Langsgående to-foton billeddannelse af dorsal Hippocampal Carnot i levende mus

Denne procedure giver gentagen optisk adgang til de dorsale hippocampus af levende mus til at studere mekanismerne i hukommelse dannelse og tilbagekaldelse, mens de udfører læringsopgaver. Denne teknik gør det muligt at bruge lysmikroskopi til at studere den dorsale hippocampus af levende mus på mikrometerniveau rumlige opløsning langs over flere uger. Hukommelsestab er et generelt kendetegn for nogle hjernesygdomme såsom Alzheimers sygdom.

Forståelse af mekanismen for hukommelse dannelse og tilbagekaldelse kan i sidste ende hjælpe patienter, der lider af disse sygdomme. Denne metode kan anvendes på andre dyresystemer med et kranium som små pattedyr. Overvågning vitale tegn under en overlevelse kirurgi kan være både distraherende og stressende.

Det kan være nyttigt først at udføre proceduren på et dødt dyr for at fokusere på de mere afgørende aspekter af proceduren. For at forberede billeddålen, først skære en tre millimeter diameter rustfrit stål rør i en 1,6 millimeter lang metalring. Hvis kanterne af ringen ikke er stumpe efter skæring, fil ud uregelmæssigheder.

Brug derefter et par vicesser til at dyppe den ene side af metalringen i et UV-hærdende optisk klæbemiddel. Placer derefter metalringen i midten af et glasdækslæb med siden af ringen dækket af lim, der rører dækslæbet. Tænd for UV hærdning LED driver enhed og skinne 365 nanometer bølgelængde lys på limen i et minut for at helbrede limen.

Sørg for, at alle sider af ringen er lige belyst ved at ændre lyskildens retning. Når limen har hærdet i mindst to timer, skal du holde kanylen fast fra den åbne ende af metalringen ved hjælp af en hemostat. Brug en tandboremaskine udstyret med en roterende fil, fil off overskydende glas dækslæb, indtil det er skyllet med siderne af ringen.

Forbered de nødvendige instrumenter, og anæstes i musen som beskrevet i den medfølgende tekstprotokol. Fjern derefter håret og desinficere huden over musehovedet. Dernæst skal du bruge saks og kraftastrene til at lave et lille snit i hovedbunden i position tæt på lambda.

Flyt sidet i retning af ørerne derefter rostrally i retning af øjet baner til at danne en trekant på sagittal akse cirka fire millimeter rostral til bregma. Påfør en enkelt dråbe lidocain til kraniet. Efter to minutter, rydde periosteum og tørre kraniet ved hjælp af en vatpind.

Placer derefter ørebjælkerne for at fastgøre musens hoved. Ved hjælp af en mikro boremaskine med en 0,5 millimeter bredde burr, lave et lille hul i frontal knoglen overfor afbildet hippocampus ca 1,5 millimeter fra sagittal sutur og to millimeter distalt fra koronale sutur. Skru derefter en 0,86 millimeter bredde rustfrit stål knogleskrue ind i kraniet hul.

Fastgør den på plads ved hjælp af klæbende cement. Lad cementen tørre i 30 sekunder til et minut. Dernæst skal du bruge en tre millimeter diameter trephine boremaskine til at lave et lille hul i parietal knoglen.

Placer hullet ca 1,5 millimeter distalt fra den sagittale sutur og to millimeter distale fra lambdoid sutur. Fjern forsigtigt knogleklappen. Fjern derefter meninges ved hjælp af Dumont-vicess.

Ablate kortikale stof for at nå den eksterne kapsel. Brug en 19 gauge stump nål forbundet til en vakuumpumpe og overrisle med saltvand for at undgå dehydrering af det eksponerede væv og vaske væk eventuelle resterende blod efter blødningen er løst. Suck kortikale væv langsomt omkring 50 til 100 mikron ad gangen, indtil cortex løsner sig fra kapslen udsætter fibrene i cingulum eller corpus callosum.

Derefter forsigtigt skræl dorsale fibre, indtil de dybeste fibre, alveus af hippocampus er udsat. Når du er færdig, skyl vævet med saltvand. Brug derefter tynde kraftpind til at dyppe den nederste kanyle i saltvand og placere den over kraniehullet.

Skub derefter kanylen ind i kraniet, indtil glasset coverslip er i kontakt med fibrene. Tør kraniet og anvende en hurtig klæbende cement over kraniet til at holde kanylen på plads. Sørg også for at påføre lim på kanylens kanyle, men pas på ikke at lade limen løbe ind i kanylen.

Når den er tør, skal du bruge en stereoaxisk arm til at placere en hovedholderplade over kanylen i kontakt med kraniet. Forbered en blanding af dental akryl og derefter anvende det på tværs af hele kraniet. Dæk hele det eksponerede kranium, skruen og den åbne hud med dental akryl for at stabilisere præparatet.

Efter 15 minutter påføres en aftagelig klæbende film på hovedholderpladen for at forhindre snavs i at trænge ind i kanylen. Når du er klar til at afbilde hjernen, følg igen med i den medfølgende tekstprotokol for detaljer om bedøvelse. Når der er tilstrækkeligt forsænnet, skal du bruge virflangt til forsigtigt at fjerne klæbefilmen fra hovedholderpladen.

Fjern filmen forsigtigt for at undgå at beskadige præparatet. Placer derefter musen under mikroskopet over varmetæppet, og fastgør hovedpladen til holderen. Påfør øjens salve til dyrets øjne.

Rengør derefter billedkanylen ved hjælp af en sprøjte og en tynd nål til at slippe deioniseret vand ind i kanylen efterfulgt af fjernelse med en vakuumpumpe. Brug lav forstørrelse lange arbejdsafstand mål til visuelt at kontrollere kanylen for resterende vand, snavs, integritet og tilstedeværelsen af fluorescens. Juster derefter kanylen til den optiske akse ved at justere vinklerne på hovedholderarmene.

Skift til en 25X mål med en 1,0 numerisk blænde og en fire millimeter arbejdsafstand. Derefter tilsættes nok deioniseret vand til kanylen til at fylde det og vedligeholde overskydende vand på toppen af kanylen. Endelig skal du bruge to foton excitation og billede fluorescens signaler.

Vist her er en 2P billede stak fra en thy1-GFP transgene mus hjerne. Thy1-GFP mus udtrykker cytoplasmatisk forbedret GFP under kontrol af Thy1 promotor i en sparsom tilfældig population af pyramideformede neuroner. Generelt er den største akse af pyramideformede neuroner i den dorsale hippocampal CA1 stort set vinkelret på XY imaging flyet.

Disse områder er manuelt knyttet til en lav forstørrelse tre-dimensionelle stak viser mønster af GFP udtryk i volumen under billedbehandling kanylen. Til sporing i længderetningen defineres flere hjerneregioner inden for kanylens synsfelt. Hver region svarer til et areal på ca. 240 gange 240 mikrometer og indeholder mellem et og syv dendritiske segmenter.

Den afbildede serie her viser en mikrometer z-trins billede stakke af CA1 pyramideformede neuroner og basaldendritter erhvervet på forskellige tidsintervaller i 14 dage. Det er dog muligt at få længere billeddannelsesvarigheder og -intervaller. Selv om de fleste billeder er af dendritiske pigge i stratum oriens, er det også muligt at billedet dendritiske pigge i skrå dendritter i stratum radiatum.

En anden udvidelse af denne teknik er at billedet aktivitet-fremkaldte plasticitet i CA1 pyramideformede neuroner ved at injicere dorsale CA1 hippocampal område med en viral vektor. Dette giver mulighed for plasticitet af hundredvis af CA1 pyramideformede neuroner i hvert dyr, der skal måles vist her som en 2P billede stak. Det er afgørende at forhindre skader på hippocampus, når du fjerner det overliggende væv.

Derudover bør man placere kanylen korrekt for at sikre en stabil forberedelse. Det beskrevne præparat giver mulighed for brug af forskellige former for optisk billeddannelse såsom miniaturemikroskoper, der kan implanteres på dyrets hoved. Dette gør det muligt for forskeren at følge neuronal aktivitet i frit bevægelige dyr.

Oprindeligt blev teknikken brugt til at studere strukturel plasticitet i hippocampale neuroner. I dag, Det er gennemført i at studere neuronal aktivitet også i andre hjerneområder.