14.9K Views
•
09:34 min
•
June 19th, 2019
DOI :
June 19th, 2019
•0:04
Title
1:04
Preparation of the Imaging Cannula
2:11
Implantation of the Imaging Cannula Over the Dorsal Hippocampus
5:32
Imaging Preparation
6:16
Cannula Imaging
7:10
Results: Longitudinal Imaging of Dendritic Structure and Dendritic Spines Dynamics
8:50
Conclusion
Transcript
Deze procedure biedt herhaalde optische toegang tot de rug hippocampus van levende muizen om de mechanismen van geheugenvorming en terugroepen te bestuderen terwijl ze leertaken uitvoeren. Deze techniek maakt het gebruik van lichte microscopie mogelijk om de rug hippocampus van levende muizen op micrometerniveau ruimtelijke resolutie longitudinally over verscheidene weken te bestuderen. Geheugenverlies is een algemeen kenmerk van sommige hersenziekten zoals de ziekte van Alzheimer.
Inzicht in het mechanisme van geheugenvorming en terugroepen kan uiteindelijk helpen patiënten die lijden aan deze ziekten. Deze methode kan worden toegepast op andere diersystemen met een schedel, zoals kleine zoogdieren. Het monitoren van vitale functies tijdens een overlevingsoperatie kan zowel afleidend als stressvol zijn.
Het kan nuttig zijn om eerst de procedure voor een dood dier uit te voeren om zich te concentreren op de meer cruciale aspecten van de procedure. Om de beeldvormings canule voor te bereiden, snijdt u eerst een roestvrijstalen buis met een diameter van drie millimeter in een 1,6 millimeter lange metalen ring. Als de randen van de ring niet stomp zijn na het snijden, bestand uit de onregelmatigheden.
Gebruik vervolgens een paar tangen om een kant van de metalen ring in een UV-uitharding optische lijm te dompelen. Plaats vervolgens de metalen ring in het midden van een glazen coverslip met de zijkant van de ring bedekt met lijm aanraken van de coverslip. Zet de UV-uitharding LED-driver unit en schijn 365 nanometer golflengte licht op de lijm voor een minuut om de lijm te genezen.
Zorg ervoor dat alle zijden van de ring gelijkmatig verlicht zijn door de richting van de lichtbron te veranderen. Nadat de lijm ten minste twee uur is uitgehard, houdt u de canule van het open uiteinde van de metalen ring stevig vast door middel van een hemostat. Met behulp van een tandheelkundige boor uitgerust met een roterend bestand, bestand uit de overtollige glazen coverslip totdat het wordt gespoeld met de zijkanten van de ring.
Bereid de vereiste instrumenten voor en verdoof de muis zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Verwijder vervolgens het haar en desinfecteer de huid over het muizenhoofd. Gebruik vervolgens een schaar en tang om een kleine snede in de hoofdhuid te maken in de positie dicht bij lambda.
Beweeg zijwaarts in de richting van de oren dan rostrally in de richting van de oogbanen om een driehoek op de sagittale as te vormen ongeveer vier millimeter rostral aan bregma. Breng een druppel lidocaïne aan op de schedel. Na twee minuten, duidelijk het periosteum en droog de schedel met behulp van een wattenstaafje.
Plaats vervolgens de oorbalken om het hoofd van de muis te bevestigen. Met behulp van een micro-boor met een 0,5 millimeter breed braam, maak een klein gaatje in het frontale bot tegenover de afgebeelde hippocampus ongeveer 1,5 millimeter van de sagittale hechting en twee millimeter distal van de coronale hechting. Schroef vervolgens een roestvrijstalen botschroef van 0,86 millimeter breed in het schedelgat.
Zet het op zijn plaats met behulp van lijmcement. Laat het cement 30 seconden tot een minuut drogen. Gebruik vervolgens een trephine-boor met een diameter van drie millimeter om een klein gaatje in het pariëtale bot te maken.
Plaats het gat ongeveer 1,5 millimeter distaal van de sagittale hechting en twee millimeter distaal van de lambdoïde hechting. Verwijder voorzichtig de botflap. Verwijder vervolgens de hersenvliezen met behulp van Dumont tangen.
Ablate corticale materie om de externe capsule te bereiken. Gebruik een 19-meter stompe naald aangesloten op een vacuümpomp en bevloeien met zoutoplossing om uitdroging van het blootgestelde weefsel te voorkomen en weg te wassen alle resterende bloed na het bloeden is opgelost. Zuig corticale weefsel langzaam ongeveer 50 tot 100 micron per keer totdat de cortex loskomt van de capsule bloot de vezels van het cingulum of het corpus callosum.
Schil vervolgens voorzichtig de rugvezels tot de diepste vezels, de alveus van de hippocampus worden blootgesteld. Spoel het weefsel af met zout. Gebruik vervolgens dunne tangen om de onderste canule in zout te dompelen en deze over het schedelgat te plaatsen.
Duw vervolgens de canule in de schedel totdat de glazen coverslip in contact is met de vezels. Droog de schedel en breng een snelle lijm cement over de schedel om de canule op zijn plaats te houden. Zorg ervoor dat u ook lijm aanbrengen op de rand van de canule, maar wees voorzichtig niet te laten de lijm lopen in de canule.
Eenmaal droog, gebruik dan een stereotaxic arm om een hoofdhouder plaat positie over de canule in contact met de schedel. Bereid een mengsel van tandheelkundige acryl en breng het vervolgens over de hele schedel. Bedek de gehele blootgestelde schedel, de schroef en de open huid met gebits acryl om het preparaat te stabiliseren.
Breng na 15 minuten een verwijderbare kleeffolie aan op de hoofdhouderplaat om te voorkomen dat er vuil in de canule komt. Wanneer klaar om de hersenen beeld, opnieuw volgen in de begeleidende tekst protocol voor details over verdoving. Gebruik, eenmaal voldoende verdoofd, tangen om de kleeffolie voorzichtig van de hoofdhouderplaat te verwijderen.
Verwijder de folie voorzichtig om beschadiging van het preparaat te voorkomen. Plaats vervolgens de muis onder de microscoop over het verwarmingstapijt en bevestig de hoofdplaat aan de houder. Breng oogzalf aan op de ogen van het dier.
Reinig vervolgens de beeldvormingskanule met behulp van een spuit en een dunne naald om gedeïoniseerd water in de canule te laten vallen, gevolgd door verwijdering met een vacuümpomp. Gebruik doelstellingen voor een lage vergroting op lange werkafstand om de canule visueel te controleren op restwater, vuil, integriteit en de aanwezigheid van fluorescentie. Vervolgens lijn de canule op de optische as door het aanpassen van de hoeken van de hoofdhouder armen.
Schakel over naar een 25X-doelstelling met een numeriek diafragma van 1.0 en een werkafstand van vier millimeter. Voeg vervolgens voldoende gedeïsized water toe aan de canule om het te vullen en overtollig water op de top van de canule te behouden. Gebruik ten slotte twee fotonexcitatie en beeld de fluorescentiesignalen.
Hier getoond is een 2P beeld stapel van een thy1-GFP transgene muis hersenen. Thy1-GFP muizen uiten cytoplasma verbeterde GFP onder de controle van de Thy1 promotor in een schaarse willekeurige populatie van piramidale neuronen. Over het algemeen staat de belangrijkste as van piramidale neuronen in de rug hippocampal CA1 ongeveer loodrecht op het XY-beeldvormingsvlak.
Deze gebieden worden handmatig toegewezen aan een driedimensionale lage vergrotingsstapel met het patroon van GFP-expressie in het volume onder de beeldvormingsblikule. Voor longitudinale tracking worden verschillende hersengebieden binnen het gezichtsveld van de canule gedefinieerd. Elke regio komt overeen met een gebied van ongeveer 240 bij 240 micrometer en bevat tussen één en zeven dendritische segmenten.
De afgebeelde serie hier toont een micrometer z-stap beeld stapels CA1 piramidale neuronen en basale dendrieten verworven op verschillende tijdsintervallen gedurende 14 dagen. Echter, langere beeldvorming duur en intervallen zijn mogelijk. Hoewel de meeste beelden van dendritische stekels in de stratum oriens zijn, is het ook mogelijk om dendritische stekels in de schuine dendrieten van het stratum radiatum te beelden.
Een andere uitbreiding van deze techniek is om beeldactiviteit-opgeroepen plasticiteit in CA1 piramidale neuronen door het injecteren van de dorsale CA1 hippocampal gebied met een virale vector. Dit zorgt voor de plasticiteit van honderden CA1 piramidale neuronen in elk dier te meten hier weergegeven als een 2P-beeldstapel. Het is van cruciaal belang om schade aan de hippocampus te voorkomen bij het verwijderen van het bovengaande weefsel.
Bovendien moet men de canule correct plaatsen om een stabiele voorbereiding te garanderen. De beschreven voorbereiding maakt het gebruik van verschillende soorten optische beeldvorming mogelijk, zoals miniatuurmicroscopen die op het hoofd van het dier kunnen worden geïmplanteerd. Dit stelt de onderzoeker in staat om neuronale activiteit te volgen in vrij bewegende dieren.
Oorspronkelijk werd de techniek gebruikt om structurele plasticiteit in hippocampal neuronen te bestuderen. Vandaag, het wordt uitgevoerd in het bestuderen van neuronale activiteit ook in andere hersengebieden.
Deze methode beschrijft een chronische voorbereiding die optische toegang tot de hippocampus van levende muizen mogelijk maakt. Deze voorbereiding kan worden gebruikt voor het uitvoeren van longitudinale optische beeldvorming van neuronale structurele plasticiteit en activiteit-opgeroepen cellulaire plasticiteit over een periode van enkele weken.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved