Imágenes longitudinales de dos fotones del hipocampo dorsal CA1 en ratones vivos

Este procedimiento proporciona acceso óptico repetido al hipocampo dorsal de ratones vivos para estudiar los mecanismos de formación de la memoria y la memoria mientras realizan tareas de aprendizaje. Esta técnica permite el uso de microscopía de luz para estudiar el hipocampo dorsal de ratones vivos a nivel de micrómetro de resolución espacial longitudinalmente durante varias semanas. La pérdida de memoria es un sello general de algunas enfermedades cerebrales como la enfermedad de Alzheimer.

Comprender el mecanismo de formación de la memoria y la memoria podría ayudar en última instancia a los pacientes que sufren de estas enfermedades. Este método podría aplicarse a otros sistemas animales con un cráneo como pequeños mamíferos. Monitorear los signos vitales durante una cirugía de supervivencia puede ser tanto distraído como estresante.

Podría ser útil realizar primero el procedimiento en un animal muerto con el fin de centrarse en los aspectos más cruciales del procedimiento. Para preparar la cánula de imagen, primero corte un tubo de acero inoxidable de tres milímetros de diámetro en un anillo metálico de 1,6 milímetros de largo. Si los bordes del anillo no son contundentes después del corte, archiva las irregularidades.

A continuación, utilice un par de fórceps para sumergir un lado del anillo metálico en un adhesivo óptico de curado UV. A continuación, coloque el anillo de metal en el centro de un cubreobjetos de vidrio con el lado del anillo cubierto por adhesivo que toca el cubreobjetos. Encienda la unidad controladora LED de curado UV y brille la luz de longitud de onda de 365 nanómetros sobre el adhesivo durante un minuto para curar el adhesivo.

Asegúrese de que todos los lados del anillo estén igualmente iluminados cambiando la dirección de la fuente de luz. Después de que el adhesivo se haya endurecido durante al menos dos horas, sostenga firmemente la cánula desde el extremo abierto del anillo metálico por medio de un estado. Usando un taladro dental equipado con un archivo giratorio, archiva el exceso de tapa de vidrio hasta que se enjuague con los lados del anillo.

Prepare los instrumentos necesarios y anestesice el ratón como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, retire el cabello y desinfecte la piel sobre la cabeza del ratón. A continuación, usa tijeras y fórceps para hacer un pequeño corte en el cuero cabelludo en la posición cercana a lambda.

Moverse lateralmente en la dirección de las orejas y luego rostralmente en la dirección de las órbitas oculares para formar un triángulo en el eje sagital aproximadamente cuatro milímetros rostral a bregma. Aplicar una sola gota de lidocaína en el cráneo. Después de dos minutos, despeja el periosteo y seque el cráneo con un hisopo de algodón.

A continuación, coloque las barras de las orejas para fijar la cabeza del ratón. Usando un micro taladro con una rebaba de 0,5 milímetros de ancho, haz un pequeño agujero en el hueso frontal frente al hipocampo imageado aproximadamente a 1,5 milímetros de la sutura sagital y dos milímetros distales de la sutura coronal. A continuación, atornille un tornillo de hueso de acero inoxidable de 0,86 milímetros de ancho en el orificio del cráneo.

Asegúrelo en su lugar con cemento adhesivo. Deje que el cemento se seque durante 30 segundos a un minuto. A continuación, utilice un taladro de tretina de tres milímetros de diámetro para hacer un pequeño agujero en el hueso parietal.

Coloque el orificio aproximadamente 1,5 milímetros distal de la sutura sagital y dos milímetros distale de la sutura lambdoid. Retire con cuidado el colgajo óseo. A continuación, retire las meninges usando fórceps Dumont.

Ablate materia cortical para llegar a la cápsula externa. Utilice una aguja contundente de calibre 19 conectada a una bomba de vacío e irrigar con solución salina para evitar la deshidratación del tejido expuesto y lavar cualquier sangre residual después de que se resuelva el sangrado. Succionar el tejido cortical lentamente alrededor de 50 a 100 micras a la vez hasta que la corteza se separe de la cápsula exponiendo las fibras del cingulum o el cuerpo calloso.

Luego pela cuidadosamente las fibras dorsales hasta que las fibras más profundas, el alveus del hipocampo se exponen. Cuando haya terminado, enjuague el tejido con solución salina. A continuación, usa fórceps delgados para sumergir la cánula inferior en solución salina y colocarla sobre el orificio del cráneo.

A continuación, empuje la cánula en el cráneo hasta que el cubreobjetos de vidrio esté en contacto con las fibras. Seque el cráneo y aplique un cemento adhesivo rápido sobre el cráneo para mantener la cánula en su lugar. Asegúrese de aplicar también adhesivo en el borde de la cánula, pero tenga cuidado de no dejar que el adhesivo corra en la cánula.

Una vez seco, utilice un brazo estereotaxico para colocar una placa del soporte de la cabeza sobre la cánula en contacto con el cráneo. Preparar una mezcla de acrílico dental y luego aplicarlo a través de todo el cráneo. Cubrir todo el cráneo expuesto, el tornillo y la piel abierta con acrílico dental para estabilizar la preparación.

Después de 15 minutos, aplique una película adhesiva extraíble sobre la placa del soporte de la cabeza para evitar que los residuos entren en la cánula. Cuando esté listo para crear una imagen del cerebro, siga de nuevo el protocolo de texto que lo acompaña para obtener más información sobre la anestesia. Una vez suficientemente sedado, utilice fórceps para retirar cuidadosamente la película adhesiva de la placa del soporte de la cabeza.

Retire la película suavemente para evitar dañar la preparación. A continuación, coloque el ratón debajo del microscopio sobre la alfombra de calentamiento y fije la placa de la cabeza al soporte. Aplique pomada en los ojos del animal.

A continuación, limpie la cánula de imagen utilizando una jeringa y una aguja delgada para dejar caer agua desionizada en la cánula seguida de la extracción con una bomba de vacío. Utilice objetivos de baja ampliación de larga distancia de trabajo para comprobar visualmente la cánula en busca de agua residual, suciedad, integridad y presencia de fluorescencia. A continuación, alinee la cánula con el eje óptico ajustando los ángulos de los brazos del soporte de la cabeza.

Cambia a un objetivo 25X con una apertura numérica de 1.0 y una distancia de trabajo de cuatro milímetros. A continuación, agregue suficiente agua desionizada a la cánula para llenarla y mantener el exceso de agua en la parte superior de la cánula. Por último, utilice dos fotones de excitación e imagine las señales de fluorescencia.

Aquí se muestra una pila de imágenes 2P de un cerebro de ratón transgénico de thy1-GFP. Los ratones Thy1-GFP expresan GFP mejorada citoplasmático bajo el control del promotor Thy1 en una población aleatoria escasa de neuronas piramidales. Generalmente, el eje principal de las neuronas piramidales en el hipocampo dorsal CA1 es aproximadamente perpendicular al plano de imagen XY.

Estas regiones se asignan manualmente a una pila tridimensional de bajo aumento que muestra el patrón de expresión GFP en el volumen debajo de la cánula de imágenes. Para el seguimiento longitudinal, se definen varias regiones cerebrales dentro del campo de visión de la cánula. Cada región corresponde a un área de aproximadamente 240 por 240 micrómetros y contiene entre uno y siete segmentos dendríticos.

La serie de imágenes aquí muestra un micrómetro de pilas de imágenes de paso z de neuronas piramidales CA1 y dendritas basales adquiridas en diferentes intervalos de tiempo durante 14 días. Sin embargo, es posible realizar intervalos y duraciones de imagen más largos. Aunque la mayoría de las imágenes son de espinas dendríticas en el estrato oriens, también es posible tomar imágenes de espinas dendríticas en las dendritas oblicuas del estrato radiatum.

Otra extensión de esta técnica es la imagen de la plasticidad evocada por la actividad en las neuronas piramidales CA1 inyectando el área dorsal del hipocampo CA1 con un vector viral. Esto permite medir la plasticidad de cientos de neuronas piramidales CA1 en cada animal que se muestran aquí como una pila de imágenes 2P. Es crucial para prevenir el daño al hipocampo al extraer el tejido superpuesto.

Además, se debe colocar la cánula correctamente para garantizar una preparación estable. La preparación descrita permite el uso de diferentes tipos de imágenes ópticas como microscopios en miniatura que se pueden implantar en la cabeza del animal. Esto permite al investigador seguir la actividad neuronal en animales que se mueven libremente.

Originalmente, la técnica se utilizó para estudiar la plasticidad estructural en las neuronas del hipocampo. Hoy en día, se implementa en el estudio de la actividad neuronal también en otras áreas del cerebro.