Canlı fareler içinde dorsal hipokampal CA1 uzunlamasına Iki foton görüntüleme

Bu prosedür, öğrenme görevlerini yerine getirirken bellek oluşumu ve hatırlama mekanizmalarını incelemek için canlı farelerin sırt hipokampusuna tekrarlanan optik erişim sağlar. Bu teknik, birkaç hafta boyunca uzunlamasına olarak mikrometre düzeyinde canlı farelerin dorsal hipokampus çalışması için ışık mikroskobu kullanımını sağlar. Hafıza kaybı Alzheimer hastalığı gibi bazı beyin hastalıklarının genel bir özelliğidir.

Bellek oluşumu ve hatırlama mekanizmasını anlamak sonuçta bu hastalıklardan muzdarip hastalara yardımcı olabilir. Bu yöntem küçük memeliler gibi bir kafatası ile diğer hayvan sistemlerine uygulanabilir. Bir sağkalım ameliyatı sırasında hayati belirtileri izleme hem dikkat dağıtıcı ve stresli olabilir.

Bu prosedürün daha önemli yönleri odaklanmak için ilk ölü bir hayvan üzerinde prosedürü gerçekleştirmek için yararlı olabilir. Görüntüleme kanülünü hazırlamak için, ilk olarak üç milimetre çapında paslanmaz çelik bir tüpü 1,6 milimetre uzunluğundaki metal halkaya kesin. Halkanın kenarları kesildikten sonra künt değilse, düzensizlikleri ortaya çıkar.

Daha sonra, bir UV kür optik yapıştırıcı içine metal halka bir tarafı daldırma için forceps bir çift kullanın. Daha sonra metal halkayı cam kapak lının ortasına, kapak kaymasına dokunarak yapıştırıcı ile kaplanmış ringin yan tarafını yerleştirin. UV kür LED sürücü ünitesini açın ve yapıştırıcıyı tedavi etmek için 365 nanometre dalga boyu ışığını yapıştırıcıya bir dakika lığına açın.

Işık kaynağının yönünü değiştirerek halkanın tüm taraflarının eşit şekilde aydınlatılmış olduğundan emin olun. Yapıştırıcı en az iki saat sertleştikten sonra, bir hemostat ile metal halkanın açık ucundan kanül sıkıca tutun. Dönen bir dosya ile donatılmış bir diş matkap kullanarak, halka nın kenarları ile kızartılır kadar fazla cam coverslip kapalı dosya.

Gerekli aletleri hazırlayın ve eşlik eden metin protokolünde açıklandığı gibi fareyi anestezi edin. Sonra saç çıkarın ve fare kafası üzerinde cilt dezenfekte. Sonra, lambda yakın pozisyonda kafa derisi küçük bir kesim yapmak için makas ve forceps kullanın.

Kulakların yönünde yanal hareket sonra bregma yaklaşık dört milimetre rostral sagittal eksenüzerinde bir üçgen oluşturmak için göz yörüngeleri yönünde rostrally. Kafatasına bir damla lidokain uygulayın. İki dakika sonra, periyostik temizleyin ve bir pamuklu bez kullanarak kafatası kuru.

Ardından farenin kafasını düzeltmek için kulak çubuklarını yerleştirin. 0.5 milimetre genişliğinde çapak ile bir mikro matkap kullanarak, sagittal sütür yaklaşık 1,5 milimetre ve koronal sütür iki milimetre distal görüntülenmiş hipokampus karşısında frontal kemik küçük bir delik yapmak. Sonra kafatası deliğine 0.86 milimetre genişliğinde paslanmaz çelik kemik vida vida.

Yapıştırıcı çimento kullanarak yerine sabit. Çimento bir dakika 30 saniye kurumasını bekleyin. Sonra, parietal kemik küçük bir delik yapmak için üç milimetre çapında trephine matkap kullanın.

Deliği sagittal sütünden yaklaşık 1,5 milimetre, lambdoid sütünden ise iki milimetre distal konumlandırın. Kemik kapağını dikkatlice çıkarın. Sonra Dumont forceps kullanarak menines çıkarın.

Dış kapsül ulaşmak için kortikal madde ablate. Bir vakum pompası bağlı bir 19 gauge künt iğne kullanın ve maruz kalan doku dehidratasyon önlemek için tuzlu su ile sulamak ve kanama çözüldükten sonra herhangi bir kalıntı kan yıkamak. Kortikal dokuyu bir seferde yaklaşık 50 ila 100 mikron emeyi, korteks kapsülden kalsAyarak cingulum veya corpus callosum'un liflerini açığa çıkar.

Sonra dikkatle derin lifler kadar sırt lifleri soyma, hipokampus alveus maruz kalana kadar. Bittiğinde, tuzlu ile doku durula. Daha sonra, alt kanüle batırmak için ince büşreler kullanın ve kafatası deliğinin üzerine yerleştirin.

Sonra cam kapak lı lifler ile temas edene kadar kafatası içine kanül itin. Kafatası kuru ve yerinde kanül tutmak için kafatası üzerinde hızlı bir yapışkan çimento uygulayın. Ayrıca kanül kenarına yapıştırıcı uygulamak için emin olun ama yapışkan kanül içine çalışmasına izin vermemeye dikkat edin.

Kuruduktan sonra, kafatası ile temas kanül üzerinde bir baş tutucu plaka konumlandırmak için stereotaksik bir kol kullanın. Diş akrilik karışımı hazırlayın ve daha sonra tüm kafatası boyunca uygulayın. Hazırlık stabilize etmek için tüm maruz kafatası, vida ve diş akrilik ile açık deri kapağı.

15 dakika sonra, enkazın kanüle girmesini önlemek için baş tutucu plakaya çıkarılabilir yapışkan bir film uygulayın. Beyni resmetmeye hazır olduğunuzda, anestezi ile ilgili ayrıntılar için yine eşlik eden metin protokolünü takip edin. Yeterince uyuşturulduktan sonra, yapışkan filmi kafa tutucu plakasından dikkatlice çıkarmak için forceps kullanın.

Hazırlıklara zarar vermemek için filmi nazikçe çıkarın. Daha sonra fareyi mikroskop altında ısıtma halısının üzerine yerleştirin ve baş plakayı tutucuya sabitle. Hayvanın gözlerine göz merhemi uygulayın.

Daha sonra bir şırınga ve ince bir iğne kullanarak kanül içine deiyonize su damla ve ardından bir vakum pompası ile kaldırılması kullanarak görüntüleme kanül temizleyin. Kanülleri artık su, kir, bütünlük ve floresan varlığı için görsel olarak kontrol etmek için düşük büyütme uzun çalışma mesafesi hedeflerini kullanın. Daha sonra kanülü, baş tutucu kolların açılarını ayarlayarak optik eksene hizalayın.

1,0 sayısal diyafram açıklığı ve dört milimetrelik çalışma mesafesi ile 25X hedefine geçin. Sonra kanül doldurmak ve kanül üstüne fazla su korumak için kanül yeterli deiyonize su ekleyin. Son olarak, iki foton uyarma kullanın ve floresan sinyalleri görüntü.

Burada gösterilen bir thy1-GFP transgenik fare beyninden bir 2P görüntü yığını. Thy1-GFP fareler piramidal nöronların seyrek rasgele nüfus Thy1 organizatörü kontrolü altında sitoplazmik gelişmiş GFP ifade. Genellikle, dorsal hipokampal CA1 piramidal nöronların ana ekseni kabaca XY görüntüleme düzlemine diktir.

Bu bölgeler, görüntüleme kanülünün altındaki birimdeki GFP ifadesinin deseni gösteren düşük büyütmeli üç boyutlu bir yığına el ile eşlenir. Uzunlamasına izleme için, kanül görüş alanı içinde çeşitli beyin bölgeleri tanımlanır. Her bölge yaklaşık 240 ile 240 mikrometrelik bir alana karşılık gelir ve bir ile yedi dendritik segment içerir.

Burada görüntülenmiş seri, 14 gün boyunca farklı zaman aralıklarında edinilen CA1 piramidal nöronlar ve bazal dendritlerin bir mikrometre z-adım görüntü yığınları gösterir. Ancak, daha uzun görüntüleme süreleri ve aralıkları mümkündür. Görüntülerin çoğu stratum oriens'teki dendritik dikenlere ait olsa da, stratum radyatının eğik dendritlerinde dendritik dikenleri görüntülemek de mümkündür.

Bu tekniğin bir başka uzantısı bir viral vektör ile dorsal CA1 hipokampal alan enjekte ederek CA1 piramidal nöronlarda görüntü aktivitesi uyarılmış plastisite etmektir. Bu, her hayvandaki yüzlerce CA1 piramidal nöronun plastisitesinin burada 2P görüntü yığını olarak ölçülmesine olanak tanır. Bu üstteki doku çıkarırken hipokampus hasarı önlemek için çok önemlidir.

Ayrıca, istikrarlı bir hazırlık sağlamak için doğru kanül yerleştirmelisiniz. Açıklanan hazırlık, hayvanın kafasına yerleştirilebilen minyatür mikroskoplar gibi farklı optik görüntüleme türlerinin kullanılmasına olanak sağlar. Bu araştırmacı serbestçe hareket eden hayvanlarda nöronal aktiviteyi takip etmenizi sağlar.

Başlangıçta, teknik hipokampal nöronlarda yapısal plastisite çalışma için kullanılmıştır. Günümüzde diğer beyin bölgelerinde de nöronal aktivite nin incelenmesinde uygulanmaktadır.