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June 19th, 2019
DOI :
June 19th, 2019
•0:04
Title
1:04
Preparation of the Imaging Cannula
2:11
Implantation of the Imaging Cannula Over the Dorsal Hippocampus
5:32
Imaging Preparation
6:16
Cannula Imaging
7:10
Results: Longitudinal Imaging of Dendritic Structure and Dendritic Spines Dynamics
8:50
Conclusion
Transcript
यह प्रक्रिया स्मृति गठन के तंत्र का अध्ययन करने और सीखने के कार्यों को पूरा करने के लिए जीवित चूहों के पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस तक बार-बार ऑप्टिकल पहुंच प्रदान करती है। यह तकनीक कई हफ्तों में माइक्रोमीटर स्तर स्थानिक संकल्प पर जीवित चूहों के पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस का अध्ययन करने के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी के उपयोग की अनुमति देती है। याददाश्त में कमी अल्जाइमर रोग जैसे मस्तिष्क की कुछ बीमारियों की सामान्य पहचान है।
स्मृति गठन और याद के तंत्र को समझना अंततः इन रोगों से पीड़ित रोगियों की मदद कर सकता है । इस विधि को छोटे स्तनधारियों जैसे खोपड़ी के साथ अन्य पशु प्रणालियों पर लागू किया जा सकता है। एक अस्तित्व सर्जरी के दौरान महत्वपूर्ण संकेतों की निगरानी दोनों ध्यान भंग और तनावपूर्ण हो सकता है ।
प्रक्रिया के अधिक महत्वपूर्ण पहलुओं पर ध्यान केंद्रित करने के लिए पहले मृत जानवर पर प्रक्रिया करना उपयोगी हो सकता है। इमेजिंग कैनुला तैयार करने के लिए, पहले एक तीन मिलीमीटर व्यास स्टेनलेस स्टील ट्यूब को 1.6 मिलीमीटर लंबी धातु की अंगूठी में काटें। यदि काटने के बाद अंगूठी के किनारे कुंद नहीं हैं, तो अनियमितताओं को दर्ज करें।
इसके बाद, धातु की अंगूठी के एक तरफ को यूवी इलाज ऑप्टिकल चिपकने वाले में डुबकी लगाने के लिए संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें। फिर एक ग्लास कवरलिप के केंद्र में धातु की अंगूठी को चिपकने वाले कवरस्लिप को छूते हुए चिपकने वाली अंगूठी के किनारे के साथ रखें। यूवी इलाज एलईडी ड्राइवर इकाई चालू करें और चिपकने वाले को ठीक करने के लिए चिपकने वाले पर 365 नैनोमीटर तरंगदैर्ध्य प्रकाश को चमकाएं।
सुनिश्चित करें कि अंगूठी के सभी पक्षों को समान रूप से प्रकाश स्रोत की दिशा बदलने से प्रकाशित कर रहे हैं। चिपकने के बाद कम से कम दो घंटे के लिए कठोर हो गया है, मजबूती से एक हीमोस्टेट के माध्यम से धातु की अंगूठी के खुले छोर से कैनुला पकड़ो। एक घूर्णन फ़ाइल के साथ लगे एक दंत ड्रिल का उपयोग करना, अतिरिक्त ग्लास कवरलिप को तब तक फाइल करें जब तक कि इसे अंगूठी के किनारों के साथ फ्लश न किया जाए।
आवश्यक उपकरणों को तैयार करें और माउस को एनेस्थेटाइज करें जैसा कि साथ पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित है। इसके बाद बालों को हटा दें और माउस सिर के ऊपर त्वचा को कीटाणुरहित करें। इसके बाद, लैम्ब्डा के करीब की स्थिति में खोपड़ी में एक छोटा सा कट बनाने के लिए कैंची और संदंश का उपयोग करें।
कानों की दिशा में पार्श्व में ले जाएं फिर आंखों की कक्षाओं की दिशा में एक त्रिकोण बनाने के लिए शिथिल धुरी पर लगभग चार मिलीमीटर रोस्ट्रल को ब्रेग्मा के लिए। खोपड़ी में लिडोकेन की एक बूंद लगाएं। दो मिनट के बाद, पेरिओस्टियम को साफ करें और कपास झाड़ू का उपयोग करके खोपड़ी को सुखा लें।
फिर माउस के सिर को ठीक करने के लिए कान की सलाखों की स्थिति। 0.5 मिलीमीटर चौड़ाई बर्र के साथ एक माइक्रो ड्रिल का उपयोग करना, इमेज्ड हिप्पोकैम्पस के सामने ललाट हड्डी में एक छोटा छेद बनाना सागितल सीवन से लगभग 1.5 मिलीमीटर और कोरोनल सीवन से दो मिलीमीटर डिस्टल। फिर खोपड़ी छेद में एक 0.86 मिलीमीटर चौड़ाई स्टेनलेस स्टील की हड्डी पेंच पेंच।
चिपकने वाले सीमेंट का उपयोग करके इसे जगह में सुरक्षित करें। सीमेंट को 30 सेकंड से एक मिनट तक सूखने दें। इसके बाद, पैराशियल बोन में एक छोटा छेद बनाने के लिए तीन मिलीमीटर व्यास ट्रेफिन ड्रिल का उपयोग करें।
छेद लगभग 1.5 मिलीमीटर डिस्टल को सैगिटल सीवन से और लैम्ब्डॉइड सीवन से दो मिलीमीटर डिस्टल रखें। सावधानी से हड्डी फ्लैप निकालें। फिर डुमोंट संदंश का उपयोग करके मेनिंग्स को हटा दें।
बाहरी कैप्सूल तक पहुंचने के लिए कॉर्टिकल मैटर को Ablate करें। एक वैक्यूम पंप से जुड़े एक 19 गेज कुंद सुई का प्रयोग करें और उजागर ऊतक के निर्जलीकरण से बचने के लिए खारा के साथ सिंचाई और दूर किसी भी अवशिष्ट रक्त धोने के बाद रक्तस्राव हल हो गया है । कॉर्टिकल ऊतक को धीरे-धीरे एक समय में लगभग 50 से 100 माइक्रोन चूसता है जब तक कि कैप्सूल से कॉर्टेक्स डिटैक्स सिंगुलम या कॉर्पस कैलोसम के फाइबर को उजागर नहीं करता है।
फिर ध्यान से पृष्ठीय फाइबर छील जब तक गहरे फाइबर, हिप्पोकैम्पस के alveus उजागर कर रहे हैं। समाप्त होने पर, नमकीन के साथ ऊतक कुल्ला। इसके बाद, नीचे कैनुला को खारे में डुबकी लगाने और खोपड़ी के छेद पर स्थिति में रखने के लिए पतले संदंश का उपयोग करें।
फिर कैनुला को खोपड़ी में तब तक धकेलें जब तक कि ग्लास कवरलिप फाइबर के संपर्क में न हो जाए। खोपड़ी को सुखाएं और कैनुला को जगह में रखने के लिए खोपड़ी पर एक त्वरित चिपकने वाला सीमेंट लागू करें। कैनुला के रिम पर चिपकने वाला भी लागू करना सुनिश्चित करें लेकिन सावधान रहें कि चिपकने वाले को कैनुला में न चलने दें।
एक बार सूखने के बाद, खोपड़ी के संपर्क में कैनुला पर एक सिर धारक प्लेट की स्थिति के लिए एक स्टीरियोटैक्सिक आर्म का उपयोग करें। डेंटल ऐक्रेलिक का मिश्रण तैयार करें और फिर इसे पूरे कपाल में लगाएं। तैयारी को स्थिर करने के लिए पूरी उजागर खोपड़ी, पेंच और दंत ऐक्रेलिक के साथ खुली त्वचा को कवर करें।
15 मिनट के बाद, मलबे को कैनुला में प्रवेश करने से रोकने के लिए हेड होल्डर प्लेट पर एक हटाने योग्य चिपकने वाली फिल्म लागू करें। मस्तिष्क की छवि के लिए तैयार होने पर, फिर से एनेस्थेटाइजेशन पर विवरण के लिए साथ पाठ प्रोटोकॉल में पालन करें। एक बार पर्याप्त रूप से बेहोश होने के बाद, हेड होल्डर प्लेट से चिपकने वाली फिल्म को ध्यान से हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें।
तैयारी को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए फिल्म को धीरे से हटा दें। इसके बाद, हीटिंग कार्पेट पर माइक्रोस्कोप के नीचे माउस की स्थिति रखें और धारक को सिर की प्लेट सुरक्षित करें। जानवर की आंखों पर आंखों का मरहम लगाएं।
फिर एक सिरिंज और एक पतली सुई का उपयोग करके इमेजिंग कैनुला को साफ करें ताकि कैनुला में डिओनाइज्ड पानी को छोड़ दिया जा सके और इसके बाद वैक्यूम पंप के साथ हटाने के बाद। अवशिष्ट पानी, गंदगी, अखंडता और फ्लोरेसेंस की उपस्थिति के लिए कैनुला की जांच करने के लिए कम आवर्धन लंबी कार्य दूरी के उद्देश्यों का उपयोग करें। फिर हेड होल्डर आर्म्स के कोणों को एडजस्ट करके कैनुला को ऑप्टिक एक्सिस में संरेखित करें।
1.0 न्यूमेरिकल अपर्चर और चार मिलीमीटर काम करने की दूरी के साथ 25X उद्देश्य पर स्विच करें। फिर इसे भरने और कैनुला के शीर्ष पर अतिरिक्त पानी बनाए रखने के लिए कैनुला में पर्याप्त डिएकोनाइज्ड पानी जोड़ें। अंत में, दो फोटॉन उत्तेजन का उपयोग करें और फ्लोरेसेंस संकेतों की छवि करें।
यहां दिखाया गया है एक thy1-GFP ट्रांसजेनिक माउस मस्तिष्क से एक 2P छवि ढेर है । Thy1-GFP चूहों एक्सप्रेस साइटोप्लाज्मिक ने पिरामिड न्यूरॉन्स की विरल यादृच्छिक आबादी में Thy1 प्रमोटर के नियंत्रण में जीएफपी बढ़ाया। आम तौर पर, पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस CA1 में पिरामिड न्यूरॉन्स की प्रमुख धुरी मोटे तौर पर XY इमेजिंग विमान के लिए लंबवत है।
इन क्षेत्रों को मैन्युअल रूप से इमेजिंग कैनुला के नीचे की मात्रा में जीएफपी अभिव्यक्ति के पैटर्न को दिखाने वाले कम आवर्धन त्रि-आयामी ढेर में मैप किया जाता है। देशांतर ट्रैकिंग के लिए, कैनुला के दृश्य के क्षेत्र के भीतर कई मस्तिष्क क्षेत्रों को परिभाषित किया गया है। प्रत्येक क्षेत्र लगभग 240 के क्षेत्र से 240 माइक्रोमीटर से मेल खाता है और इसमें एक और सात डेंड्रिटिक सेगमेंट शामिल हैं।
यहां इमेज्ड श्रृंखला 14 दिनों के लिए अलग-अलग समय अंतराल पर अधिग्रहीत CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स और बेसल डेनड्राइट्स के एक माइक्रोमीटर जेड-स्टेप इमेज स्टैक दिखाती है। हालांकि, लंबी इमेजिंग अवधि और अंतराल संभव हैं। यद्यपि अधिकांश छवियां स्ट्रैटम ओरियंस में डेंड्रिटिक कताई की होती हैं, फिर भी स्ट्रैटम रेडिएटम के तिरछे डेनड्राइट्स में डेंड्रिटिक कताई की छवि संभव है।
इस तकनीक का एक और विस्तार एक वायरल वेक्टर के साथ पृष्ठीय CA1 हिप्पोकैम्पल क्षेत्र इंजेक्शन द्वारा CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स में छवि गतिविधि पैदा प्लास्टिसिटी के लिए है । यह प्रत्येक जानवर में CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स के सैकड़ों की प्लास्टिसिटी के लिए एक 2P छवि ढेर के रूप में यहां दिखाया जा करने के लिए अनुमति देता है । ओवरलीटिंग टिश्यू को हटाते समय हिप्पोकैम्पस को नुकसान से रोकना महत्वपूर्ण है।
इसके अतिरिक्त, एक स्थिर तैयारी सुनिश्चित करने के लिए कैनुला को सही ढंग से रखना चाहिए। वर्णित तैयारी विभिन्न प्रकार के ऑप्टिकल इमेजिंग जैसे लघु माइक्रोस्कोप के उपयोग के लिए अनुमति देती है जिन्हें जानवर के सिर पर प्रत्यारोपित किया जा सकता है। यह शोधकर्ता को स्वतंत्र रूप से चलती जानवरों में न्यूरोनल गतिविधि का पालन करने की अनुमति देता है।
मूल रूप से, तकनीक का उपयोग हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स में संरचनात्मक प्लास्टिसिटी का अध्ययन करने के लिए किया गया था। आज, यह अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों में भी न्यूरोनल गतिविधि का अध्ययन करने में लागू किया जाता है।
इस विधि एक पुरानी तैयारी है कि रहने वाले चूहों के हिप्पोकैम्पस के लिए ऑप्टिकल का उपयोग की अनुमति देता है का वर्णन करता है. इस तैयारी के लिए न्यूरोनल संरचनात्मक प्लास्टिक और गतिविधि के अनुदैर्घ्य ऑप्टिकल इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कई हफ्तों की अवधि में सेलुलर plasticity evoked.
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