslingssystemet
<ol><li>Rengör laminärt Flow Hood.<ol>
<li>Sterilisera den laminära Flow Hood som innehåller inkapslaren med UV-exponering följt av sprutning med 70% v/v etanollösning.</li>
		<li>Spola inkapslingssystemet med 10 mL 70% v/v etanollösning följt av 10 mL sterilt avjoniserat vatten.</li>
		<li>Sätt fast 300 μm-munstycket och upprepa steg 2.1.2.</li>
		<li>Spraya flaskan som innehåller den filtrerade alginatlösningen, flaskan som innehåller filtrerad kalciumkloridlösning och alla verktyg, utrustning och tomma odlings plåtar som kommer att användas med 70% v/v etanollösning och placera dem i laminärt Flow Hood. Innan användning, slå på ett UV-ljus igen i 30 min för att grundligt sterilisera.</li>
		<li>Förbered en avfalls bägare som är fylld med desinfektionsmedel av biologisk kvalitet och placera bägaren i huven.</li>
		<li>Fyll en bägare med 100 mL steril CaCl2 (vattenlösning) och Lägg i en magnetisk omrörare. Ställ omrörningshastigheten till 100 rpm. Placera bägaren på en magnetisk plattform på en höjd av 18 cm från spetsen på munstycket. Denna bägare kommer att användas för att samla natriumalginat pärlor och tillåta deras gelation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Förbered celler för inkapsling.<ol>
<li>Ta bort celler från inkubatorn och lossa från den Near-confluent-kolven med 0,25% trypsin-EDTA-lösning och inkubera vid 37 ° c i 5-10 min.</li>
		<li>Isolera ett prov för uppskattning av celltäthet och centrifugera sedan de återstående cellerna vid 1 000 rpm i 5 minuter för att få en cellpellet.</li>
		<li>Omsuspendera pelleten i HBS (20 mM HEPER och 150 mM NaCl) för att fördubbla den slutliga önskade cellkoncentrationen (t. ex. för en slutlig koncentration av 1,5 x 106 celler/ml, Omsuspendera cellerna i HBS för att uppnå en koncentration av 3 x 106 celler/ml).</li>
		<li>I ett 50 mL centrifugrör, blanda cellsuspensionen i ett 1:1-förhållande med ~ 4% (w/v) alginatlösning för att få en slutlig suspension som innehåller önskad cell koncentration (t. ex. 1,5 x 106 celler/ml) i en ~ 2% (w/v) alginatlösning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ange inkapslingen parametrar.<ol>
<li>Ställ in inkapslingsmaskinens hastighet på den maximala extruderingshastigheten (8,9 mL/min), spänningen till 1,0 kV och frekvensen till 5 500 Hz. Obs: dessa parametrar har tidigare optimerats för att erhålla mikropärlor av 550 μm i diameter.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. tillverkning
<ol><li>Fabricera mikropärlor.<ol>
<li>I en 20 mL spruta, Fyll på 5 mL av den cell-alginate suspensionen och bifoga en spruta till inkapslaren.</li>
		<li>Starta inkapslaren genom att aktivera flödet som kommer att driva den cell-alginate suspensionen genom mataren. En ström av droppar kommer att extruderas genom munstycket.</li>
		<li>Samla in de första 1 mL i avfalls bägaren för att upphäva den ursprungliga icke-enhetliga strömmen.</li>
		<li>Fortsätt att köra de återstående 4 mL så att dropparna att falla i CaCl2 gelation badet. Varje milliliter kan köras separat (men successivt) och samlas i fyra olika gelation bad om det behövs. Anmärkning: vid kontakt med gelation badet, alginat i dropparna kommer omedelbart Cross-Link med kalciumjoner i gelation badet och bilda sfäriska mikropärlor.</li>
		<li>Efter en minut, ta bort gelation bägaren från den magnetiska plattformen och låt mikropärlor att sitta i ytterligare 4 min utan agitation (tid som krävs för att möjliggöra fullständig gelation över mikropärlor vid rumstemperatur).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hämta mikropärlor.<ol>
<li>Ta bort alla stora alginat skräp eller artefakter med hjälp av ett par sterila pincett, och sedan använda en steril plastpipett för att överföra till ett 74 μm mesh-filter för att hämta mikropärlor från gelation badet.</li>
		<li>Överför Mikropärlorna till ett centrifugeringsrör med hjälp av lämpligt odlingsmedium och låt det jämbrera i 5 minuter i cell odlingsmediet.</li>
		<li>Överför till en kolv, tallrik eller petriskål för inkubering och ytterligare experiment. Obs: gelation badet ska inte återanvändas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. testning och användning av mikropärlor
<ol><li>Testa rese kvalitet.<ol>
<li>För att bedöma cellernas genomförbarhet (eller andra biologiska avläsningar) efter inkapsling och kultur, försiktigt störa mikropärlor att frigöra de kapslade cellerna med hjälp av upplösningen blandningen. Den erforderliga volymen av upplösnings blandningen beror på antalet mikrokulor som används per test. En föreslagen ration är 4 mL upplösning blandning till varje 1 mL av inkapslade celler. Det här steget behöver bara utföras på ett enda prov från varje mikropärlpopulation.</li>
		<li>Inkubera cellerna i en cellkultur inkubator kompletterad med 5% CO2 vid 37 ° c i 10 min.</li>
		<li>Uppskatta cellernas genomförbarhet för celler nu i lösning som vanligt genom färgning celler med trypan blå och med hjälp av en hemocytometern kammare. Anmärkning: om du använder automatiserade cell räknare för uppskattningar av cellernas lönsamhet bör försiktighet iakttas för att undvika alginatartefakter som stör antalet. I dessa fall, naual cellräkning rekommenderas.</li>
		<li>För att bedöma mikropärlstabilitet, Mät den genomsnittliga diametern för ett prov från varje mikropärlpopulation över en tids kurs med hjälp av ett mikroskop och bildprogram. Dramatiska efterföljande variationer i diameter kan tyda på alginatnedbrytning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Använd mikropärlor för detektion av utsöndras Aβ.<ol>
<li>Exempel på cell odlingsmaterial från 7PA2-celler odlade i standardbetingelser (2D) vid 24 h-intervaller och förvaras vid-20 ° c för vidare analys.</li>
		<li>Exempel på cell odlingsmaterial från inkapslade 7PA2-celler odlade i standardbetingelser (3D) vid 24 h-intervaller och förvaras vid-20 ° c för vidare analys.</li>
		<li>Detektera utsöndring av Aβ från 7PA2-celler i insamlade konditionerade medier med enzymkopplad immunsorbent analys (ELISA) (figur 4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Använd mikropärlor för ytterligare studier i relevanta applikationer. Obs: Encapsulated 7PA2 celler kan användas för att bedöma effekterna av ihållande Aβ sekretion i någon eller modell.<ol>
<li>För rese engraftelse inom råtta Hippocampus i hjärnan, generera 1 mm tjocka koronala sektioner av råtta hjärnan och använda kirurgiska verktyg för att infoga mikrokulor i önskat område (figur 5).</li>
		<li>Kapsla in olika celltyper i natriumalginat mikropärlor enligt de beskrivna protokollen för att bedöma den ihållande frisättningen av biomolekyler av intresse. Relevanta in vitro-och in vivo-system kan modelleras ytterligare.</li>
		<li>Detektera uttrycket av membranbundna markörer av inkapslade celler med flödescytometri och/eller immunofluorescens. Anmärkning: ett exempel på användning av en liknande metod för tillverkning av mikropärlor modellering tidiga stadier av tumör massa tillväxt och biomarkör uttryck beskrivs av Rios 20.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hardy, J. A., Higgins, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease:+the+amyloid+cascade+hypothesis.">Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis.</a> Science. 256, 184-185 (1992).</li><li>Karthick, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+effect+of+oligomeric+amyloid-&#946;+(1-42)-induced+hippocampal+neurodegeneration+in+rat+model+of+Alzheimer's+disease.">Time-dependent effect of oligomeric amyloid-&#946; (1-42)-induced hippocampal neurodegeneration in rat model of Alzheimer's disease.</a> Neurological Research. 41 (2), 139-150 (2018).</li><li>Watremez, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilized+Low-n+Amyloid-&#946;+Oligomers+Induce+Robust+Novel+Object+Recognition+Deficits+Associated+with+Inflammatory,+Synaptic,+and+GABAergic+Dysfunction+in+the+Rat.">Stabilized Low-n Amyloid-&#946; Oligomers Induce Robust Novel Object Recognition Deficits Associated with Inflammatory, Synaptic, and GABAergic Dysfunction in the Rat.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 62 (1), 213-226 (2018).</li><li>Brouillette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotoxicity+and+memory+deficits+induced+by+soluble+low-molecular-weight+amyloid-&#946;1-42+oligomers+are+revealed+in+vivo+by+using+a+novel+animal+model.">Neurotoxicity and memory deficits induced by soluble low-molecular-weight amyloid-&#946;1-42 oligomers are revealed in vivo by using a novel animal model.</a> Journal of Neurosciences. 32 (23), 7852-7861 (2012).</li><li>Solana, C., Tarazona, R., Solana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosenescence+of+Natural+Killer+Cells,+Inflammation,+and+Alzheimer's+Disease.">Immunosenescence of Natural Killer Cells, Inflammation, and Alzheimer's Disease.</a> International Journal of Alzheimer's Disease. , 3128758 (2018).</li><li>Sturchler-Pierrat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+amyloid+precursor+protein+transgenic+mouse+models+with+Alzheimer+disease-like+pathology.">Two amyloid precursor protein transgenic mouse models with Alzheimer disease-like pathology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (24), 13287-13292 (1997).</li><li>Tomiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+amyloid+beta+oligomers:+their+contribution+to+synaptic+alteration,+abnormal+tau+phosphorylation,+glial+activation,+and+neuronal+loss+in+vivo.">A mouse model of amyloid beta oligomers: their contribution to synaptic alteration, abnormal tau phosphorylation, glial activation, and neuronal loss in vivo.</a> Journal of Neurosciences. 30 (14), 4845-4856 (2010).</li><li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+App+knock-in+mouse+models+of+Alzheimer's+disease.">Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease.</a> Nature Neurosciences. 17 (5), 661-663 (2014).</li><li>Oddo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-Transgenic+Model+of+Alzheimer's+Disease+with+Plaques+and+Tangles:+Intracellular+A+and+Synaptic+Dysfunction.">Triple-Transgenic Model of Alzheimer's Disease with Plaques and Tangles: Intracellular A and Synaptic Dysfunction.</a> Neuron. 39 (3), 409-421 (2003).</li><li>Leon, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Transgenic+Rat+Model+with+a+Full+Alzheimer's-Like+Amyloid+Pathology+Displays+Pre-Plaque+Intracellular+Amyloid-&#946;-Associated+Cognitive+Impairment.">A Novel Transgenic Rat Model with a Full Alzheimer's-Like Amyloid Pathology Displays Pre-Plaque Intracellular Amyloid-&#946;-Associated Cognitive Impairment.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 20 (1), 113-126 (2010).</li><li>Prince, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dementia+UK:+Second+Edition+-+Overview.">Dementia UK: Second Edition - Overview.</a> Alzheimer's Society. , 61 (2007).</li><li>Cavanaugh, S. E., Pippin, J. J., Barnard, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Alzheimer+disease:+historical+pitfalls+and+a+path+forward.">Animal models of Alzheimer disease: historical pitfalls and a path forward.</a> Alternatives to animal experimentation. 31 (3), 279-302 (2014).</li><li>Oakley, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraneuronal+&#946;-Amyloid+Aggregates,+Neurodegeneration,+and+Neuron+Loss+in+Transgenic+Mice+with+Five+Familial+Alzheimer's+Disease+Mutations:+Potential+Factors+in+Amyloid+Plaque+Formation.">Intraneuronal &#946;-Amyloid Aggregates, Neurodegeneration, and Neuron Loss in Transgenic Mice with Five Familial Alzheimer's Disease Mutations: Potential Factors in Amyloid Plaque Formation.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (40), 10129-10140 (2006).</li><li>Forny-Germano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+Disease-Like+Pathology+Induced+by+Amyloid-&#946;+Oligomers+in+Nonhuman+Primates.">Alzheimer's Disease-Like Pathology Induced by Amyloid-&#946; Oligomers in Nonhuman Primates.</a> Journal of Neuroscience. 34 (41), 13629-13643 (2014).</li><li>Masliah, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+expression+of+synaptic+proteins+occurs+early+during+progression+of+Alzheimer's+disease.">Altered expression of synaptic proteins occurs early during progression of Alzheimer's disease.</a> Neurology. 56 (1), 127-129 (2001).</li><li>Lepelletier, F. X., Mann, D. M. A., Robinson, A. C., Pinteaux, E., Boutin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+changes+in+extracellular+matrix+in+Alzheimer's+disease.">Early changes in extracellular matrix in Alzheimer's disease.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (2), 167-182 (2017).</li><li>Calafiore, R., Basta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+application+of+microencapsulated+islets:+Actual+prospectives+on+progress+and+challenges.">Clinical application of microencapsulated islets: Actual prospectives on progress and challenges.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 67-68, 84-92 (2014).</li><li>Lim, F., Sun, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microencapsulated+islets+as+bioartificial+endocrine+pancreas.">Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas.</a> Science. 210 (4472), 908-910 (1980).</li><li>Tran, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+hydrogel+protects+encapsulated+hepatic+HuH-7+cells+against+hepatitis+C+virus+and+other+viral+infections.">Alginate hydrogel protects encapsulated hepatic HuH-7 cells against hepatitis C virus and other viral infections.</a> PLoS One. 9 (10), 109969 (2014).</li><li>Rios de la Rosa, J. M., Wubetu, J., Tirelli, N., Tirella, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorectal+tumor+3D+in+vitro+models:+advantages+of+biofabrication+for+the+recapitulation+of+early+stages+of+tumour+development.">Colorectal tumor 3D in vitro models: advantages of biofabrication for the recapitulation of early stages of tumour development.</a> Biomedical Physics &amp; Engineering Express. 4 (4), 045010 (2018).</li><li>Tirella, A., Orsini, A., Vozzi, G., Ahluwalia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+diagram+for+microfabrication+of+geometrically+controlled+hydrogel+scaffolds.">A phase diagram for microfabrication of geometrically controlled hydrogel scaffolds.</a> Biofabrication. 1 (4), 045002 (2009).</li><li>Smalley, K. S. M., Lioni, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+ins't+flat:+Taking+cancer+biology+to+the+next+dimension.">Life ins't flat: Taking cancer biology to the next dimension.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 42 (8-9), 242-247 (2006).</li><li>Podlisny, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+secreted+amyloid+beta-protein+into+sodium+dodecyl+sulfate-stable+oligomers+in+cell+culture.">Aggregation of secreted amyloid beta-protein into sodium dodecyl sulfate-stable oligomers in cell culture.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (16), 9564-9570 (1995).</li><li>Portelius, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+characterization+of+amyloid-&#946;+species+in+the+7PA2+cell+model+of+Alzheimer's+disease.">Mass spectrometric characterization of amyloid-&#946; species in the 7PA2 cell model of Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 33 (1), 85-93 (2013).</li><li>Welzel, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+amyloid+&#946;-proteins+in+a+cell+culture+model+include+N-terminally+extended+peptides+that+impair+synaptic+plasticity.">Secreted amyloid &#946;-proteins in a cell culture model include N-terminally extended peptides that impair synaptic plasticity.</a> Biochemistry. 53 (24), 3908-3921 (2014).</li><li>O'Hare, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orally+bioavailable+small+molecule+drug+protects+memory+in+Alzheimer's+disease+models.">Orally bioavailable small molecule drug protects memory in Alzheimer's disease models.</a> Neurobiology of Aging. 34 (4), 1116-1125 (2013).</li><li>Nedovi&#263;, V., Willaert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+Cell+Immobilisation+Biotechnology.">Fundamentals of Cell Immobilisation Biotechnology.</a> Methods and Technologies for Cell Immobilisation/Encapsulation. , 185-204 (2004).</li><li>Omer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+Normoglycemia+in+Rats+Receiving+Transplants+with+Encapsulated+Islets.">Long-term Normoglycemia in Rats Receiving Transplants with Encapsulated Islets.</a> Transplantation. 79 (1), 52-58 (2005).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Metoden som beskrivs i denna artikel är användbar för att kapsla in celler som uppnår en smal storleksfördelning av alginatmikropärlor27. Det ger också fördelen av växande celler i en immunisolerad miljö17,19, skydda dem från yttre stress. Dessutom, inkapsling av celler i alginat närmare härmar fysiologiska tillstånd, särskilt när det gäller cell-till-cell interaktioner och mat ris stelhet20. Dessa faktorer är alla särskilt viktiga för efterföljande användning i relevanta tillämpningar, såsom in vivo-inympningen, utesluter potentiella immunreaktioner i den omgivande vävnaden17. Dessutom är en stor fördel med detta protokoll lätt tunbarhet enligt tillämpning av intresse: det är möjligt att ändra protokollet och optimera parametrarna för tillverkning av större eller mindre, och mjukare eller styvare pärlor. Den beskrivna metoden används för att fabricera pärlor tillräckligt små för att injiceras med minimalt invasiva metoder, och tillräckligt stor för att vara värd för ett antal celler och ge en tillräcklig frisättning av Aβ att resultera i observerbara beteendemässiga och patologiska effekter vid injektion i djurmodeller.
Framgången för detta protokoll är beroende av ett antal kritiska steg. Noggrann cell hantering och optimala cell odlingstekniker är viktiga för att bibehålla cellernas lönsamhet och funktion20,28. Med hjälp av standard odlingsförhållanden säkerställer bevarandet av normal funktion av 7PA2-celler, som observerats. Detta möjliggör en liknande release profil för Aβ1-42 från inkapslade celler jämfört med 2D-kulturer. För att protokollet ska fungera optimalt garanterar dessutom en lösning med låg viskositet alginat bättre resultat jämfört med en alginatlösning med hög viskositet. Detta säkerställer att ett homogent laminärt stråle extruderas genom munstycket och en jämn fördelning av celler i matrisen av de fabricerade pärlorna27. Material som används för att kapsla in celler måste ha en mycket snabb gelation mekanism, vilket gör att behålla formen.
Ett annat kritiskt steg i detta protokoll är hanteringen av fabricerade mikrokulor efter gelation. Här visar vi hämtning av mikropärlor med hjälp av en stor bländare plastpipett för att överföra pärlorna. Alternativt kan hälla kalciumkloridlösning som innehåller mikropärlor i ett nätfilter användas för pärla hämtning. En stor (5, 10 eller 25 mL) serologisk pipett kan användas för att rita upp Mikropärlorna och sedan tvättas genom nätfiltret istället för att hälla. Fördelen med detta är ett högre förtroende för steriliteten i förfarandet jämfört med hälla. Men av begränsningarna är att vissa pärlor kan förvrängas om de komprimeras av pipetten, förutom att riskera en lägre avkastning om en stor del av mikrokulor inte räddas.
Detta tillvägagångssätt har använts för att kapsla in olika cellinjer för att modellera och studera olika sjukdomar (t. ex. frisättning av insulin från inkapslade bukspottskörteln Holmen). Nyheten i vårt förhållningssätt är en inympelse av mikropärlor som genereras med hjälp av detta protokoll som en användbar metod för modellering av viktiga aspekter av Alzheimers sjukdom in vivo. Vid jämförelse av release profilen för Aβ från inkapslade celler (figur 4) till nivåerna av Aβ som genereras av en bolusinjektion (såsom den som rapporterats i andra studier3,26), kan en mer kronisk och ihållande frisättning av Aβ Förväntade. Figur 6 illustrerar den förväntade tendens som kan uppnås. Använda detta system för in vivo modellering är mer relevant för hur sjukdomen fortskrider och kan vara mer användbar i Drug discovery och utveckling.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig6.jpg"> Figur 6 : Förväntad release profil för Aβ1-42 från inkapslade 7pa2-celler jämfört med en bolusinjektion. Profilen för Aβ release från inympade 7pa2-innehållande mikrokulor gör det möjligt att testa effekterna av kronisk och ihållande Aβ i en djurmodell av relevans för AD. Omvänt, en bolusinjektion skulle skapa en topp i Aβ nivåer under en kort tidsperiod, följt av en snabb clearance av Aβ från hjärnan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig6large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Modellering neurodegenerativ sjukdom är utmanande på grund av den komplexa och intrikata karaktär av hjärnan. Vid Alzheimers sjukdom (AD), den progressiva förlusten av synaptisk funktion och död nervceller tros vara en nedströms effekt av ihållande överproduktion och ackumulering av amyloid beta (Aβ) peptider efter onormal bearbetning av amyloid föregångare protein (APP) enligt amyloid Cascade hypotes1.
För att förstå mekanismerna i denna amyloid-inducerad patologi och för att underlätta identifieringen av nya behandlingsmål har forskarna utvecklat olika prekliniska in vivo-modeller. En kategori av modeller använder en bolusinjektion av en syntetisk Aβ-peptid i rått hjärnan2,3,4. Den största begränsningen av sådana modeller är att de förlitar sig på en enda punkt eller upprepade behandlingar med Aβ peptider i höga koncentrationer deponeras allt på en gå. Detta är oförenligt med kronisk, ihållande karaktär frisläppandet av Aβ i sjukdom5. En annan kategori av in vivo-modeller är transgena djurmodeller som uttrycker en eller flera genetiska mutationer kopplade till sjukdomens familjella variationer6,7,8,9, 10. eftersom familjär AD endast svarar för mindre än 5% av alla fall av Alzheimers11, är relevansen av dessa modeller i översättning till sporadiska AD hos människor tvivelaktig12. En annan nackdel med den transgena metoden är accelererad Aβ bildas från födseln, vilket leder till underskott i kognitiv funktion och patologiska förändringar för snabbt och aggressivt för att likna sjukdomsprogression hos sporadiska AD hos patienter12 . Till exempel ger 5x FAD-modellen plack i så lite som 1,5 månader13.
Intressant, båda dessa kategorier resultera i förändringar i kognitiv funktion av relevans för AD forskning2,3,4,5,6, och ibland de åtföljs av förekomst av patologiska kännetecken för sjukdomen såsom amyloida plack6,8, Tau fosforylering6,7 och/eller synaptisk och neuronala förlust7,9, 14. Men medan dessa typer av modeller kan ge oss en inblick i effekterna av höga halter av amyloid i hjärnan, som ofta förknippas med senare stadier av AD, de misslyckas med att återspegla de tidigare förändringarna uppvisade som svar på kronisk och ihållande exponering för Aβ peptid12, såsom förändrat uttryck för synaptiska markörer15 och komponenter i den extracellulära matrisen16. Därför återstår fortfarande ett behov av att skapa en kronisk modell som mer exakt illustrerar effekterna av ihållande Aβ sekretion på in vivo kognition och illustrerar förändringar i patologi.
För detta ändamål har vi utvecklat ett system som tillåter konstant, ihållande utsöndring av Aβ på ett kontrollerat sätt genom att immobilisera amyloid-utsöndringen celler inom hydrogel mikropärlor, som kan därefter implanteras i den vuxna råtta hjärnan att modellera aspekter av sporadiska annonser.
Alginat var det utvalda biomaterial eftersom det är biokompatibelt och inte inducerar några oönskade reaktioner vid implantat in vivo17. Cell inkapsling i alginathydrogels har varit väl etablerad under de senaste fyra decennierna. Det första exemplet på dess översättning till kliniken rapporterades för behandling av typ 1 diabetes mellitus17. Den tidigaste rapporten om framgångsrik inkapsling av öar i Langerhans går tillbaka till 1980. Transplantation av mikropärlor som innehåller insulinutsöndringen celler revolutionerade behandlingsalternativ för diabetespatienter som det restaurerade bukspottskörteln funktion, vilket eliminerar behovet av insulin injektion terapi18. Dessa verk rapporterar om hur cell inkapsling kan skydda dem från yttre påfrestningar, oavsett om mekanisk eller kemisk. Natriumalginat pärlor fungerar i själva verket som en barriär och isolerar celler från omgivningen och bevarar deras fenotyp, samtidigt som de ger tillräcklig tillgång till de omgivande medierna för näringsämnen och clearance av cellulära biprodukter19. Dessutom tillåter användning av alginat matchning av mekaniska egenskaper av mjuk vävnad20. Natriumalginat hydrogeler kan trimmas för att ha en styvhet på 1-30 kPa, genom att helt enkelt varierande alginatkoncentration och tvärbindningstäthet20,21. Detta är en viktig aspekt, inte bara för att bibehålla fenotypiska uttrycket av inkapslade celler in vitro, men också för att undvika eventuella inflammatoriska effekter efter inympningen in vivo22.
I detta protokoll, 7pa2 celler-en kinesisk hamster äggstock cell linje som är stabilt transfekterade med en mänsklig app V717F muterad gen23 -används. Dessa celler producerar kontinuerligt katalytiska produkter av app, inklusive Aβ1-4224,25, och har använts för att generera Aβ som ett alternativ till syntetisk produktion i prekliniska, akuta in vivo-studier26. Vi beskriver en tillverkningsmetod för immobilisera 7pa2 celler inom "mjuka" natriumalginat mikropärlor, utformade för att möjliggöra varaktig utsöndring av biomolekyler. Som ett konceptbevis, rapporterar vi om frisläppandet av Aβ1-42 peptid över tiden. Alginat som används är en lågviskositet alginat med en molekylvikt på 120000-190000 g/mol och en mannuronic till guluronic förhållandet 1,56 (M/G).
I ytterligare studier, dessa mikropärlor kan säkert transplanteras inom regioner i råtta hjärnan relevans för AD (t. ex., Hippocampus) att studera effekterna av kronisk Aβ sekretion på beteende in vivo och patologi ex vivo. Dessutom kan detta system användas för att studera effekterna av kronisk Aβ frisättning i in vitro-och ex vivo applikationer. Till exempel kan 7PA2-innehållande alginatmikropärlor samodlas in vitro med neuronala eller astrocytiska kulturer för att bedöma effekterna av kronisk Aβ-exponering på cellulära mekanismer som är förknippade med AD. Vidare, denna metod kan användas för att undersöka sambandet mellan kronisk Aβ produktion och långsiktig potentiering i ex vivo elektrofysiologi.
Höjdpunkten i detta protokoll är modularitet och flexibilitet i tillverkningsmetoden, vilket möjliggör tillverkning av alginat pärlor med en måldimension genom finjustering tillverknings parametrar. Beroende på ansökan, protokollet kan justeras för att få skräddarsydda mål när det gäller resestorlek, täthet av de inkapslade cellerna, och rese stelhet. Detta protokoll kan användas för inkapsling av en mängd olika celltyper, utveckla mer relevanta tredimensionella (3D) in vitro-modeller för att studera olika patologier. Vi rapporterade nyligen om hur alginate-inkapslade celler kan användas för att modellera tidiga stadier av cancer progression20.
Konceptet med inkapslingsprocessen bygger på extrudering av en laminär stråle av celler suspenderade i alginatlösning genom ett munstycke. Ett vibrerande huvud stör strålen med en kontrollerad frekvens som resulterar i lika stora alginatbaserade droppar. En extern elektrisk fält tillåter separation av de bildade alginate-baserade droppar, som vid kontakt med en lösning berikad i divalenta joner, såsom kalciumjoner, kan snabbt Cross-Link, bevara deras sfäriska form. Inkubering i gelationslösningen möjliggör bildandet av sfäriska mikropärlor som innehåller celler inom en homogen fysikalisk hydrogel27. Målstorleken på mikropärlor och alginathydrogels gör det<s></s> möjligt att utbyta näringsämnen och syre med cell odlingsmedier under långa tidsperioder (veckor). Figur 1 A Visa en schematisk representation av den inkapslat apparat som används (figur 1B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig1.jpg"> Figur 1 : Inkapslingssystemet. (A) schematisk representation av inkapslingssystemet. En alginatcell suspension lastas i en spruta (2) och matas genom en reservoar vid en extrudering hastighet inställd på sprutpumpen (1). I reservoaren vibrerar en vibrations hatt (3) med en frekvens som ställts in av en vågformsgenerator (4) för att störa strömmen med jämna mellanrum, vilket bildar lika stora droppar. Eftersom lösningen matas genom ett munstycke (5) och droppar bildas, en elektrostatisk potential appliceras över en elektrod (7) som fastställts av en spännings Generator (6), som något laddar ytan av dropparna, vilket gör att strömmen sprids till följd av repellerande elektrostatiska krafter. Som droppar engagera med gelation badet (8), ca2 +-driven tvärbindning av alginat resultat i bildandet av sfäriska mikropärlor. Bfotografi av inkapslaren före tillverkningen av alginatmikrokulor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Microbead storlek kan ändras beroende på den avsedda användningen. För att kontrollera storleken på mikropärlan justeras de olika parametrarna som beskrivs i figur 1A och i protokollet i enlighet med detta. Den inre diametern av munstycket används har en betydande inverkan på storleken på dropparna; ytterligare justera inkapsling parametrar, nämligen extrudering hastighet, vibrationsfrekvens och spänning, är nyckeln till att uppnå en jämn storleksfördelning. Tabell 1 beskriver hur de olika parametrarna kan förändra storleken på mikropärlor uppnås med detta system.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">Parametern</td>
			<td>Munstycke storlek</td>
			<td>Vibrationsfrekvens</td>
			<td>Flöde</td>
			<td>Elektrod spänning</td>
		</tr>
<tr>
<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
			<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
			<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
			<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
		</tr>
<tr>
<td>Pärlstorlek</td>
			<td>
<img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg">
</td>
			<td><img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/59597/59597img02.jpg"></td>
			<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
			<td>–</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Tillverknings parametrar och deras påverkan på storleken på mikropärlor. Tabellen illustrerar hur varje parameter kan påverka den resulterande storleken på fabricerade mikrokulor, oberoende av munstycket och viskositeten hos den lösning som används.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:848px;" width="847">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">&#181;Manager software</td>
			<td style="width:261px;">Vale Lab, UCSF, USA</td>
			<td style="width:100px;">v.1.46</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">0.22 um PES filter</td>
			<td style="width:261px;">Merck, UK</td>
			<td style="width:100px;">SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">15mm Netwell insert 74 um mesh filter</td>
			<td style="width:261px;">Constar, usa</td>
			<td style="width:100px;">#3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Alginic acid sodium salt from brown algae</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td style="width:100px;">A0682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td style="width:100px;">C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:341px;">CellTiter96&#160; AQueous One Solution cell proliferation assay</td>
			<td style="width:261px;">Promega, USA</td>
			<td style="width:100px;">G3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Encapsulator</td>
			<td style="width:261px;">Inotech</td>
			<td style="width:100px;">IE-50</td>
			<td>serial no. 05.002.01-2005</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">HEPES</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td style="width:100px;">H4024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Hu A&#946; 1-42 ELISA</td>
			<td style="width:261px;">ThermoFisher, UK</td>
			<td style="width:100px;">KHB3441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:261px;">ImageJ</td>
			<td style="width:100px;">v1.49p</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Inverted light microscope</td>
			<td style="width:261px;">Olympus</td>
			<td style="width:100px;">CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Leica microscope</td>
			<td style="width:261px;">Leica microsystems, UK</td>
			<td style="width:100px;">DMI6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Neo sCMOS Camera</td>
			<td style="width:261px;">Ander, UK</td>
			<td align="right" style="width:100px;">5.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td style="width:100px;">D1408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td align="right" style="width:100px;">433209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Trispdium citrate dihydrate</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td style="width:100px;">W302600-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:261px;">Sigma-Aldrich,uk</td>
			<td style="width:100px;">T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of amyloid-&#946;-secreting alginate microbeads for use in modelling alzheimer's disease

Enligt amyloid Cascade hypotesen, den tidigaste utlösa i utvecklingen av Alzheimers sjukdom (AD) är ansamling av giftiga amyloid-β (Aβ) fragment, så småningom leder till de klassiska inslagen i sjukdomen: amyloid plack, neurofibrillära trassel och synaptisk och neuronala förlust. Avsaknaden av relevanta icke-transgena prekliniska modeller reflekterande av sjukdomsprogression är en av de viktigaste faktorerna som hindrar upptäckten av effektiva läkemedelsbehandlingar. För detta ändamål har vi utvecklat ett protokoll för tillverkning av alginat mikropärlor innehållande amyloid-utsöndring celler användbara för studiet av effekterna av kronisk Aβ produktion.
Kinesisk hamster äggstocksceller tidigare transfekterade med en mänsklig app gen, utsöndring Aβ (dvs 7pa2 celler), användes i denna studie. En tredimensionell (3D) in vitro-modell för ihållande frisättning av Aβ var fabricerade genom inkapsling av 7PA2 celler i alginat. Processen optimerades för att rikta en pärldiameter på 500-600 μm för ytterligare in vivo studier. Optimering av 7pa2 cell inkapsling i alginat utfördes förändra tillverknings parametrar, e.g., natriumalginat koncentration, gel flöde hastighet, elektrostatisk potential, huvud vibrationsfrekvens, gelbildande lösning. Nivåerna av utsöndras Aβ analyserades över tiden och jämfördes mellan alginatpärlor och standard cell odlingsmetoder (upp till 96 h).
En koncentration av 1,5 x 106 7pa2 celler/ml och en alginatkoncentration på 2% (w/v) BUFFRAD med Heper och efterföljande gelation i 0,5 M kalciumklorid i 5 min hittades för att tillverka de mest stabila Mikropärlorna. Fabricerade mikrokulor var 1) av enhetlig storlek, 2) med en genomsnittlig diameter på 550 μm, 3) som innehåller cirka 100-150 celler per mikropärla och 4) kan utsöndra Aβ.
Sammanfattningsvis kan vår optimerade metod för produktion av stabila alginatmikrokulor som innehåller amyloid-producerande 7PA2-celler göra det möjligt att modellera viktiga aspekter av AD både in vitro och in vivo.

7pa2 celler är framgångsrikt inkapslade i natriumalginat mikrokulor Efter beredning, enhetliga och sfäriska natriumalginat mikropärlor genereras framgångsrikt med hjälp av detta protokoll. Bilderna i figur 2A nedan visar upp ett exempel på hur ändring av en av parametrarna (dvs. spänning) förändrar flödet och spridningen av natriumalginat droppar ström. Figur 2 B visar ett exempel på erhållna alginatpärlor omedelbart efter geleringsprocessen.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig2.jpg"> Figur 2 : Fabrication metod optimering. (A) fotografier som visar förändringar i ström spridningen. (B) ljus fälts bild som visar natriumalginat sfäriska mikropärlor omedelbart efter tillverkningen. (C) exempel på optimering steg: tuning valda Fabrication parametrar för att uppnå målet resestorlek. Valda grafer för att illustrera sambandet mellan varje parameter och storleken på de resulterande Mikropärlorna (storleksfördelning från minst n = 100 mikropärlor). Observera att munstycket inre diameter, viskositet av utkastade lösning och gelbildande villkor kan också påverka storleken på fabricerade pärlor. Felstaplar representerar SD <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig2large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Det beskrivna protokollet är flexibelt och tillåter tillverkning av olika storlekar av alginate-baserade mikropärlor, varierande i sammansättning enligt ansökan. I figur 2Crapporterar vi påverkan av alginatflödet, spänning och frekvens på storleken på mikropärlor med hjälp av en 2% (w/v) alginatlösning i Hepes (pH 7,2) extruderad genom ett munstycke på 300 μm.
Eftersom omfattningen av denna studie var att producera mikropärlor som kan bäddas in i råtta hjärnan, justerade vi fabricering parametrar för att få en genomsnittlig rese diameter i intervallet 500-600 μm. För kvalitetskontroll ändamål var metoden optimerad för att ha minimal variation i populationen av fabricerade pärlor (dvs. smala storleksfördelning). Observera att (1) producerade pärlor kan injiceras i råtta hjärnan med hjälp av en Hamilton spruta utrustad med en 20G nål; och (2) en halvklotet av råtta hjärna kanna värd upp till två eller tre pärlor av den här storlek.
Efter optimering, Encapsulating Security Payload 7pa2 celler vid en koncentration av 1,5 x 106 celler/ml suspenderade i en 2% (w/v) alginat lösning buffrad med Hepes och sjönk i en 0,5 M kalciumklorid gelation bad gav önskad mikropärlor. Figur 3 A nedan visar inkapslade 7PA2 celler jämnt fördelade i mikropärlor efter en dag i standard cell odlingsförhållanden. 7PA2 cellproliferation testades med en MTS-analys enligt tillverkarens protokoll. Det fanns ingen signifikant skillnad mellan beteendet hos 7PA2-celler som odlas med eller utan alginat under en sjudagarsperiod (figur 3B). När inkuberande inkapslade celler i standard odlingsförhållanden, celler förväntas fortsätta att förleda under experimentets varaktighet, och små grader av cell flykt kan förväntas som ett resultat, som rapporterats i andra verk28. Effekterna av detta kan mildras genom att kapa på en mindre celltäthet eller minska serumkoncentrationen i vilken mikropärlor inkuberas.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig3.jpg"> Figur 3 : Inkapslade 7PA2-celler. (A) ljus-fält bild av inkapslade 7pa2 celler som visar även cell fördelningen i hela natriumalginat microbead. Fabrication parametrar sattes för att få ~ 150 7PA2 celler per pärla. Ingen signifikant variation i alginatpärlor observerades under 7 dagar av kultur. B) det fanns ingen observerad skillnad mellan den totala spridningen av 7PA2-celler som inkuberats med alginat jämfört med celler som inkuberats utan alginat. 7PA2 celler växa och migrera över volymen av alginat pärlor; minskning av serumkoncentrationen kan övervägas för att bromsa celltillväxten. Felstaplar representerar SD <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig3large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Alginate mikrokulor kapsla in 7pa2-celler är stabila över tid För att undersöka storlek och form av erhållna natriumalginat mikropärlor, Mikroskop analys utfördes efter tillverkning och gelation. Den genomsnittliga diametern för de mikropärlor som erhålls med det valda protokollet är 550 ± 2 μm.
Teoretiskt kan antalet celler som förväntas i en rese 550 μm-diameter beräknas på följande sätt:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597eq1.jpg">
där V = volym och r = radie. Volymen av en enda rese är V = 8,8 x 10-5 ml; Därför, antalet celler per mikropärla vid tidpunkten för inkapsling = (1,5 × 106) x (8,8 x 10-5) ≈ 130 celler.
Experimentellt räknade vi antalet inkapslade celler omedelbart efter tillverkningen. Alginate pärlor var försiktigt störs med hjälp av upplösning mix och celler färgas med trypan blå lösning. Lönsamhet uppskattning och räkning av celler utfördes med hjälp av en hemocytometer; erhållna resultat visade i genomsnitt 116 ± 17 levande celler per mikropärla (n = 5, data ej rapporterad). Som väntat observerades en mindre skillnad mellan teoretiskt och experimentellt cellantal omedelbart efter inkapsling. För vissa tillämpningar, och i synnerhet för att bestämma mängden utsläppt Aβ över tiden, är det viktigt att förutsäga antalet celler inkapslade i varje natriumalginat pärla.
Intressant, inkapslingen processen har inte en betydande inverkan på cellernas lönsamhet. Resultaten rapporteras i ett tidigare arbete, där kolorektal cancerceller (dvs. HCT-116) inkapslades med en liknande metod, utan skillnader i cellernas lönsamhet i alginatmikrokulor jämfört med 2D-kontroller20.
För att mäta stabiliteten i alginat som används i inkapslingsprocessen, mätte vi mikropärldiametrarna under en 14-dagarsperiod (n = 100). Det fanns inga observerade förändringar i genomsnittlig diameter 14 dagar efter inkapsling jämfört med omedelbart efter inkapsling (data har inte rapporterats).
Encapsulated 7PA2-celler frigör Aβ över tid Konditionerade medier analyseras från 2D-och 3D-kulturer av 7PA2 celler avslöjar en konstant ökning av Aβ1-42 nivåer. Cell kultur Media samplades varje 24 h, och upp till fyra dagar, och analyseras med hjälp av ELISA. Våra data visar att graden av frisättning av Aβ1-42 från mikrokulor (3D) är liknande i profilen som frigörs från 2D-kulturen (figur 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig4.jpg"> Figur 4 : Hastighet av Aβ1-42 sekretion från 7pa2 celler. (A) Aβ release (% normaliserad efter 4 dagar) från 2D och 3D in vitro-modeller har en liknande profil. Båda modellerna visar en konstant ökning av Aβ-nivåer under fyra dagars perioden och, som väntat, en stadig koncentration inte nås. Bkoncentration av aβ1-42 normaliserad till initialt cell nummer, som visar liknande utsöndring av Aβ1-42 över tiden, oavsett odlingsmetoderna. Varken närvaron av alginat eller processen för inkapsling (3D in vitro-modell) ändra utsöndringen av Aβ1-42. Felstaplar representerar SD <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig4large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Potentiell applicering av inkapslade 7PA2-celler Vi rapporterar att 7pa2 celler inkapslade i natriumalginat mikropärlor kan användas effektivt för långvarig frisättning av Aβ1-42, och därmed används för att testa effekten av kronisk Aβ sekretion i någon preklinisk modell. I figur 5 nedan, vi visar fördelarna med att använda natriumalginat mikropärlor som lätt kan injiceras och ligger i hjärnan hos en råtta. Ex vivo avsnitt används här för illustration ändamål, jämföra en millimeter natriumalginat pärla kontra fabricerade natriumalginat mikropärlor.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig5.jpg"> Figur 5 : Användning av mikropärlor för relevanta prekliniska tillämpningar. Mikropärlor för engrafktion i råtta hjärnan måste vara tillräckligt liten för att vara inbäddade utan att skapa en lesion för stor för att undvika skador på hjärnparenkymet och negativt påverka normal hjärnfunktion. Bild (a) visar en Storleksjämförelse mellan en millimeterskalad pärla och en mikrometerskalad pärla sida vid sida. (B) implantera en millimeter-skalas pärla i hjärnan för in vivo ändamål skulle inte fungera. Bild (C) visar en mikropärla fabricerade med detta protokoll. Storleken är lämplig för insättning i hippocampus av råtta utan att ha en skadlig effekt på normal fysiologi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig5large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Bilderna ovan belyser vikten av att kontrollera storleken på rese för sådana studier. Här visar vi fördelen med att använda Mikrokulor av diametrar under 600 μm. Detta gör det möjligt att använda minimalt invasiv injektion (t. ex., Hamilton spruta) för att bättre kontrollera placeringen av injicerade pärlor i hjärnan.
Sammanfattnings, Encapsulating Security Payload 7pa2 celler ger kontroll över storleken på mikropärlor, antal inkapslade celler och förutsägelse av Aβ utsöndras från mikropärlor (t. ex., koncentration, release profil). Kontrollera storleken på mikrokulor är viktigt av två skäl: 1) för att möjliggöra finjusterad kontroll över koncentrationen av utsläppt Aβ, och 2) för att möjliggöra implantation i en kontrollerad region av råtta hjärnan. De resultat som erhålls här beskriver den facile tuning av natriumalginat mikropärlor och belysa potentiella ansökningar om ytterligare studier.

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Amyloid-ÃŽÂ²-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease at JoVE.com

Fabrication of Amyloid-ÃƒÅ½Ã‚Â²-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

Tillverkning av amyloid-β-utsöndring Alginate Microbeads för användning vid modellering av Alzheimers sjukdom

Detta protokoll illustrerar en cell inkapsling metod genom snabb fysisk gelation av alginat att immobilisera celler. Erhållna mikrokulor möjliggör kontrollerad och ihållande utsöndring av amyloid-β över tid och kan användas för att studera effekterna av utsöndringen av amyloid-β i in vitro-och in vivo-modeller.

According to the amyloid cascade hypothesis, the earliest trigger in the development of Alzheimer&#8217;s disease (AD) is the accumulation of toxic ...

Detta protokoll förklarar tillverkning av microbeads, som kommer att användas för att kontrollera graden av frisättning och mängden amyloid som är ett protein av intresse. Mikropärlorna kommer att immobilisera celler i ett lämpligt biomaterial och det kommer att skydda dem från deras omgivande miljö, samt ge dem möjlighet att utbyta biprodukter och näringsämnen med sin omgivande miljö. Inkapsling celler med hjälp av denna teknik säkerställer tät kontroll av microbead storlek samt cellnummer, och vi gör detta genom att justera olika fabricering parametrar.Så inkapsling de celler som beskrivs i detta protokoll kommer att ge oss mer av en kronisk frisättning av amyloid att använda i både in vitro- och in vivo-system, och tanken skulle vara detta skulle ge oss en bättre förståelse av mekanismerna för sjukdom och även tillåter oss att testa nya behandlingar. Denna metod kan användas för att formulera kontrollerat system och studera frisättningen av eventuella biomolekyler för många celltyper, vare sig ensam eller i kombination. Till att börja med ta bort en nära-konfluent kolv från inkubatorn.Behandla cellerna med 0,25%trypsin-EDTA-lösning och inkubera vid 37 C i fem till 10 minuter för att lösgöra cellerna. Efter att ha lagt DMEM/F12 medium, samla cellerna i en 50 milliliter rör. Centrifugera cellerna vid 1000 RPM i fem minuter.Ta bort supernatanten och dra upp pelleten på ny tid i HEPES buffrad saltlösning för att fördubbla den slutliga önskade cellkoncentrationen. I ett centrifugeringsrör på 50 milliliter, blanda detta cellupphängning i ett till ett förhållande med 4%-vikt och volymalginatlösning för att få en slutlig suspension som innehåller den önskade cellkoncentrationen i en 2-procentig vikt- och volymalginatlösning. För att ställa in inkapslingsparametrarna ställer du in hastigheten på enkapslarmaskinen på den maximala strängpressningshastigheten och ställer sedan in spänningen och frekvensen.För att fabricera mikropärlorna, i en 20 milliliter spruta, ladda fem milliliter av cell-alginat suspension och fäst en spruta till encapsulator. För att starta inkapslingen, aktivera flödet som kommer att driva cell-alginat suspension genom mataren, och en ström av droppar kommer att extruderade genom munstycket. Samla in den första en milliliter i avfallsbägaren för att undvika den initiala icke-enhetliga strömmen.Fortsätt sedan att köra de återstående fyra milliliter så att dropparna att falla i kalciumklorid gelation bad. Vid kontakt med gelationsbadet, alginaten i dropparna omedelbart tvärs länkar med kalciumjonerna i gelation badet, bildar sfäriska microbeads. Efter en minut, ta bort gelationsbägaren från den magnetiska plattformen och låt mikropärlorna vila i ytterligare fyra minuter utan agitation för att slutföra sin gelation vid rumstemperatur.För att hämta mikropärlorna använder du först ett par sterila pincett för att ta bort alla stora alginatskräp eller artefakter. Efter att ha klippt slutet av en plastpipett, använd den för att överföra mikropärlorna från gelationsbadet till ett 74-mikrometers nätfilter som hålls över en avfallsbägare. För att säkerställa framgång, skär vi alltid slutet av en plastpipett för att undvika att skada mikropärlorna och vi gör detta varje gång vi överför pärlor från ett fartyg till ett annat efter inkapsling.Invertera nätfiltret över ett centrifugrör. Pipettera lämpligt odlingsmedium över det för att tvätta pärlorna ner i röret och låta dem balansera i det mediet i fem minuter. Överför dem sedan till en kolv som tidigare fyllts med lämpligt medium för inkubation och ytterligare experiment.För att bedöma cellens livskraft efter inkapsling och odling, tillsätt upplösningsmix för att försiktigt störa mikropärlorna och frisätta de inkapslade cellerna. Inkubera cellerna i en cellodlingsinkubator kompletterad med 5%koldioxid vid 37 C i 10 minuter med mild agitation. Uppskatta cellens livskraft hos dessa celler genom färgning dem med trypan blå och med hjälp av en hemocytometer kammare.För att bedöma microbead stabilitet, mäta den genomsnittliga diametern för ett prov från varje microbead befolkningen över en tid kurs med hjälp av ett mikroskop och bildbehandling programvara. Efter beredning, var enhetliga och sfäriska alginate microbeads framgångsrikt genereras med hjälp av detta protokoll. Efter en dag i standard cellodling villkor, var inkapslade 7PA2 celler jämnt fördelade i microbeads.När 7PA2 cell spridning testades med hjälp av en MTS-analys, fanns det ingen signifikant skillnad mellan beteendet hos 7PA2 celler som odlas med eller utan alginat under en sju dagars period. Konditionerade media analyseras från 2D och 3D kulturer av 7PA2 celler visade en konstant ökning av amyloid-beta 1-42 nivåer i båda kulturerna. Graden av frisättning av amyloid-beta 1-42 från microbeads, eller 3D-kultur, är liknande i profil som frigörs från 2D-kulturen.7PA2 celler inkapslade i alginat mikropärlor kan effektivt användas för ihållande frisättning av amyloid-beta. Microbeads för engraftment i råtta hjärnan måste vara tillräckligt liten för att vara inbäddade utan att skapa en stor lesion. Implantera en millimeterskalad pärla i hjärnan för in vivo ändamål skulle inte fungera, medan en microbead som är fabricerad med hjälp av detta protokoll har en lämplig storlek för insättning inom hippocampus av råttan.För att se till att vi har en jämn fördelning av celler i slutprodukten, är det viktigt att noggrant blanda cellerna i cellen alginat suspension, och detta garanterar enhetlig frisättning av amyloid från varje microbead.

Research

JoVE Journal

Biology

Fabrication of Amyloid-&#946;-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.

Gibberella zeae Ascospore Produktion och insamling för microarray experiment.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

Användning av Rotorod som en metod för kvalitativ analys av Walking i Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication

Micro-drive array för kronisk In vivo Inspelning: Kör Fabrication

Chronic recording of large populations of neurons is a valuable technique for studying the function of neuronal circuits in awake behaving rats. ...

The use of Biofeedback in Clinical Virtual Reality: The INTREPID Project

Användningen av Biofeedback i klinisk Virtual Reality: Intrepid Project

Generalized anxiety disorder (GAD) is a psychiatric disorder characterized by a constant and unspecific anxiety that interferes with daily-life ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolering av ribosom Bundna framväxande Polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; För att identifiera Translationell Paus webbplatser Längs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Använda SecM Arrest sekvens som ett verktyg för Isolera ribosom Bundna Polypeptider

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

Tillverkning och användning av mikromiljö microarrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

Regelbunden skötsel och underhåll av en zebrafisk (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) Laboratorium: En introduktion

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Användning av kemostater i Microbial Systembiologi

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

Proteolytiskt nedbrutna Alginate Hydrogels och Hydrophobic Mikrobioreaktorer för Porcine Oocyte Inkapsling

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of ...