Name: expression and purification of nuclease-free oxygen scavenger protocatechuate 3,4-dioxygenase
Uploaded: 2019-11-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة GM121284 و AI126742 إلى KEY.

1. الحث علي التعبير PCD في e. كولاي
<ol><li>الجمع بين 1 μl pVP91A pcahg PCD التعبير البلازميد (20 نانوغرام/μl ، الشكل 1ا) و 20 μl من e. القولونية BL21 (20 μl الخلايا المتاحة تجاريا ، > 2 × 106 كفو/ميكروغرام البلازميد) في أنبوب. نفض الغبار الأنبوب لخلط. وضع الأنبوب علي الجليد 5 دق?...

<ol>
	<li>Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+single+fluorescent+molecules.">Detection of single fluorescent molecules.</a> Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).</li><li>Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+reactive+oxygen+species+to+the+photobleaching+of+organic+fluorophores.">The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores.</a> Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).</li><li>Ha, T., Tinnefeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photophysics+of+fluorescent+probes+for+single-molecule+biophysics+and+super-resolution+imaging.">Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).</li><li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy:+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy.">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).</li><li>Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+species+formed+on+proteins+exposed+to+singlet+oxygen.">Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen.</a> Photochemical &#38; Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).</li><li>Sies, H., Menck, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Singlet+oxygen+induced+DNA+damage.">Singlet oxygen induced DNA damage.</a> Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).</li><li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments.">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li><li>Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+coupling+in+actomyosin+energy+transduction+studied+by+in+vitro+movement+assay.">Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay.</a> Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).</li><li>Shi, X., Lim, J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidification+of+the+oxygen+scavenging+system+in+single-molecule+fluorescence+studies:+in+situ+sensing+with+a+ratiometric+dual-emission+probe.">Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe.</a> Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).</li><li>Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+analyses+of+designed+and+selected+mutants+of+protocatechuate+3,4-dioxygenase1.">Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1.</a> Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).</li><li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems.">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li><li>Senavirathne, G., Lopez, M. A., Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+nuclease-free+protocatechuate+3,4-dioxygenase+for+prolonged+single-molecule+fluorescence+imaging.">Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging.</a> Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nature Communications. 7, 11409 (2016).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cascading+MutS+and+MutL+sliding+clamps+control+DNA+diffusion+to+activate+mismatch+repair.">Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair.</a> Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).</li></ol>

وعاده ما يتم تضمين أنظمه المسح الأوكسجين في جزيء واحد المجهر المجهري للحد من التصوير الضوئي3,7,8. وغالبا ما تستخدم هذه التقنيات المجهرية لمراقبه الأحماض النووية أو تفاعلات البروتين مع الأحماض النووية1،13?...

جزيء واحد (SM) الفيزياء الحيوية هو حقل ينمو بسرعة تغيير الطريقة التي ننظر فيها إلى الظواهر البيولوجية. هذا المجال لديه القدرة الفريدة لربط القوانين الاساسيه للفيزياء والكيمياء إلى علم الاحياء. المجهر الفلوري هو الطريقة البيوفيزيائية واحده التي يمكن ان تحقق حساسية SM. يستخدم الفلوري للكشف عن الجزيئات الحيوية عن طريق ربطها بالفلور العضوية الصغيرة أو النقاط الكمية1. هذه الجزيئات يمكن ان تنبعث منها الفوتونات عندما متحمس باشعه الليزر قبل التسرب الضوئي لا رجعه فيه2. يحدث الرشح الضوئي عندما تخضع الملصقات الفلورية للضرر الكيميائي الذي يدمر قدرتها علي الاثاره عند الموجه الموجية المطلوبة2،3. وجود أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في العازلة المائية هي السبب الرئيسي لتسرب الصور2،4. بالاضافه إلى ذلك ، روس يمكن ان تتلف الجزيئات الحيوية ويؤدي إلى ملاحظات خاطئه في التجارب SM5،6. لمنع الضرر التاكسدي ، ويمكن استخدام أنظمه المسح الأوكسجين (OSS)3،7،8. نظام اكسيداز الجلوكوز/catalase (GODCAT) هو فعال في أزاله الأكسجين8، ولكنه ينتج الأكاسيد الفوقية الضارة المحتملة كوسيطه. قد تكون هذه الاضرار إلى الجزيئات الحيوية للاهتمام في دراسات SM.
بدلا من ذلك ، بروتوكاتيتشواتي 3, 4 ديوكسيجيناسي (PCD) سوف يزيل بكفاءة O2 من محلول مائي باستخدام الركيزة بروتوكاتيتشويك حمض (PCA)7,9. PCD هو الانزيم الفلزي الذي يستخدم الحديد اللاهيمي لتنسيق PCA وتحفيز حلقه الكاتهول رد فعل الافتتاح باستخدام المذاب O210. ويظهر هذا التفاعل خطوه واحده ليكون أفضل OSS عموما لتحسين الاستقرار فلوكوفيري في تجارب SM7. لسوء الحظ ، تحتوي العديد من الانزيمات OSS المتاحة تجاريا ، بما في ذلك PCD ، تلوث النوكليميس11. ويمكن ان تؤدي هذه الملوثات إلى تلف الركائز المستندة إلى الأحماض النووية المستخدمة في تجارب SM. سيوضح هذا العمل بروتوكول تنقيه يستند إلى الفصل اللوني لاستخدام PCD المؤتلف في أنظمه SM. يمكن تطبيق PCD علي نطاق واسع علي اي تجربه حيث تتلف الركائز اللازمة للحصول علي البيانات.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>&#946;ME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, Glacial Certified ACS</td>
			<td>Fisherl Chemical</td>
			<td>A38C-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Granulated</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>DF0145-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA FPLC System</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC201024</td>
			<td>10 kDa MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F-2262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS) Tablets</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>K833-100TABS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0339-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>DF0123173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90004-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIS-TRIS propane,&#62;=99.0% (titration)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6755-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0472-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96&#8211;Well Flat&#8211;Bottom EIA Plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2240096EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>P212121</td>
			<td>SV-DTT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 500ML</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G37-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granulated LB Broth Miller</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>1.10285.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Res Standard Agarose</td>
			<td>AGTC Bioproducts</td>
			<td>AG500D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0250-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11017128001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from Chicken Egg White</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0288-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>P212121</td>
			<td>RP-S23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow (100 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novagen BL21 Competent Cells</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>69-449-3</td>
			<td>SOC media included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0-267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>P-020-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0754-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN15642110</td>
			<td>PCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>P212121</td>
			<td>CI-00270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M2 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devises</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane &#62; 250mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-741-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane &#62; 500mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-741-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 12 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17517301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0761-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Ultra Pure</td>
			<td>Gojira Fine Chemicals</td>
			<td>UTS1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure EDTA</td>
			<td>Invitrogen/Gibco</td>
			<td>15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208086</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression and purification of nuclease-free oxygen scavenger protocatechuate 3,4-dioxygenase

ويستخدم المجهر جزيء واحد (SM) في دراسة التفاعلات الجزيئية الديناميكية من فلوكوفيري المسمية الجزيئات الحيوية في الوقت الحقيقي. ومع ذلك ، فان الفلوروبيورس عرضه لفقدان الاشاره عن طريق الرشح بواسطة الأكسجين المذاب (O2). لمنع الارتشاح الضوئي وأطاله عمر الفلوفيبيوم ، يتم استخدام أنظمه المسح بالأكسجين (OSS) لتقليل O2. وقد تكون البرمجيات المتاحة تجاريا ملوثه بالأحماض النووية التي تلحق ضررا أو تحللا ، وتفسر النتائج التجريبية تفسيرا محيرا. هنا نقوم بالتفصيل بروتوكول للتعبير وتنقيه الزائفة النشطة للغاية putida بروتوكاتيتشواتي-3 ، ديوكسيجيناسي (PCD) مع عدم وجود تلوث النواز قابل للكشف. يمكن PCD أزاله بكفاءة O2 الأنواع التفاعلية عن طريق تحويل الركيزة حمض بروتوكاتيتشويك (PCA) إلى 3-كربوكسي كومنولث الدول المستقلة ، وحمض كومنولث الدول المستقلة-muconic. ويمكن استخدام هذا الأسلوب في اي نظام مائي حيث O2 يلعب دورا ضارا في الحصول علي البيانات. هذا الأسلوب هو فعال في إنتاج النشطة للغاية ، النواز الحرة PCD بالمقارنة مع PCD المتاحة تجاريا.

المتاحة تجاريا الأوكسجين الزبال PCD غالبا ما تكون ملوثه بنواه الحمض النووي. تلوث النشاط النيوداز يمكن ان يؤدي إلى نتائج زائفه في الدراسات الفلورية ، وخاصه الدراسات التي تحلل الحمض النووي أو الحمض النووي التفاعل البروتينات. وقد وجدنا ان PCD المؤتلف ، وهو مغاير من hexahistidine الم...

Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase at JoVE.com

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

بروتوكاتيتشواتي 3, 4-ديوكسيجيناسي (PCD) يمكن انزيمي أزاله الأكسجين ثنائي الذرة الحرة من نظام مائي باستخدام الركيزة بروتوكاتيتشويك حمض (PCA). يصف هذا البروتوكول التعبير ، وتنقيه ، وتحليل النشاط لهذا الانزيم الكسح الأوكسجين.

التعبير وتنقيه الأكسجين خاليه من النيوداز الزبال بروتوكاتيتشواتي 3 ، 4-ديوكسيجيناسي

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

ينتج بروتوكولنا عن جهاز دي سي دي نشط للغاية خال من النوى القابلة للكشف، والتي يمكن استخدامها في أي حل حيث الأكسجين مائي هو ملوث. التقنيات التي نستخدمها سهلة التكرار وضمان عدم وجود ملوثات نويات في المنتج. للبدء، والجمع بين ميكرولتر واحد من pVP91A-pcaHG التعبير PCD بلازميد و 20 ميكرولترات من E.coli BL21 المتاحة تجاريا في أنبوب.نفض الغبار الأنبوب لخلط، ووضع الأنبوب على الجليد لمدة خمس دقائق. لمواصلة تفاعل التحول، ضع الأنبوب في حمام مائي عند درجة حرارة 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، ثم على الجليد لمدة دقيقتين. إضافة 80 ميكرولترات من وسائل الإعلام SOC، ويهز في 225 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.بعد ذلك، صب خليط تفاعل التحول على أجار LB-أمبيسيلين، واستخدام موزع لوحة لنشر الخليط. غطي الطبق بغطاء، ويحضن اللوحة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 18 ساعة. بعد ذلك، اختيار مستعمرة واحدة من لوحة، وتطعيم في 50 ميكرولترات من LB-ampicillin في قارورة Erlenmeyer 250 ملليلتر.ضع القارورة على شاكر عند 225 دورة في الدقيقة لاحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 18 ساعة. ثم, نقل 20 ملليلتر من الثقافة المحتضنة إلى قارورة سعة أربعة لتر مليئة لتر واحد من LB-ampicillin. هز في 225 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية.كل ساعة، ارسم مليلتر واحد من الثقافة في cuvette لقياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر على مقياس ضوئي. كما يزيد كثافة الثقافة البصرية بالقرب من 0.5، وزيادة وتيرة القياسات إلى كل 15 دقيقة، حتى OD600 تصل إلى 0.5. ثم، نقل قارورة أربعة لتر إلى سلة من الجليد.دوامة القارورة في حمام الجليد للحد من درجة حرارة الثقافة. نقل قارورة أربعة لتر إلى حاضنة في 17 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة. استمر في مراقبة OD600 كل 20 دقيقة.في 0.7 OD600، إضافة IPTG وكبريتات الحديد الأمونيوم الهيكساهيدات لإيجاد تركيز نهائي من 0.5 ملليمولار و 10 ملليغرام للتر الواحد، على التوالي. هز الثقافة عند 180 دورة في الدقيقة و 17 درجة مئوية لمدة 18 ساعة. بعد الحضانة، ضع قارورة الثقافة في الجليد لمدة دقيقتين.حصاد ملليلتر واحد من الخلايا المستحثة في أنبوب البولي بروبلين 1.5 ملليلتر microcentrifuge لتحليل SDS-PAGE. بعد ذلك ، صب الثقافة البكتيرية في زجاجات ، 500 ملليلتر كل زجاجة ، للطرد المركزي. بيليه الثقافة في أربع درجات مئوية و 3،000 مرات ز لمدة 20 دقيقة.اِنّهُ المُتَرَكِر الماصات لإعادة تعليق الكريات، كل في 12.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة، والجمع بين كل اثنين من resuspensions في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. بيليه الخلايا مرة أخرى كما سابقا.ثم، والتخلص من عظمى، واستخدام ماصة لإضافة 10 ملليلتر من العازلة تحلل في كل أنبوب لإعادة تعليق الخلايا. بعد sonicating الأنابيب مع الخلايا المستحثة، صب البكتيريا في زجاجة البولي المبردة مسبقا. أجهزة الطرد المركزي لمدة 60 دقيقة في 120، 000 مرات ز وأربع درجات مئوية، وصب supernatant إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر الباردة.بعد إعداد أداة FPLC مع عمود الراتنج المشحون بالنيكل ، قم بتحميل العينة إلى العمود بمعدل 0.15 ملليلتر في الدقيقة. غسل العمود مع 20 ملليلتر من العازلة النيكل في إيميدازول 20 ملليمولار. احتفظ بالغسل في أنبوب 50 ملليلتر للتحليل.بعد ذلك، قم بغسل العمود بـ 15 ملليلتر من المخزن المؤقت للنيكل عند إيميدازول 125 ملليمولار. جمع elution في 19 كسور من 0.8 ملليلتر لكل من. غسل العمود مرة أخرى مع 15 ملليلتر من 100٪ النيكل العازلة B، وجمع 75 كسور إضافية من 0.2 ملليلتر لكل من.مواصلة تحليل الكسور التي تم جمعها على 12٪ من المواد الهلامية SDS-PAGE للتأكد من وجود PCD. أولا، إضافة 35 ميكرولترات من العازلة رد فعل إلى أنبوب البولي بروبلين 1.5 ملليلتر microcentrifuge. في الأنبوب ، والجمع بين خمسة ميكرولترات من كسور الكروماتوغرافيا الذروة و 500 نانوغرام من ثلاثة كيلو بيس زوج pxba فائقة التكويد.ضع الأنبوب في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد إعداد جل agarose وفقًا للمخطوطة، أضف 30 ميكرولترات من كل رد فعل إلى آبار في الجل. الكهرباء في 10 فولت لكل سنتيمتر في درجة الحرارة المحيطة لمدة ساعة واحدة تقريبا.الآن، وصلت صبغة G البرتقالية إلى نهاية الجل. على الفور، استخدم ماسح ضوئي للفلورسينت لتصوير إشارة بروميد الإتهيديوم للجل. مع وظيفة من كثافة وحجم بكسل الصورة، وتحديد حجم بكسل من أنواع الحمض النووي المختلفة، مثل الدوائر supercoiled، خطية، وseded.لتحديد النسبة المئوية لكل نوع من أنواع الحمض النووي، قم بتقسيم حجم البكسل لأنواع الحمض النووي المفردة حسب الحجم الإجمالي للبكسل لجميع الأنواع الفردية. ويبين تحليل SDS-PAGE أن ذروة الاستئصال الثانية تحتوي على الحد الأدنى من التلوث بالبروتين، الذي يمثل هتيروديمر PCD النقي تقريباً والحد الأدنى من نشاط النوى غير القابل للكشف. وهكذا، الجمع بين هذه الكسور 10 من ELUTION PCD الثاني في أنبوب مخروطي خمسة ملليلتر لمزيد من التحليل.بعد تنقية الكروماتوغرافيا الحجم استبعاد من PCD، في غرفة باردة درجة مئوية أربع، والجمع في أنبوب microcentrifuge حجم مناسب من كلوريد الصوديوم، هيدروكلوريد تريس، كلوريد المغنيسيوم، dithiothrel، PCA، وبلازميد pXba فائقة الكوتة لجعل مخزون 5X. ضع لوحة مسطحة القاع 96 بئرًا على الجليد ، ونقل 10 ميكرولترات من محلول 5X المجمع إلى الآبار. مباشرة قبل التحليل، إضافة إلى كل 10 ميكرولترات جيدا من كسور SEC PCD الفردية.تعيين قارئ لوحة إلى درجة حرارة داخلية من 37 درجة مئوية، ونقل لوحة 96-جيدا إلى حامل لوحة. سحب حامل لوحة في الصك، وقياس الامتصاص في 290 نانومتر في فترات 20 ثانية لمدة ساعة واحدة. تعيين الصك لهز لوحة خمس ثوان قبل كل قراءة.بعد ساعة واحدة، إضافة 10 ميكرولترات من حل وقف لكل بئر لإنهاء ردود الفعل. تنفيذ جل الكهرباء لكسور PCD SEC. حدد الكسور التي لها معظم نشاط أكسدة الأنيسول الخماسي الكلور، المشار إليها من خلال انخفاض الامتصاص وعدم وجود تلوث نويات ملاحظ.قياس امتصاص في 280 نانومتر، وحساب تركيز ثنائي بزين ثنائي باندو الكلي على أساس امتصاص ومعامل الانقراض. تخزين الكسور المحددة للتخزين على المدى الطويل في ناقص 80 درجة مئوية. في هذه التجربة، وجد أن المؤتلف PCD، وهو heterodimer من الهيكساهيستيدين الموسومة PCAH وpcaG، وأعرب في الإشريكية القولونية.تم تنقية الهتيروديمر لأول مرة عن طريق الكروماتوغرافيا تقارب النيكل. يتم عرض امتصاص باللون الأزرق، ويظهر تركيز النسبة المئوية للنيكل العازلة B باللون الأحمر. التدفق من خلال يظهر البروتينات البكتيرية القابلة للذوبان التي لم ترتبط راتنج النيكل.بعض PCD مُلَه في وجود إيميدازول 125 ميليمولار, ولكن غالبية البروتين يلتم في إيميدازول 250 ميليمولار. يشير تحليل SDS-PAGE التمثيلي إلى أن الكسور من خطوة التلوين كانت خالية من الملوثات. Gelروز هلام من المقايسة النوى يكشف التلوث من خلال مقارنة مع السيطرة السلبية دون إضافة بروتين والسيطرة الإيجابية الملوثة مع نوكلاز الحمض النووي.كمية من مختلف أنواع الحمض النووي لوحظت في تحليل nuclease هلام agarose يظهر الكسور 29 من خلال 38 كان نشاط النوى قليلا، والتي تم اختيارها لتكون مجتمعة، وتركز، ومزيد من تنقية من قبل لجنة الأوراق المالية والبورصة البيانات من ثلاثة كسور لجنة الأوراق المالية والبورصة تمثيلية أظهرت أن تنقية PCD خفضت امتصاص في 290 نانومتر، مما يشير إلى أكسدة PCA. بعد هذا الإجراء، يمكن استخدام PCD المنقى وتحسينه في نظام الكسح الأكسجين المطلوب.وهذا سيحدد المبلغ الدقيق من PCD اللازمة للنظام. وقد استخدمت هذه التقنية لإطالة عمر الفلوروفور في تجارب المجهر جزيء واحد، والتي سمحت لفترات أطول من جمع البيانات. وrifuge فائقة التركيز المستخدمة خطرة.تأكد من أن أجهزة الطرد المركزي متوازنة بشكل صحيح قبل الدوران. بروميد الإتيهيدوم هو كاشف خطر. تجنب الاتصال بارتداء معدات الحماية الشخصية، والتخلص منها بشكل مناسب.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization والتعبير وتنقية، وتبلور من السيروتونين الناقل الإنسان ملزمة ل<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

التعبير، تنقية، ومضادات الميكروبات النشاط من S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

تنقية وإعادة تشكيل TRPV1 لتحليل سبيكتروسكوبيك

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

التعبير وتنقية قنوات أيون بيستروفين الثدييات

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

أخذ العينات والمعالجة المسبقة لميناء الأسنان كربونات الكربون مستقرة وتحليل نظائر الأكسجين

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

تنقية البروتين اللاهوائية وتحليل الحركية عبر مسرى الأوكسجين لدراسة النشاط ديوكسيجيناسي دسب وتثبيط

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

قياس وتفسير معدلات استهلاك الأوكسجين كلياً يطير رئيس قطاعات

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

التعبير وتنقية TRPC3 الإنسان حساسة للدهن قناة الأيونات الموجبة للتصميم الهيكلي بالفحص المجهري واحد-الجسيمات Cryo-إلكترون

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

التعبير، سولوبيليزيشن، وتنقية من الناقلين بورات حقيقية النواة

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...