Längs-Zwei-Photon-Bildgebung des Dorsal Hippocampal CA1 in lebenden Mäusen

Dieses Verfahren bietet wiederholten optischen Zugang zum dorsalen Hippocampus von lebenden Mäusen, um die Mechanismen der Gedächtnisbildung und des Erinnerns zu untersuchen, während sie Lernaufgaben ausführen. Diese Technik ermöglicht den Einsatz von Lichtmikroskopie, um den dorsalen Hippocampus lebender Mäuse auf Mikrometerebene über mehrere Wochen längs zu untersuchen. Gedächtnisverlust ist ein allgemeines Kennzeichen einiger Gehirnerkrankungen wie Alzheimer-Krankheit.

Das Verständnis des Mechanismus der Gedächtnisbildung und des Rückrufs könnte letztlich Patienten helfen, die an diesen Krankheiten leiden. Diese Methode könnte auf andere Tiersysteme mit einem Schädel wie kleine Säugetiere angewendet werden. Die Überwachung von Vitalzeichen während einer Überlebensoperation kann sowohl ablenkend als auch stressig sein.

Es könnte nützlich sein, zuerst das Verfahren an einem toten Tier durchzuführen, um sich auf die wichtigeren Aspekte des Verfahrens zu konzentrieren. Zur Vorbereitung der Bildkanüle schneiden Sie zunächst ein Edelstahlrohr mit drei Millimetern Durchmesser in einen 1,6 Millimeter langen Metallring. Wenn die Ränder des Rings nach dem Schneiden nicht stumpf sind, melden Sie die Unregelmäßigkeiten auf.

Als nächstes verwenden Sie ein Paar Zangen, um eine Seite des Metallrings in einen UV-härtenden optischen Klebstoff zu tauchen. Positionieren Sie dann den Metallring in der Mitte eines Glasdeckels mit der Seite des Rings, die mit Klebstoff bedeckt ist und den Deckel schlupf. Schalten Sie die UV-aushärtende LED-Treibereinheit ein und leuchten Sie 365 Nanometer Wellenlängenlicht für eine Minute auf den Klebstoff, um den Klebstoff auszuhärten.

Stellen Sie sicher, dass alle Seiten des Rings gleichmäßig beleuchtet sind, indem Sie die Richtung der Lichtquelle ändern. Nachdem der Klebstoff mindestens zwei Stunden gehärtet hat, halten Sie die Kanüle vom offenen Ende des Metallrings mit Hilfe eines Hämostats fest. Mit einem Zahnbohrer mit einer rotierenden Datei ausgestattet, Datei aus dem überschüssigen Glas Abdeckung, bis es mit den Seiten des Rings gespült wird.

Bereiten Sie die erforderlichen Instrumente vor und beastheisieren Sie die Maus, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Dann entfernen Sie das Haar und desinfizieren Sie die Haut über den Mauskopf. Als nächstes verwenden Sie Schere und Zange, um einen kleinen Schnitt in der Kopfhaut in der Position in der Nähe von Lambda zu machen.

Bewegen Sie sich seitlich in Richtung der Ohren und dann rostral in Richtung der Augenbahnen, um ein Dreieck auf der sagittalen Achse etwa vier Millimeter rostral zu bregma zu bilden. Tragen Sie einen einzigen Tropfen Lidocain auf den Schädel auf. Nach zwei Minuten das Periost eimeren und den Schädel mit einem Wattestäbchen trocknen.

Positionieren Sie dann die Ohrstangen, um den Kopf der Maus zu fixieren. Mit einem Mikrobohrer mit einem 0,5 Millimeter breiten Grat, machen Sie ein kleines Loch im Frontalknochen gegenüber dem abgebildeten Hippocampus etwa 1,5 Millimeter von der sagittalen Naht und zwei Millimeter distal aus der koronalen Naht. Dann eine 0,86 Millimeter breite Edelstahl-Knochenschraube in das Schädelloch schrauben.

Sichern Sie es mit Klebezement an Ort und Stelle. Lassen Sie den Zement für 30 Sekunden bis eine Minute trocknen. Als nächstes verwenden Sie einen Trephinbohrer mit drei Millimetern Durchmesser, um ein kleines Loch im parietalen Knochen zu machen.

Positionieren Sie das Loch etwa 1,5 Millimeter distal von der sagittalen Naht und zwei Millimeter distal aus der Lambdoid-Naht. Entfernen Sie vorsichtig die Knochenklappe. Dann entfernen Sie die Meninges mit Dumont Zange.

Ablate kortikale Materie, um die externe Kapsel zu erreichen. Verwenden Sie eine 19 Gauge stumpfe Nadel, die mit einer Vakuumpumpe verbunden ist, und bewässern Sie mit Derinline, um eine Austrocknung des exponierten Gewebes zu vermeiden und Restblut nach der Entlösung der Blutung wegzuwaschen. Saugen Kortikalgewebe langsam etwa 50 bis 100 Mikrometer auf einer Zeit, bis der Kortex von der Kapsel ablöst, die die Fasern des Cingulums oder des Corpus callosum freisetzt.

Dann schälen Sie die Rückenfasern vorsichtig, bis die tiefsten Fasern, der Alveus des Hippocampus ausgesetzt sind. Wenn Sie fertig sind, spülen Sie das Gewebe mit Saline ab. Als nächstes verwenden Sie dünne Zangen, um die untere Kanüle in die Saline zu tauchen und sie über dem Schädelloch zu positionieren.

Dann drücken Sie die Kanüle in den Schädel, bis der Glasdeckel in Kontakt mit den Fasern ist. Trocknen Sie den Schädel und tragen Sie einen schnellen Klebstoffzement über den Schädel, um die Kanüle an Ort und Stelle zu halten. Achten Sie darauf, auch Klebstoff auf den Rand der Kanüle auftragen, aber achten Sie darauf, den Klebstoff nicht in die Kanüle laufen zu lassen.

Nach dem Trocknen verwenden Sie einen stereotaxic Arm, um eine Kopfhalterplatte über der Kanüle in Kontakt mit dem Schädel zu positionieren. Bereiten Sie eine Mischung aus Zahnacryl vor und tragen Sie es dann über den gesamten Schädel auf. Bedecken Sie den gesamten freiliegenden Schädel, die Schraube und die offene Haut mit Zahnacryl, um das Präparat zu stabilisieren.

Nach 15 Minuten eine abnehmbare Klebefolie auf die Kopfhalterplatte auftragen, um zu verhindern, dass Schmutz in die Kanüle gelangt. Wenn Sie bereit sind, das Gehirn abzubilden, folgen Sie erneut im begleitenden Textprotokoll, um Details zur Anästhesisierung zu erhalten. Nach ausreichend sediert, verwenden Sie Zange, um den Klebefilm vorsichtig von der Kopfhalterplatte zu entfernen.

Entfernen Sie den Film vorsichtig, um eine Beschädigung der Zubereitung zu vermeiden. Als nächstes positionieren Sie die Maus unter dem Mikroskop über dem Heizteppich und befesten die Kopfplatte am Halter. Tragen Sie die Augensalbe auf die Augen des Tieres auf.

Reinigen Sie dann die bildgebende Kanüle mit einer Spritze und einer dünnen Nadel, um deionisiertes Wasser in die Kanüle zu werfen, gefolgt von der Entfernung mit einer Vakuumpumpe. Verwenden Sie Ziele mit geringer Vergrößerung über lange Arbeitswege, um die Kanüle visuell auf Restwasser, Schmutz, Integrität und das Vorhandensein von Fluoreszenz zu überprüfen. Richten Sie dann die Kanüle an der optischen Achse aus, indem Sie die Winkel der Kopfhalterarme anpassen.

Wechseln Sie zu einem 25-fachen Objektiv mit einer numerischen Blende von 1,0 und einem Arbeitsabstand von vier Millimetern. Dann fügen Sie genug entionisiertes Wasser in die Kanüle, um es zu füllen und überschüssiges Wasser auf der Kanüle zu halten. Schließlich verwenden Sie zwei Photonen anregung und bilden die Fluoreszenzsignale.

Hier ist ein 2P-Bildstapel aus einem transgenen Maushirn von thy1-GFP zu sehen. Thy1-GFP-Mäuse drücken zytoplasmisch verbessertes GFP unter der Kontrolle des Thy1-Promotors in einer spärlichen zufälligen Population von pyramidenförmigen Neuronen aus. Im Allgemeinen ist die Hauptachse der pyramidenförmigen Neuronen im dorsalen Hippocampus CA1 in etwa senkrecht zur XY-Bildebene.

Diese Bereiche werden manuell einem dreidimensionalen Stapel mit geringer Vergrößerung zugeordnet, der das Muster der GFP-Expression in der Lautstärke unterhalb der bildgebenden Kanüle anzeigt. Für die Längsspurenverfolgung werden mehrere Hirnregionen im Sichtfeld der Kanüle definiert. Jede Region entspricht einer Fläche von etwa 240 mal 240 Mikrometern und enthält zwischen einem und sieben dendritischen Segmenten.

Die abgebildete Serie zeigt hier einen Mikrometer-Z-Schritt-Bildstapel von CA1-Pyramidenneuronen und Basaldendriten, die in verschiedenen Zeitintervallen für 14 Tage aufgenommen wurden. Längere Bildgebungsdauern und Intervalle sind jedoch möglich. Obwohl die meisten Bilder von dendritischen Stacheln in den Stratum-Oriens sind, ist es auch möglich, dendritische Stacheln in den schrägen Dendriten der Stratum radiatum abzubilden.

Eine weitere Erweiterung dieser Technik ist das Bild aktivitätsevoziert Plastizität in CA1 pyramidenförmigen Neuronen durch Injektion der dorsalen CA1 HippocampusBereich mit einem viralen Vektor. Dies ermöglicht es, die Plastizität von Hunderten von CA1 Pyramidenneuronen in jedem Tier hier als 2P-Bildstapel zu messen. Es ist entscheidend, Schäden am Hippocampus beim Entfernen des darüber liegenden Gewebes zu verhindern.

Zusätzlich sollte man die Kanüle richtig platzieren, um eine stabile Zubereitung zu gewährleisten. Das beschriebene Präparat ermöglicht den Einsatz verschiedener Arten von optischer Bildgebung, wie Miniaturmikroskope, die auf den Kopf des Tieres implantiert werden können. Dies ermöglicht es dem Forscher, neuronale Aktivität bei frei beweglichen Tieren zu verfolgen.

Ursprünglich wurde die Technik verwendet, um strukturelle Plastizität in Hippocampus-Neuronen zu studieren. Heute, Es ist in der Untersuchung neuronaler Aktivität auch in anderen Gehirnbereichen implementiert.