14.9K Views
•
09:34 min
•
June 19th, 2019
DOI :
June 19th, 2019
•0:04
Title
1:04
Preparation of the Imaging Cannula
2:11
Implantation of the Imaging Cannula Over the Dorsal Hippocampus
5:32
Imaging Preparation
6:16
Cannula Imaging
7:10
Results: Longitudinal Imaging of Dendritic Structure and Dendritic Spines Dynamics
8:50
Conclusion
Transcript
Denne prosedyren gir gjentatt optisk tilgang til den dorsale hippocampus av levende mus for å studere mekanismene for minnedannelse og tilbakekalling mens de utfører læringsoppgaver. Denne teknikken gjør det mulig å bruke lett mikroskopi til å studere den dorsale hippocampus av levende mus ved mikrometernivå romlig oppløsning langsgående over flere uker. Hukommelsestap er et generelt kjennetegn på noen hjernesykdommer som Alzheimers sykdom.
Å forstå mekanismen for minnedannelse og tilbakekalling kan til slutt hjelpe pasienter som lider av disse sykdommene. Denne metoden kan brukes på andre dyresystemer med en hodeskalle som små pattedyr. Overvåking av vitale tegn under en overlevelsesoperasjon kan være både distraherende og stressende.
Det kan være nyttig å først utføre prosedyren på et dødt dyr for å fokusere på de mer avgjørende aspektene ved prosedyren. For å forberede bildekanylen, kutt først et tre millimeter diameter rustfritt stålrør i en 1,6 millimeter lang metallring. Hvis kantene på ringen ikke er sløve etter kutting, fil ut uregelmessigheter.
Deretter bruker du et par tang til å dyppe den ene siden av metallringen i et UV-herde optisk lim. Plasser deretter metallringen i midten av et glassdekslerlips med siden av ringen dekket av klebemiddel som berører dekkslipsen. Slå på UV-herdings-LED-driverenheten og skinne 365 nanometer bølgelengdelys på limet i ett minutt for å kurere limet.
Kontroller at alle sidene av ringen er like opplyst ved å endre lyskildens retning. Etter at limet har herdet i minst to timer, hold kanylen fast fra den åpne enden av metallringen ved hjelp av en hemostat. Bruk en tannbor utstyrt med en roterende fil, fil av overflødig glass deksler til den er spylt med sidene av ringen.
Forbered de nødvendige instrumentene og bedøv musen som beskrevet i den medfølgende tekstprotokollen. Fjern deretter håret og desinfiser huden over musehodet. Deretter bruker du saks og tang for å lage et lite kutt i hodebunnen i posisjonen nær lambda.
Flytt sideveis i retning av ørene deretter rostrally i retning av øyet baner for å danne en trekant på sagittal aksen ca fire millimeter rostral til bregma. Påfør en enkelt dråpe lidokain på skallen. Etter to minutter, fjern periosteum og tørk skallen ved hjelp av en bomullspinne.
Plasser deretter ørelinjene for å fikse musens hode. Ved hjelp av en mikro drill med en 0,5 millimeter bredde burr, gjør et lite hull i frontbenet overfor den avbildede hippocampus ca 1,5 millimeter fra sagittal sutur og to millimeter distal fra koronal sutur. Skru deretter en 0,86 millimeter bredde rustfritt stål beinskrue inn i skallen hullet.
Fest den på plass ved hjelp av klebende sement. La sementen tørke i 30 sekunder til et minutt. Deretter bruker du en trephinedrill med trefin med trefin i trefin med trefin i trefin.
Plasser hullet ca 1,5 millimeter distal fra sagittal sutur og to millimeter distal fra lambdoid sutur. Fjern beinklaffen forsiktig. Fjern deretter meningene ved hjelp av Dumont-tang.
Ablate kortikal materie for å nå den eksterne kapselen. Bruk en 19 gauge stump nål koblet til en vakuumpumpe og vanne med saltvann for å unngå dehydrering av det eksponerte vevet og vaske bort eventuelle gjenværende blod etter at blødningen er løst. Sug kortikal vev sakte ca 50 til 100 mikron om gangen til cortex løsner fra kapselen utsette fibrene i cingulum eller corpus callosum.
Deretter skreller du forsiktig dorsale fibre til de dypeste fibrene, alveus av hippocampus er utsatt. Når du er ferdig, skyll vevet med saltvann. Deretter bruker du tynne tang til å dyppe bunn kanylen i saltvann og plassere den over skallehullet.
Skyv deretter kanylen inn i skallen til glassdeksleglasset er i kontakt med fibrene. Tørk skallen og påfør en rask klebende sement over skallen for å holde kanylen på plass. Pass også på å bruke lim på kanten av kanylen, men vær forsiktig så du ikke lar limet løpe inn i kanylen.
Når den er tørr, bruk en stereotaksisk arm til å plassere en hodeholderplate over kanylen i kontakt med skallen. Forbered en blanding av tannakryl og bruk den deretter over hele kraniet. Dekk hele den eksponerte skallen, skruen og den åpne huden med tannakryl for å stabilisere preparatet.
Etter 15 minutter, påfør en avtagbar klebefilm på hodeholderplaten for å hindre at rusk kommer inn i kanylen. Når du er klar til å bilde hjernen, følger du igjen med i den medfølgende tekstprotokollen for detaljer om bedøvelse. Når den er tilstrekkelig sedert, bruk tang til å forsiktig fjerne klebefilmen fra hodeholderplaten.
Fjern filmen forsiktig for å unngå å skade preparatet. Deretter plasserer du musen under mikroskopet over varmeteppet og fester hodeplaten til holderen. Påfør øyesalve på dyrets øyne.
Rengjør deretter bildekanylen ved hjelp av en sprøyte og en tynn nål for å slippe avionisert vann inn i kanylen etterfulgt av fjerning med en vakuumpumpe. Bruk mål for lang arbeidstid med lav forstørrelse for å visuelt kontrollere kanylen for gjenværende vann, smuss, integritet og tilstedeværelse av fluorescens. Juster deretter kanylen til optisk akse ved å justere vinklene på hodeholderarmene.
Bytt til et 25X-mål med en 1,0 numerisk blenderåpning og en fire millimeter arbeidsavstand. Tilsett deretter nok deionisert vann til kanylen for å fylle den og opprettholde overflødig vann på toppen av kanylen. Til slutt, bruk to foton eksitasjon og bilde fluorescens signaler.
Vist her er en 2P bildestabel fra en thy1-GFP transgen musehjerne. Thy1-GFP-mus uttrykker cytoplasmatisk forbedret GFP under kontroll av Thy1-promotoren i en sparsom tilfeldig populasjon av pyramidale nevroner. Vanligvis er den viktigste aksen av pyramidale nevroner i den dorsale hippocampal CA1 omtrent vinkelrett på XY bildeplan.
Disse områdene tilordnes manuelt til en tredimensjonal stabel med lav forstørrelse som viser mønsteret for GFP-uttrykk i volumet under bildekanylen. For langsgående sporing defineres flere hjerneregioner innenfor synsfeltet til kanylen. Hver region tilsvarer et område på ca 240 av 240 mikrometer og inneholder mellom ett og syv dendrittiske segmenter.
Den avbildede serien her viser en mikrometer z-trinns bilde stabler av CA1 pyramidale nevroner og basale dendritt ervervet med forskjellige tidsintervaller i 14 dager. Lengre bildevarigheter og intervaller er imidlertid mulig. Selv om de fleste bildene er av dendrittiske spines i stratum oriens, er det også mulig å bilde dendrittiske spines i de skrå dendrittene i stratum radiatum.
En annen forlengelse av denne teknikken er å bilde aktivitet-fremkalt plastisitet i CA1 pyramidale nevroner ved å injisere dorsal CA1 hippocampal området med en viral vektor. Dette gjør det mulig for plastisitet av hundrevis av CA1 pyramidale nevroner i hvert dyr som skal måles her som en 2P bildestakk. Det er avgjørende å forhindre skade på hippocampus når du fjerner det overliggende vevet.
I tillegg bør man plassere kanylen riktig for å sikre et stabilt preparat. Det beskrevne preparatet muliggjør bruk av ulike typer optisk avbildning som miniatyrmikroskop som kan implanteres på dyrets hode. Dette gjør det mulig for forskeren å følge nevronal aktivitet i fritt bevegelige dyr.
Opprinnelig ble teknikken brukt til å studere strukturell plastisitet i hippocampal nevroner. I dag er det implementert i å studere nevronal aktivitet også i andre hjerneområder.
Denne metoden beskriver en kronisk forberedelse som tillater optisk tilgang til hippocampus av levende mus. Dette preparatet kan brukes til å utføre langsgående optisk avbildning av neuronal strukturelle plastisitet og aktivitet-fremkalt cellulær plastisitet over en periode på flere uker.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved