Name: expression and purification of nuclease-free oxygen scavenger protocatechuate 3,4-dioxygenase
Uploaded: 2019-11-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door NIH GM121284 en AI126742 to KEY.

1. induceren PCD expressie in E. coli
<ol><li>Combineer 1 μL pVP91A-pcaHG-expressie plasmide (20 ng/μL, Figuur 1A) en 20 μl E. coli BL21 (in de handel verkrijgbare cellen van 20 μl, > 2 x 106 CFU/μg plasmide) in een buisje. Veeg de buis om te mengen. Plaats de buis op ijs 5 min.</li>
	<li>Plaats de transformatie bij 42 °C gedurende 30 sec. Vervolgens ijs 2 min.</li>
	<li>Voeg 80 μL Soc-media (Super optimale bouillon met van-onderdrukking...

<ol>
	<li>Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+single+fluorescent+molecules.">Detection of single fluorescent molecules.</a> Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).</li><li>Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+reactive+oxygen+species+to+the+photobleaching+of+organic+fluorophores.">The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores.</a> Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).</li><li>Ha, T., Tinnefeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photophysics+of+fluorescent+probes+for+single-molecule+biophysics+and+super-resolution+imaging.">Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).</li><li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy:+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy.">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).</li><li>Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+species+formed+on+proteins+exposed+to+singlet+oxygen.">Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen.</a> Photochemical &#38; Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).</li><li>Sies, H., Menck, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Singlet+oxygen+induced+DNA+damage.">Singlet oxygen induced DNA damage.</a> Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).</li><li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments.">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li><li>Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+coupling+in+actomyosin+energy+transduction+studied+by+in+vitro+movement+assay.">Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay.</a> Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).</li><li>Shi, X., Lim, J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidification+of+the+oxygen+scavenging+system+in+single-molecule+fluorescence+studies:+in+situ+sensing+with+a+ratiometric+dual-emission+probe.">Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe.</a> Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).</li><li>Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+analyses+of+designed+and+selected+mutants+of+protocatechuate+3,4-dioxygenase1.">Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1.</a> Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).</li><li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems.">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li><li>Senavirathne, G., Lopez, M. A., Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+nuclease-free+protocatechuate+3,4-dioxygenase+for+prolonged+single-molecule+fluorescence+imaging.">Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging.</a> Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nature Communications. 7, 11409 (2016).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cascading+MutS+and+MutL+sliding+clamps+control+DNA+diffusion+to+activate+mismatch+repair.">Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair.</a> Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).</li></ol>

Zuurstof opruimings systemen worden vaak opgenomen in één molecuul fluorescentiemicroscopie om fotobleaching3,7,8te verminderen. Deze microscopie technieken worden vaak gebruikt om nucleïnezuren of eiwit interacties met nucleïnezuren te observeren1,13,14. Verontreiniging van OSSs met nucleasen kan leiden tot valse resultaten.
<p...

Single molecuul (SM) biofysica is een snel groeiend veld dat de manier waarop we naar biologische fenomenen kijken verandert. Dit veld heeft de unieke mogelijkheid om fundamentele wetten van de fysica en chemie te koppelen aan de biologie. Fluorescentiemicroscopie is een biofysische methode die SM-gevoeligheid kan bereiken. Fluorescentie wordt gebruikt om biomoleules te detecteren door ze te koppelen aan kleine organische fluor Foren of Quantum dots1. Deze moleculen kunnen fotonen uitzenden wanneer ze opgewonden worden door lasers voordat ze onomkeerbaar2fotobleaching. Fotobleaching treedt op wanneer de fluorescerende etiketten chemische schade ondergaan die hun vermogen om te prikkelen op de gewenste golflengte2,3vernietigt. De aanwezigheid van reactieve zuurstof soorten (Ros) in waterige buffer zijn een primaire oorzaak van photobleaching2,4. Bovendien kan Ros biomoleules beschadigen en leiden tot foutieve waarnemingen in SM-experimenten5,6. Om oxidatieve schade te voorkomen, kunnen zuurstof opruimings systemen (OSS) worden gebruikt3,7,8. Het glucose oxidase/catalase (GODCAT) systeem is efficiënt in het verwijderen van zuurstof8, maar het produceert potentieel schadelijke peroxiden als tussen producten. Deze kunnen schadelijk zijn voor biomoleules van belang in SM-studies.
Als alternatief, protocatechuate 3, 4 dioxygenase (PCD) zal efficiënt verwijderen O2 van een waterige oplossing met behulp van de substraat protocatechuïnezuur zuur (PCA)7,9. PCD is een metalloenzym dat nonheme ijzer gebruikt om PCA te coördineren en de catechol ringopening reactie te katalyseren met behulp van opgeloste O210. Deze One-Step reactie is een algemeen betere OSS voor het verbeteren van de stabiliteit in SM experimenten7. Helaas bevatten veel in de handel verkrijgbare OSS-enzymen, waaronder PCD, contaminerende nucleasen11. Deze verontreinigingen kunnen leiden tot de schade van op nucleïnezuur gebaseerde substraten die in SM-experimenten worden gebruikt. Dit werk zal verhelderden een op chromatografie gebaseerd zuiverings protocol voor het gebruik van recombinant PCD in SM-systemen. PCD kan breed worden toegepast op elk experiment waarbij ROS schadelijke substraten zijn die nodig zijn voor het verzamelen van gegevens.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>&#946;ME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, Glacial Certified ACS</td>
			<td>Fisherl Chemical</td>
			<td>A38C-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Granulated</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>DF0145-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA FPLC System</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC201024</td>
			<td>10 kDa MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F-2262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS) Tablets</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>K833-100TABS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0339-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>DF0123173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90004-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIS-TRIS propane,&#62;=99.0% (titration)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6755-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0472-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96&#8211;Well Flat&#8211;Bottom EIA Plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2240096EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>P212121</td>
			<td>SV-DTT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 500ML</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G37-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granulated LB Broth Miller</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>1.10285.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Res Standard Agarose</td>
			<td>AGTC Bioproducts</td>
			<td>AG500D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0250-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11017128001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from Chicken Egg White</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0288-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>P212121</td>
			<td>RP-S23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow (100 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novagen BL21 Competent Cells</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>69-449-3</td>
			<td>SOC media included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0-267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>P-020-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0754-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN15642110</td>
			<td>PCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>P212121</td>
			<td>CI-00270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M2 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devises</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane &#62; 250mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-741-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane &#62; 500mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-741-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 12 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17517301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0761-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Ultra Pure</td>
			<td>Gojira Fine Chemicals</td>
			<td>UTS1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure EDTA</td>
			<td>Invitrogen/Gibco</td>
			<td>15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208086</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression and purification of nuclease-free oxygen scavenger protocatechuate 3,4-dioxygenase

Enkelvoudige molecuul (SM) microscopie wordt gebruikt in de studie van dynamische moleculaire interacties van de gelabelde biomoleules in real time. Echter, fluoroforen zijn gevoelig voor verlies van signaal via photobleaching door opgeloste zuurstof (O2). Om fotobleking te voorkomen en de levensduur van de te verlengen, worden zuurstof opruimings systemen (OSS) gebruikt om O2te verminderen. In de handel verkrijgbare OSS kan verontreinigd zijn door nucleasen die nucleïnezuren beschadigen of degraderen, waardoor de experimentele resultaten worden geïnterpreteerd. Hier gedetailleerd een protocol voor de expressie en zuivering van zeer actieve Pseudomonas putida protocatechuate-3, 4-dioxygenase (PCD) zonder detecteerbare Nuclease besmetting. PCD kan efficiënt verwijderen reactieve O2 soorten door omzetting van het substraat protocatechuïnezuur zuur (PCA) 3-Carboxy-CIS, CIS-muconic Acid. Deze methode kan worden gebruikt in elk watersysteem waarbij O2 een nadelige rol speelt bij het verzamelen van gegevens. Deze methode is effectief in het produceren van zeer actieve, Nuclease vrije PCD in vergelijking met commercieel beschikbare PCD.

In de handel verkrijgbare zuurstof Scavenger PCD is vaak verontreinigd met een DNA-Nuclease. Contaminerende Nuclease activiteit kan leiden tot valse resultaten in fluorescerende studies, met name studies die DNA analyseren of DNA interactie eiwitten. We hebben geconstateerd dat recombinant PCD, een heterodimer van hexahistidine gelabeld pcaH en pcaG, kan worden uitgedrukt in E. coli (Figuur 1). De heterodimer wordt eerst gezuiverd door nikkel-affiniteits chro...

Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase at JoVE.com

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Protocatechuate 3, 4-dioxygenase (PCD) kan enzymatisch vrij diatomaire zuurstof verwijderen uit een watersysteem met behulp van de substraat protocatechuïnezuur zuur (PCA). Dit protocol beschrijft de expressie, zuivering, en activiteit analyse van deze enzym voor het opruimen van zuurstof.

Expressie en zuivering van Nuclease-vrije zuurstof Scavenger Protocatechuate 3, 4-dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Ons protocol levert zeer actieve PCD vrij van detecteerbare nuclease, die kan worden gebruikt in elke oplossing waar waterige zuurstof is een verontreiniging. De technieken die we gebruiken zijn eenvoudig te repliceren en zorgen ervoor dat er geen nuclease verontreinigingen aanwezig zijn in het product. Om te beginnen, combineren een microliter van pVP91A-pcaHG PCD expressie plasmid en 20 microliters van commercieel verkrijgbaar E.coli BL21 in een buis.Veeg de buis te mengen, en plaats de buis op ijs gedurende vijf minuten. Om de transformatiereactie voort te zetten, plaatst u de buis in een waterbad op 42 graden Celsius gedurende 30 seconden en vervolgens gedurende twee minuten op ijs. Voeg 80 microliter SOC-media toe en schud een uur lang bij 225 rpm en 37 graden Celsius.Giet vervolgens het transformatiereactiemengsel op een LB-ampicilline agar en gebruik een plaatspreader om het mengsel te verspreiden. Bedek de plaat met een deksel en broed de plaat 16 tot 18 uur in op 37 graden Celsius. Kies daarna een kolonie van de plaat en inent in 50 microliter LB-ampicilline in een Erlenmeyer-kolf van 250 milliliter.Plaats de kolf op een shaker bij 225 rpm om 16 tot 18 uur bij 37 graden Celsius in te broeden. Breng vervolgens 20 milliliter van de geïncubeerde cultuur over naar een vierliter kolf gevuld met een liter LB-ampicilline. Schud bij 225 rpm bij 37 graden Celsius.Elk uur, teken een milliliter van de cultuur in een cuvette om de optische dichtheid te meten op 600 nanometer op een fotometer. Naarmate de optische dichtheid van de cultuur toeneemt in de buurt van 0,5, verhoogt u de frequentie van metingen tot elke 15 minuten, totdat de OD600 0,5 bereikt. Breng vervolgens de vierliter kolf over in een bak ijs.Draai de kolf in het ijsbad om de cultuurtemperatuur te verlagen. Breng de vierliter kolf over naar een couveuse bij 17 graden Celsius en 180 tpm. Blijf de OD600 elke 20 minuten in de gaten houden.Voeg bij 0,7 OD600 IPTG- en ammoniumijzersulfaatsuxahydraatoplossingen toe om een uiteindelijke concentratie van respectievelijk 0,5 millimolar en 10 milligram per liter te bereiken. Schud de cultuur bij 180 tpm en 17 graden Celsius gedurende 18 uur. Na incubatie, plaats de cultuurfles twee minuten in ijs.Oogst een milliliter van de geïnduceerde cellen in een 1,5-milliliter polypropyleen microcentrifuge buis voor SDS-PAGE analyse. Giet vervolgens de bacteriecultuur in flessen, 500 milliliter per fles, voor centrifugatie. Pellet de cultuur op vier graden Celsius en 3.000 keer g gedurende 20 minuten.Decanteer de supernatants. Pipette om de pellets opnieuw op te stellen, elk in 12,5 milliliter koude PBS, en combineer elke twee resuspensions in een 50-milliliter conische buis. Pellet de cellen weer als voorheen.Gooi vervolgens de supernatants weg en gebruik een pipet om 10 milliliter lysebuffer in elke buis toe te voegen om de cellen opnieuw op te hangen. Na het soniceren van de buizen met geïnduceerde cellen, giet de bacteriële lysate in een voorgekoelde polycarbonaat fles. Centrifugeer gedurende 60 minuten op 120, 000 keer g en vier graden Celsius, en giet de supernatant tot een koude 50-milliliter conische buis.Na het voorbereiden van FPLC-instrument met de nikkel-geladen harskolom, laad het monster op de kolom op 0,15 milliliter per minuut. Was de kolom met 20 milliliter nikkelbuffer bij 20 millimolar imidazool. Bewaar de was in een buis van 50 milliliter voor analyse.Was vervolgens de kolom met 15 milliliter nikkelbuffer bij 125 millimolar imidazool. Verzamel de elutie in 19 fracties van 0,8 milliliter per stuk. Was de kolom opnieuw met 15 milliliter van 100%nikkelbuffer B en verzamel nog eens 75 fracties van 0,2 milliliter per stuk.Ga verder met de analyse van de verzamelde fracties op 12%SDS-PAGE gels om de aanwezigheid van PCD te bevestigen. Voeg eerst 35 microliter reactiebuffer toe aan een 1,5 milliliter polypropyleen microcentrifugebuis. Combineer in de buis vijf microliters van de piekchromatografiefracties en 500 nanogram van drie kilobasispaar supercoiled plasmid pXba.Plaats de buis in een waterbad op 37 graden Celsius gedurende een uur. Na het bereiden van agarose gel volgens het manuscript, voeg 30 microliter van elke reactie in putten in de gel. Elektrophorese bij 10 volt per centimeter bij omgevingstemperatuur gedurende ongeveer een uur.Nu heeft de oranje G kleurstof het einde van de gel bereikt. Gebruik onmiddellijk een fluorescentiescanner om het ethidium bromidesignaal van de gel in beeld te brengen. Met de functie van de intensiteit en beeld pixelgrootte, bepaal het pixelvolume van de verschillende DNA-soorten, zoals supercoiled, lineaire en gejat cirkels.Als u het percentage van elke DNA-soort wilt bepalen, deelt u het pixelvolume van één DNA-soort door het totale pixelvolume voor alle afzonderlijke soorten. De SDS-PAGE analyse toont aan dat de tweede elutiepiek minimale eiwitverontreiniging bevat, wat bijna zuiver PCD-heterodimeer en minimale tot niet-detecteerbare nuclease-activiteit vertegenwoordigt. Combineer deze 10 fracties van de tweede PCD-elutie dus in een conische buis van vijf milliliter voor verdere analyse.Na grootte-uitsluiting chromatografie zuivering van PCD, in een vier-graden Celsius koude ruimte, combineren in een microcentrifuge buis geschikt volume van natriumchloride, Tris hydrochloride, magnesiumchloride, dithiothreitol, PCA, en supercoiled plasmid pXba om een 5X voorraad te maken. Plaats een 96-well platte bodemplaat op ijs en breng 10 microliter van de gecombineerde 5X-oplossing over naar de putten. Voeg vlak voor de analyse aan elke bron 10 microliters van de afzonderlijke PCD SEC-fracties toe.Stel de plaatlezer in op een interne temperatuur van 37 graden Celsius en breng de plaat van 96 put over naar de plaathouder. Trek de plaathouder in het instrument en meet de absorptie op 290 nanometer met intervallen van 20 seconden gedurende een uur. Stel het instrument in om de plaat vijf seconden voor elke meting te schudden.Voeg na een uur 10 microliter stopoplossing toe aan elke put om de reacties te beëindigen. Voer gel elektroforese uit voor de PCD SEC-fracties. Selecteer breuken met de meeste PCA-oxidatieactiviteit, aangegeven door verminderde absorptie en geen waargenomen nuclease-verontreiniging.Meet de absorptie op 280 nanometer en bereken de totale PCD-concentratie op basis van de absorptie- en uitstervingscoëfficiënt. Bewaar de geselecteerde fracties voor langdurige opslag bij min 80 graden Celsius. In dit experiment bleek dat recombinant PCD, een heterodimeer van hexahistidine met pcaH en pcaG, werd uitgedrukt in E.coli.Het heterodimeer werd voor het eerst gezuiverd door nikkel affiniteit chromatografie. De absorptie wordt weergegeven in blauw, en de procentconcentratie van nikkelbuffer B wordt in het rood weergegeven. De flow-through toont de oplosbare bacteriële eiwitten die zich niet binden aan de nikkelmeren.Sommige PCD eluted in de aanwezigheid van 125-millimolar imidazool, maar de meerderheid van het eiwit eluted in 250-millimolar imidazool. Representatieve SDS-PAGE analyse geeft aan dat de fracties van de elution stap vrij waren van verontreinigingen. Agarose gel van nuclease test onthult besmetting door te vergelijken met de negatieve controle zonder toegevoegde eiwitten en een positieve controle besmet met een DNA nuclease.Kwantificering van de verschillende DNA-soorten waargenomen in de agarose gel nuclease test toont fracties 29 tot en met 38 had weinig nuclease activiteit, die werden gekozen om te worden gecombineerd, geconcentreerd, en verder gezuiverd door SEC. Gegevens van drie representatieve SEC fracties bleek dat gezuiverde PCD verminderde de absorptie op 290 nanometer, wat wijst op oxidatie van PCA. Na deze procedure kan de gezuiverde PCD worden gebruikt en geoptimaliseerd in het gewenste zuurstofopruimsysteem.Dit bepaalt de exacte hoeveelheid PCD die nodig is voor het systeem. Deze techniek is gebruikt om fluorofophore levens te verlengen in microscopie-experimenten met één molecuul, waardoor voor langere perioden van gegevensverzameling is toegestaan. De gebruikte ultracentrifuge is gevaarlijk.Zorg ervoor dat centrifuges goed in balans zijn voorafgaand aan het spinnen. Ethidium bromide is een gevaarlijk reagens. Vermijd contact door het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen, en gooi het op de juiste manier.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, expressie, zuivering en kristallisatie van het Human serotonine transporter Gebonden aan<em&gt; S</em&gt; citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Expressie, zuivering en antimicrobiële activiteit van S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Zuivering en reconstructie van TRPV1 spectroscopische p.a.

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Meningsuiting en zuivering van zoogdier Bestrophin ionenkanalen

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Monstername en voorbehandeling van tandglazuur carbonaat voor stabiele koolstof en zuurstof isotoop analyse

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaërobe EiwitReiniging en kinetische analyse via zuurstof-elektrode voor het bestuderen van de activiteit van de DesB Dioxygenase en inhibitie

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Meten en interpreteren van zuurstof verbruik geheel vliegen hoofd segmenten

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Meningsuiting en zuivering van de TRPC3 mens lipide-gevoelige catie kanaal voor structurele bepaling door Single-deeltje Cryo-elektronenmicroscopie

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Meningsuiting, solubilisatie en zuivering van eukaryotische boraat Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...