Name: expression and purification of nuclease-free oxygen scavenger protocatechuate 3,4-dioxygenase
Uploaded: 2019-11-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NIH GM121284 og AI126742 til KEY.

1. inducerer PCD-ekspression i E. coli
<ol><li>Kombiner 1 μL pVP91A-pcaHG PCD Expression plasmid (20 ng/μL, figur 1A) og 20 μl E. coli BL21 (20 μl kommercielt tilgængelige celler, > 2 x 106 CFU/μg plasmid) i et rør. Svip røret for at blande. Anbring røret på is 5 min.</li>
	<li>Placer transformation ved 42 °C i 30 s. Så is 2 min.</li>
	<li>Tilsæt 80 μL SOC-medier (Super optimal bouillon med katabolit undertrykkelse: 2,5 mM KCl, 10...

<ol>
	<li>Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+single+fluorescent+molecules.">Detection of single fluorescent molecules.</a> Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).</li><li>Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+reactive+oxygen+species+to+the+photobleaching+of+organic+fluorophores.">The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores.</a> Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).</li><li>Ha, T., Tinnefeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photophysics+of+fluorescent+probes+for+single-molecule+biophysics+and+super-resolution+imaging.">Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).</li><li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy:+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy.">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).</li><li>Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+species+formed+on+proteins+exposed+to+singlet+oxygen.">Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen.</a> Photochemical &#38; Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).</li><li>Sies, H., Menck, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Singlet+oxygen+induced+DNA+damage.">Singlet oxygen induced DNA damage.</a> Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).</li><li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments.">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li><li>Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+coupling+in+actomyosin+energy+transduction+studied+by+in+vitro+movement+assay.">Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay.</a> Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).</li><li>Shi, X., Lim, J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidification+of+the+oxygen+scavenging+system+in+single-molecule+fluorescence+studies:+in+situ+sensing+with+a+ratiometric+dual-emission+probe.">Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe.</a> Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).</li><li>Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+analyses+of+designed+and+selected+mutants+of+protocatechuate+3,4-dioxygenase1.">Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1.</a> Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).</li><li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems.">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li><li>Senavirathne, G., Lopez, M. A., Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+nuclease-free+protocatechuate+3,4-dioxygenase+for+prolonged+single-molecule+fluorescence+imaging.">Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging.</a> Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nature Communications. 7, 11409 (2016).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cascading+MutS+and+MutL+sliding+clamps+control+DNA+diffusion+to+activate+mismatch+repair.">Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair.</a> Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).</li></ol>

Oxygen skylle systemer er almindeligvis inkluderet i enkelt molekyle Fluorescens mikroskopi for at reducere foto blegning3,7,8. Disse mikroskopi teknikker bruges ofte til at observere nukleinsyre eller protein interaktioner med nukleinsyrer1,13,14. Kontaminering af OSSs med nukleaser kan føre til falske resultater.
<p class="jove_c...

Et enkelt molekyle (SM) Biofysik er et hastigt voksende felt, der ændrer den måde, vi ser på biologiske fænomener. Dette felt har den unikke evne til at forbinde grundlæggende love i fysik og kemi til biologi. Fluorescens mikroskopi er en Biofysisk metode, der kan opnå SM følsomhed. Fluorescens anvendes til påvisning af biomolekyler ved at forbinde dem til små organiske fluorophorer eller kvante prikker1. Disse molekyler kan udsende fotoner, når de er ophidsede af lasere før foto blegning irreversibelt2. Foto blegning opstår, når de fluorescerende etiketter undergår kemiske skader, der ødelægger deres evne til at ophidde ved den ønskede bølgelængde2,3. Tilstedeværelsen af reaktive oxygenarter (ros) i vandig buffer er en primær årsag til foto blegning2,4. Derudover kan ros skade biomolekyler og føre til fejlagtige observationer i SM eksperimenter5,6. For at forhindre oxidativ skader, ilt scavenging Systems (OSS) kan anvendes3,7,8. Glucoseoxidase/catalase (GODCAT) systemet er effektivt til at fjerne ilt8, men det producerer potentielt skadelige peroxider som mellemprodukter. Disse kan være skadelige for biomolekyler af interesse i SM-undersøgelser.
Alternativt vil protocatechuate 3, 4 dioxygenase (PCD) effektivt fjerne O2 fra en vandig opløsning ved hjælp af dets substrat protocatechuinsyre Acid (PCA)7,9. PCD er et metalloenzym, der bruger hæm jern til at koordinere PCA og katalyserer catechol ring åbnings reaktionen ved hjælp af opløst O210. Denne ene skridt reaktion er vist sig at være en samlet bedre OSS for at forbedre fluoroforet stabilitet i SM eksperimenter7. Desværre indeholder mange kommercielt tilgængelige OSS-enzymer, herunder PCD, kontaminerende nukleaser11. Disse forurenende stoffer kan føre til beskadigelse af nukleinsyre-baserede substrater, der anvendes i SM eksperimenter. Dette arbejde vil belyse en kromatografi baseret rensnings protokol for brug af rekombinant PCD i SM-systemer. PCD kan anvendes bredt på ethvert eksperiment, hvor ROS er skadelige substrater, der er nødvendige for dataindsamling.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>&#946;ME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, Glacial Certified ACS</td>
			<td>Fisherl Chemical</td>
			<td>A38C-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Granulated</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>DF0145-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA FPLC System</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC201024</td>
			<td>10 kDa MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F-2262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS) Tablets</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>K833-100TABS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0339-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>DF0123173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90004-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIS-TRIS propane,&#62;=99.0% (titration)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6755-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0472-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96&#8211;Well Flat&#8211;Bottom EIA Plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2240096EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>P212121</td>
			<td>SV-DTT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 500ML</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G37-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granulated LB Broth Miller</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>1.10285.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Res Standard Agarose</td>
			<td>AGTC Bioproducts</td>
			<td>AG500D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0250-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11017128001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from Chicken Egg White</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0288-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>P212121</td>
			<td>RP-S23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow (100 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novagen BL21 Competent Cells</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>69-449-3</td>
			<td>SOC media included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0-267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>P-020-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0754-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN15642110</td>
			<td>PCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>P212121</td>
			<td>CI-00270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M2 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devises</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane &#62; 250mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-741-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane &#62; 500mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-741-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 12 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17517301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0761-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Ultra Pure</td>
			<td>Gojira Fine Chemicals</td>
			<td>UTS1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure EDTA</td>
			<td>Invitrogen/Gibco</td>
			<td>15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208086</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression and purification of nuclease-free oxygen scavenger protocatechuate 3,4-dioxygenase

Enkelt molekyle (SM) mikroskopi anvendes i studiet af dynamiske molekylære interaktioner af fluoroforet mærket biomolekyler i realtid. Fluorophorer er dog udsat for tab af signal via foto blegning ved opløst ilt (O2). For at forhindre foto blegning og forlænge fluoroforet levetid, er ilt scavenging Systems (OSS) ansat til at reducere O2. Kommercielt tilgængelige OSS kan være forurenet af nukleaser, der beskadiger eller nedbryder nukleinsyrer, som giver en forvirrende fortolkning af eksperimentelle resultater. Her detaljeret en protokol til ekspression og oprensning af meget aktive Pseudomonas putida protocatechuate-3, 4-dioxygenase (PCD) uden påviselige nuklease kontaminering. PCD kan effektivt fjerne reaktive O2 arter ved omdannelse af substrat protocatechuinsyre Acid (PCA) til 3-carboxy-CIS, CIS-muconic Acid. Denne metode kan anvendes i ethvert vandigt system, hvor O2 spiller en skadelig rolle i dataindsamlingen. Denne metode er effektiv til at producere meget aktive, nuclease gratis PCD i sammenligning med kommercielt tilgængelige PCD.

Kommercielt tilgængelige ilt Scavenger PCD er ofte forurenet med en DNA-nuklease. Kontaminerende nukleaseaktivitet kan føre til falske resultater i fluorescerende undersøgelser, især undersøgelser, der analyserer DNA-eller DNA-interagere proteiner. Vi har konstateret, at rekombinant PCD, en heterodimer af hexahistidin Tagged pcaH og pcaG, kan udtrykkes i E. coli (figur 1). Heterodimeren renses først ved nikkel affinitets kromatografi (<strong class="xfi...

Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase at JoVE.com

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Protocatechuate 3, 4-dioxygenase (PCD) kan enzymatisk fjerne fri diatomisk ilt fra et vandigt system ved hjælp af dets substrat protocatechuinsyre Acid (PCA). Denne protokol beskriver udtrykket, rensning og aktivitetsanalyse af dette iltskylle enzym.

Udtryk og rensning af nuklease-fri oxygen Scavenger Protocatechuate 3, 4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Vores protokol giver meget aktiv PCD fri for påviselig nuklease, som kan bruges i enhver opløsning, hvor vandig ilt er et forurenende stof. De teknikker, vi bruger, er nemme at replikere og sikre, at der ikke findes nukleaseforurenende stoffer i produktet. Til at begynde, kombinere en microliter af pVP91A-pcaHG PCD udtryk plasmid og 20 mikroliter af kommercielt tilgængelige E.coli BL21 i et rør.Svirp røret til at blande, og placere røret på is i fem minutter. For at fortsætte transformationsreaktionen skal røret anbringes i et vandbad ved 42 grader Celsius i 30 sekunder og derefter på is i to minutter. Tilføj 80 mikroliter af SOC-medier, og ryst ved 225 omdrejninger i minuttet og 37 grader Celsius i en time.Dernæst hæld transformation reaktion blandingen på en LB-ampicillin agar, og bruge en plade spreder til at sprede blandingen. Dæk pladen med et låg, og inkubere pladen ved 37 grader Celsius i 16 til 18 timer. Derefter skal du vælge en koloni fra pladen og inokulere i 50 mikroliter LB-ampicillin i en 250-milliliter Erlenmeyer kolbe.Kolben anbringes på en shaker ved 225 omdrejninger i minuttet for at inkubere ved 37 grader Celsius i 16 til 18 timer. Derefter overføres 20 milliliter af den inkuberede kultur til en fire-liters kolbe fyldt med en liter LB-ampicillin. Ryst ved 225 omdrejninger i minuttet ved 37 grader Celsius.Hver time trække en milliliter af kulturen i en cuvette at måle den optiske tæthed på 600 nanometer på et fotometer. Efterhånden som kulturoptiske tæthed stiger næsten 0,5, øges målefrekvensen til hvert 15. Derefter overføre fire-liters kolbe til en bin af is.Kolben hvirvles om i isbadet for at reducere kulturtemperaturen. Overfør den fire-liters kolbe til en kuvøse ved 17 grader Celsius og 180 rpm. Fortsæt med at overvåge OD600 hvert 20.Ved 0,7 OD600, tilsæt IPTG og ammonium jernsulfat hexahydrat lageropløsninger for at nå en endelig koncentration på 0,5 millimolar og 10 mg pr. liter, hhv. Ryst kulturen ved 180 omdrejninger i minuttet og 17 grader Celsius i 18 timer. Efter inkubation anbringes kulturkolben i is i to minutter.Høst en milliliter af de inducerede celler i et 1,5 milliliter polypropylen mikrocentrifugerør til SDS-PAGE analyse. Dernæst hæld bakteriekulturen i flasker, 500 milliliter hver flaske, til centrifugering. Pellet kulturen ved fire grader Celsius og 3,000 gange g i 20 minutter.Dekantere supernatanterne. Pipette til resuspend pellets, hver i 12,5 milliliter kold PBS, og kombinere hver to resuspensions i en 50-milliliter konisk rør. Pellet cellerne igen som tidligere.Derefter kasseres supernatanterne, og brug en pipette til at tilføje 10 milliliter lysis buffer i hvert rør til at resuspendere cellerne. Efter sonikering af rørene med inducerede celler hældes bakterielyatet i en forkølet polycarbonatflaske. Centrifuge i 60 minutter ved 120, 000 gange g og fire grader Celsius, og hæld supernatanten til et koldt 50-milliliter konisk rør.Efter fremstilling af FPLC-instrumentet med den nikkelberegnede harpikssøjle anbringes prøven i kolonnen ved 0,15 milliliter pr. minut. Kolonnen vaskes med 20 milliliter nikkelbuffer ved 20-millimolar imidazol. Vasken opbevares i et 50-milliliterrør til analyse.Dernæst vaskes kolonnen med 15 milliliter nikkelbuffer ved 125-millimolar imidazol. Opsaml elueringen i 19 fraktioner af 0,8 milliliter hver. Kolonnen vaskes igen med 15 milliliter 100%nikkelbuffer B, og der opsaml yderligere 75 fraktioner på hver 0,2 milliliter.Fortsæt med analysen af de indsamlede fraktioner på 12% SDS-PAGE geler for at bekræfte tilstedeværelsen af PCD. Først tilsættes 35 mikroliter reaktionsbuffer til et 1,5 milliliter polypropylen mikrocentrifugerør. I røret, kombinere fem mikroliter af toppen kromatografi fraktioner og 500 nanogram af tre-kilobase par supercoiled plasmid pXba.Placer røret i et vandbad ved 37 grader Celsius i en time. Efter at have forberedt agarosegel i henhold til manuskriptet tilsættes 30 mikroliter af hver reaktion i brønde i gelen. Elektroforese ved 10 volt pr. centimeter ved omgivelsestemperatur i ca. en time.Nu har det orange G farvestof nået slutningen af gelen. Brug straks en fluorescensscanner til at afbilde ethidiumbromidsignalet af gelen. Med funktionen af intensiteten og billedpixelstørrelsen skal du bestemme pixelvolumenet for de forskellige DNA-arter, f.eks.For at bestemme procentdelen af hver DNA-art skal pixelmængden af en enkelt DNA-art divideres med den samlede pixelvolumen for alle individuelle arter. SDS-PAGE-analysen viser, at den anden elution-top indeholder minimal proteinforurening, som repræsenterer næsten ren PCD-heterodimer og minimal til målbarnukleaseaktivitet. Således kombinere disse 10 fraktioner fra den anden PCD eluering i en fem-milliliter konisk rør til yderligere analyse.Efter størrelse-eksklusion kromatografi rensning af PCD, i en fire-graders Celsius koldt rum, kombinere i en mikrocentrifuge rør passende volumen af natriumchlorid, Tris hydrochlorid, magnesiumchlorid, dithiothreitol, PCA, og supercoiled plasmid pXba at gøre en 5X lager. Placer en 96-brønd fladbundsplade på is, og overfør 10 mikroliter af den kombinerede 5X-opløsning til brøndene. Umiddelbart før analyse, tilføje til hver godt 10 mikroliter af de enkelte PCD SEC fraktioner.Indstil pladelæseren til en indre temperatur på 37 grader Celsius, og overfør 96-brøndpladen til pladeholderen. Træk pladeholderen tilbage til instrumentet, og mål absorbansen med 290 nanometer med 20 sekunders mellemrum i en time. Indstil instrumentet til at ryste pladen fem sekunder før hver aflæsning.Efter en time tilsættes 10 mikroliter stopopløsning til hver brønd for at afslutte reaktionerne. Udfør gelelektrophoresis til PCD SEC-fraktionerne. Vælg fraktioner med den mest PCA-oxidationsaktivitet, angivet ved nedsat absorbans og ingen observeret nukleaseforurening.Absorbansen måles ved 280 nanometer, og den samlede PCD-koncentration beregnes på grundlag af absorbansen og udryddelseskoefficienten. Opbevar de valgte brøker til langtidsopbevaring ved minus 80 grader Celsius. I dette eksperiment, Blev det konstateret, at rekombinant PCD, en heterodimer af hexahistidine mærkede pcaH og pcaG, blev udtrykt i E.coli.Heterodimeren blev først renset af nikkelaffinadelighedkromatografi. Absorbansen vises med blåt, og procentkoncentrationen af nikkelbuffer B vises med rødt. Flow-through viser de opløselige bakterielle proteiner, der ikke binder sig til nikkel harpiks.Nogle PCD eluted i overværelse af 125-millimolar imidazol, men størstedelen af proteinet eluted i 250-millimolar imidazol. Repræsentativ SDS-PAGE analyse viser, at fraktionerne fra elution trin var fri for forurenende stoffer. Agarose gel af nuclease assay afslører forurening ved at sammenligne med den negative kontrol uden tilsat protein og en positiv kontrol forurenet med en DNA nuklease.Kvantisering af de forskellige DNA-arter, der blev observeret i agarosegel nukleaseanalysen, viser, at fraktionerne 29 til 38 havde lidt nukleaseaktivitet, som blev valgt til at blive kombineret, koncentreret og yderligere renset af SEC. Data fra tre repræsentative SEC-fraktioner viste, at renset PCD reducerede absorbansen ved 290 nanometer, hvilket indikerer oxidation af PCA. Efter denne procedure, den rensede PCD kan anvendes og optimeret i den ønskede ilt skyllesystem.Dette vil bestemme den nøjagtige mængde PCD, der kræves til systemet. Denne teknik er blevet brugt til at forlænge fluorophore levetid i enkelt molekyle mikroskopi eksperimenter, som har tilladt i længere perioder af dataindsamling. Den anvendte ultracentrifuge er farlig.Sørg for, at centrifugerne er korrekt afbalanceret, før de drejer rundt. Ethidiumbromid er et farligt reagens. Undgå kontakt ved at bære personlige værnemidler, og bortskaffe det korrekt.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Termostabilisering, Expression, Rensning, og Krystallisation af Human Serotonin Transporter Bundet til<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Ekspression, oprensning og antimikrobiell aktivitet af S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rensning og rekonstituering af TRPV1 for spektroskopisk analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Proteinekspression og -oprensning af pattedyr Bestrophin Ion kanaler

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Prøveudtagning og forbehandling af tand emalje carbonat for stabil Carbon og Oxygen isotop analyser

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerob Protein oprensning og kinetisk analyse via ilt elektrode til at studere DesB Dioxygenase aktivitet og hæmning

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Måling og fortolke ilt forbrug satser helt flyve hoved segmenter

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Proteinekspression og -oprensning af menneskelige Lipid-følsomme kation kanal TRPC3 for Strukturbestemmelse af enkelt-partikel kryo-elektronmikroskopi

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Udtryk, oploesning og rensning af eukaryote Borat transportører

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...