Name: expression and purification of nuclease-free oxygen scavenger protocatechuate 3,4-dioxygenase
Uploaded: 2019-11-08T13:00:00
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1. Induire l'expression PCD dans E. coli
<ol><li>Combinez 1 plasmide d'expression PCD de l'AL pVP91A-pcaHG (20 ng/L, Figure 1A) et 20 'L d'E. coli BL21 (20 cellules disponibles commercialement, 'gt; 2 x 106 cfu/g plasmid) dans un tube. Feuilleter le tube pour mélanger. Placer le tube sur la glace 5 min.</li>
	<li>Placer la transformation à 42 oC pour 30 s. Puis glace 2 min.</li>
	<li>Ajouter 80 'L soC media (super optimal broth with catabolit...

<ol>
	<li>Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+single+fluorescent+molecules.">Detection of single fluorescent molecules.</a> Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).</li><li>Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+reactive+oxygen+species+to+the+photobleaching+of+organic+fluorophores.">The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores.</a> Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).</li><li>Ha, T., Tinnefeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photophysics+of+fluorescent+probes+for+single-molecule+biophysics+and+super-resolution+imaging.">Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).</li><li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy:+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy.">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).</li><li>Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+species+formed+on+proteins+exposed+to+singlet+oxygen.">Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen.</a> Photochemical &#38; Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).</li><li>Sies, H., Menck, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Singlet+oxygen+induced+DNA+damage.">Singlet oxygen induced DNA damage.</a> Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).</li><li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments.">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li><li>Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+coupling+in+actomyosin+energy+transduction+studied+by+in+vitro+movement+assay.">Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay.</a> Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).</li><li>Shi, X., Lim, J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidification+of+the+oxygen+scavenging+system+in+single-molecule+fluorescence+studies:+in+situ+sensing+with+a+ratiometric+dual-emission+probe.">Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe.</a> Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).</li><li>Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+analyses+of+designed+and+selected+mutants+of+protocatechuate+3,4-dioxygenase1.">Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1.</a> Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).</li><li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems.">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li><li>Senavirathne, G., Lopez, M. A., Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+nuclease-free+protocatechuate+3,4-dioxygenase+for+prolonged+single-molecule+fluorescence+imaging.">Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging.</a> Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nature Communications. 7, 11409 (2016).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cascading+MutS+and+MutL+sliding+clamps+control+DNA+diffusion+to+activate+mismatch+repair.">Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair.</a> Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).</li></ol>

Les systèmes de récupération d'oxygène sont généralement inclus dans la microscopie à fluorescence à molécule unique pour réduire le photoblanchiment3,7,8. Ces techniques de microscopie sont souvent utilisées pour observer les acides nucléiques ou les interactions protéiques avec les acides nucléiques1,13,14. La contaminat...

La biophysique à molécule unique (SM) est un domaine en croissance rapide qui change notre façon de voir les phénomènes biologiques. Ce domaine a la capacité unique de lier les lois fondamentales de la physique et de la chimie à la biologie. La microscopie de fluorescence est une méthode biophysique qui peut atteindre la sensibilité SM. La fluorescence est utilisée pour détecter les biomolécules en les reliant à de petits fluorophores organiques ou à des points quantiques1. Ces molécules peuvent émettre des photons lorsqu'elles sont excitées par des lasers avant de photobleaching irréversiblement2. Photobleaching se produit lorsque les étiquettes fluorescentes subissent des dommages chimiques qui détruit leur capacité à exciter à la longueur d'onde désirée2,3. La présence d'espèces réactives d'oxygène (ROS) dans le tampon aqueux sont une cause primaire de photoblanchiment2,4. En outre, ROS peut endommager les biomolécules et conduire à des observations erronées dans les expériences SM5,6. Pour prévenir les dommages oxydatifs, les systèmes de récupération d'oxygène (OSS) peuvent être utilisés3,7,8. Le système d'oxydase/catalase de glucose (GODCAT) est efficace pour enlever l'oxygène8,mais il produit des peroxydes potentiellement dommageables comme intermédiaires. Ceux-ci peuvent être préjudiciables aux biomolécules d'intérêt dans les études de SM.
Alternativement, protocatechuate 3,4 dioxygenase (PCD) éliminera efficacement O2 d'une solution aqueuse utilisant son acide protocatechuic de substrat (PCA)7,9. PCD est un métalloenzyme qui utilise le fer nonheme pour coordonner PCA et catalyser la réaction d'ouverture de l'anneau catéchol en utilisant dissous O210. Cette réaction d'une étape s'est avérée être un OSS globalement meilleur pour améliorer la stabilité du fluorophore dans les expériences SM7. Malheureusement, de nombreuses enzymes OSS disponibles dans le commerce, y compris le PCD, contiennent des nucléases contaminantes11. Ces contaminants peuvent endommager les substrats à base d'acide nucléique utilisés dans les expériences SM. Ces travaux permettront d'élucider un protocole de purification à base de chromatographie pour l'utilisation de PCD recombinant dans les systèmes SM. Le PCD peut être largement appliqué à toute expérience où les ROS sont des substrats dommageables nécessaires à l'acquisition de données.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>&#946;ME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, Glacial Certified ACS</td>
			<td>Fisherl Chemical</td>
			<td>A38C-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Granulated</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>DF0145-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA FPLC System</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC201024</td>
			<td>10 kDa MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F-2262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS) Tablets</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>K833-100TABS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0339-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>DF0123173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90004-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIS-TRIS propane,&#62;=99.0% (titration)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6755-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0472-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96&#8211;Well Flat&#8211;Bottom EIA Plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2240096EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>P212121</td>
			<td>SV-DTT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 500ML</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G37-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granulated LB Broth Miller</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>1.10285.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Res Standard Agarose</td>
			<td>AGTC Bioproducts</td>
			<td>AG500D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0250-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11017128001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from Chicken Egg White</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0288-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>P212121</td>
			<td>RP-S23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow (100 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novagen BL21 Competent Cells</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>69-449-3</td>
			<td>SOC media included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0-267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>P-020-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0754-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN15642110</td>
			<td>PCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>P212121</td>
			<td>CI-00270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M2 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devises</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane &#62; 250mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-741-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane &#62; 500mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-741-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 12 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17517301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0761-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Ultra Pure</td>
			<td>Gojira Fine Chemicals</td>
			<td>UTS1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure EDTA</td>
			<td>Invitrogen/Gibco</td>
			<td>15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208086</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression and purification of nuclease-free oxygen scavenger protocatechuate 3,4-dioxygenase

La microscopie à molécule unique (SM) est utilisée dans l'étude des interactions moléculaires dynamiques des biomolécules étiquetées fluorophore en temps réel. Cependant, les fluorophores sont sujets à la perte de signal par photoblanchiment par l'oxygène dissous (O2). Pour prévenir le photoblanchiment et prolonger la durée de vie du fluorophore, des systèmes de récupération d'oxygène (OSS) sont utilisés pour réduire L'O2. Les OSS disponibles dans le commerce peuvent être contaminés par des nucléases qui endommagent ou dégradent les acides nucléiques, ce qui confond l'interprétation des résultats expérimentaux. Ici nous détaillons un protocole pour l'expression et la purification du protocatechuate fortement actif de Pseudomonas de Pseudomonas-3,4-dioxygenase (PCD) sans contamination détectable de nucléane. Le PCD peut éliminer efficacement les espèces réactives O2 en reconversion de l'acide protocatechuic substrat (PCA) en acide 3-carboxy-cis,cis-muconic. Cette méthode peut être utilisée dans n'importe quel système aqueux où O2 joue un rôle préjudiciable dans l'acquisition de données. Cette méthode est efficace dans la production de PCD très actif et sans nucléane par rapport au PCD disponible dans le commerce.

Le PCD de récupération d'oxygène disponible dans le commerce est fréquemment contaminé par une nucléase d'ADN. La contamination de l'activité nucléase pourrait mener à de faux résultats dans des études fluorescentes, en particulier des études qui analysent l'ADN ou l'ADN interagissant protéines. Nous avons constaté que le PCD recombinant, un hétérodiste d'hexahistidine marqué pcaH et pcaG, peut être exprimé dans E. coli (Figure 1). L'hété...

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Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) peut enzymatiquement enlever l'oxygène diatomique libre d'un système aqueux utilisant son acide protocatechuic de substrat (PCA). Ce protocole décrit l'expression, la purification, et l'analyse d'activité de cette enzyme de récupération d'oxygène.

Expression et purification de nuclease-Free Oxygen Sccatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Notre protocole produit un PCD très actif exempt de nucléase détectable, qui peut être utilisé dans n’importe quelle solution où l’oxygène aqueux est un contaminant. Les techniques que nous utilisons sont faciles à reproduire et garantissent qu’aucun contaminant nucléase n’est présent dans le produit. Pour commencer, combinez un microlitre de plasmide d’expression PCD pVP91A-pcaHG et 20 microlitres d’E.coli BL21 disponible dans le commerce dans un tube.Feuilleter le tube pour mélanger et placer le tube sur la glace pendant cinq minutes. Pour poursuivre la réaction de transformation, placez le tube dans un bain d’eau à 42 degrés Celsius pendant 30 secondes, puis sur la glace pendant deux minutes. Ajouter 80 microlitres de soc média, et secouer à 225 rpm et 37 degrés Celsius pendant une heure.Ensuite, versez le mélange de réaction de transformation sur une agar lb-ampicilline, et utilisez un ép étaleur de plaques pour étendre le mélange. Couvrir la plaque d’un couvercle et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 16 à 18 heures. Après cela, choisissez une colonie de la plaque, et inoculer dans 50 microlitres de LB-ampicilline dans un flacon Erlenmeyer de 250 millilitres.Placez le flacon sur un shaker à 225 rpm pour incuber à 37 degrés Celsius pendant 16 à 18 heures. Ensuite, transférez 20 millilitres de la culture incubée dans une fiole de quatre litres remplie d’un litre d’ampicilline LB. Agiter à 225 rpm à 37 degrés Celsius.Chaque heure, dessinez un millilitre de la culture dans une cuvette pour mesurer la densité optique à 600 nanomètres sur un photomètre. À mesure que la densité optique de la culture augmente de près de 0,5, augmentez la fréquence des mesures toutes les 15 minutes, jusqu’à ce que l’OD600 atteigne 0,5. Ensuite, transférez le flacon de quatre litres dans un bac de glace.Faites tourbillonner le flacon dans le bain de glace pour réduire la température de culture. Transférer le flacon de quatre litres dans un incubateur à 17 degrés Celsius et 180 rpm. Continuez à surveiller l’OD600 toutes les 20 minutes.À 0,7 OD600, ajouter des solutions de stock d’hexahydrate d’hexahydrate de fer IPTG et ammonium pour atteindre une concentration finale de 0,5 millimolar et 10 milligrammes par litre, respectivement. Secouez la culture à 180 rpm et 17 degrés Celsius pendant 18 heures. Après l’incubation, placer le flacon de culture dans la glace pendant deux minutes.Récoltez un millilitre des cellules induites dans un tube de microcentrifugeuse en polypropylène de 1,5 millilitre pour l’analyse SDS-PAGE. Ensuite, versez la culture bactérienne dans des bouteilles, 500 millilitres par bouteille, pour centrifugation. Pelleter la culture à quatre degrés Celsius et 3000 fois g pendant 20 minutes.Décanter les surnatants. Pipette pour résuspendre les granulés, chacun dans 12,5 millilitres de PBS froid, et combiner toutes les deux resuspensions dans un tube conique de 50 millilitres. Pelleter les cellules à nouveau comme précédemment.Ensuite, jetez les supernatants, et utilisez une pipette pour ajouter 10 millilitres de tampon de lyse dans chaque tube pour résuspendre les cellules. Après avoir sonné les tubes avec des cellules induites, verser le lysate bactérien dans une bouteille de polycarbonate pré-refroidi. Centrifugeuse pendant 60 minutes à 120 000 fois g et quatre degrés Celsius, et verser le supernatant dans un tube conique froid de 50 millilitres.Après avoir préparé l’instrument FPLC avec la colonne de résine chargée de nickel, chargez l’échantillon jusqu’à la colonne à 0,15 millilitres par minute. Lavez la colonne avec 20 millilitres de tampon de nickel à l’imidazole de 20 millimlaires. Conserver le lavage dans un tube de 50 millilitres pour analyse.Ensuite, lavez la colonne avec 15 millilitres de tampon de nickel à 125 millimolar imidazole. Recueillir l’élitution en 19 fractions de 0,8 millilitres chacune. Lavez à nouveau la colonne avec 15 millilitres de tampon B à 100 % nickel, et recueillez 75 fractions supplémentaires de 0,2 millilitre chacune.Poursuivre l’analyse des fractions collectées sur des gels SDS-PAGE à 12 % pour confirmer la présence de PCD. Tout d’abord, ajouter 35 microlitres de tampon de réaction à un tube de microcentrifugeuse en polypropylène de 1,5 millilitre. Dans le tube, combiner cinq microlitres des fractions de chromatographie de pointe et 500 nanogrammes de paire de trois kilobases supercoiled plasmide pXba.Placez le tube dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après avoir préparé du gel d’agarose selon le manuscrit, ajouter 30 microlitres de chaque réaction dans les puits du gel. Électrophorese à 10 volts par centimètre à température ambiante pendant environ une heure.Maintenant, le colorant orange G a atteint la fin du gel. Immédiatement, utilisez un scanner de fluorescence pour imager le signal de bromure d’éthidium du gel. Avec la fonction de l’intensité et de la taille des pixels d’image, déterminez le volume de pixels des différentes espèces d’ADN, telles que les cercles supercoilés, linéaires et entaillés.Pour déterminer le pourcentage de chaque espèce d’ADN, divisez le volume de pixels d’une seule espèce d’ADN par le volume total de pixels pour toutes les espèces individuelles. L’analyse SDS-PAGE montre que le deuxième pic d’élitution contient une contamination minimale des protéines, ce qui représente un heterodimer PCD presque pur et une activité nucléase minimale à indétectable. Ainsi, combinez ces 10 fractions de la deuxième elution pcd dans un tube conique de cinq millilitres pour une analyse plus approfondie.Après la purification chromatographie d’exclusion de taille du PCD, dans une pièce froide de quatre degrés Celsius, combinez dans un tube de microcentrifugeuse le volume approprié de chlorure de sodium, d’hydrochlorure de Tris, de chlorure de magnésium, de dithiothreitol, de PCA, et de pXba plasmide supercoiled pour faire un stock de 5X. Placez une plaque à fond plat de 96 puits sur la glace et transférez 10 microlitres de la solution 5X combinée aux puits. Immédiatement avant l’analyse, ajouter à chaque puits 10 microlitres des fractions individuelles de la SEC PCD.Réglez le lecteur de plaque à une température interne de 37 degrés Celsius, et transférez la plaque de 96 puits au porte-plaques. Rétractez le porte-plaques dans l’instrument et mesurez l’absorption à 290 nanomètres à intervalles de 20 secondes pendant une heure. Réglez l’instrument pour secouer la plaque cinq secondes avant chaque lecture.Après une heure, ajouter 10 microlitres de solution d’arrêt à chaque puits pour mettre fin aux réactions. Effectuez l’électrophoresis de gel pour les fractions de SEC de PCD. Sélectionnez les fractions ayant le plus d’activité d’oxydation de l’APC, indiquées par une diminution de l’absorption et aucune contamination par les nucléases observée.Mesurez l’absorption à 280 nanomètres et calculez la concentration totale de PCD en fonction de l’absorption et du coefficient d’extinction. Conservez les fractions sélectionnées pour un stockage à long terme à moins 80 degrés Celsius. Dans cette expérience, il a été constaté que le PCD recombinant, un heterodimer de hexahistidine marqué pcaH et pcaG, a été exprimé dans E.coli.L’heterodimer a d’abord été purifié par chromatographie d’affinité de nickel. L’absorption est indiquée en bleu, et la concentration en pourcentage de nickel tampon B est indiquée en rouge. Le flow-through montre les protéines bactériennes solubles qui ne se lient pas à la résine de nickel.Certains PCD se sont écoulés en présence de l’imidazole de 125 millimolaires, mais la majorité de la protéine s’est élisée dans l’imidazole de 250 millimolar. L’analyse représentative du SDS-PAGE indique que les fractions de l’étape d’élitution étaient exemptes de contaminants. Le gel agarose de l’analyse de nucléase révèle la contamination en comparant avec le contrôle négatif sans protéine ajoutée et un contrôle positif contaminé par une nucléase d’ADN.La quantitation des diverses espèces d’ADN observées dans l’analyse de nucléase de gel d’agarose montre que les fractions 29 à 38 ont eu peu d’activité de nucléase, qui ont été choisies pour être combinées, concentrées, et encore purifiées par SEC. Les données de trois fractions représentatives de SEC ont prouvé que pcd purifié a réduit l’absorption à 290 nanomètres, indiquant oxydation de PCA. Suite à cette procédure, le PCD purifié peut être utilisé et optimisé dans le système de cisaillé d’oxygène désiré.Cela déterminera la quantité exacte de PCD requise pour le système. Cette technique a été utilisée pour prolonger la durée de vie du fluorophore dans le cadre d’expériences de microscopie à molécule unique, ce qui a permis de plus longues périodes de collecte de données. L’ultracentrifugeuse utilisée est dangereuse.Assurez-vous que les centrifugeuses sont bien équilibrées avant de tourner. Le bromure d’éthidium est un réaccéléologue dangereux. Évitez tout contact en portant de l’équipement de protection individuelle et éliminez-le de façon appropriée.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilisation, Expression, purification et cristallisation du Serotonin Human Transporter Bound to<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Recherche

Biochimie

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Expression, purification et activité antimicrobienne de S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Purification et Reconstitution de TRPV1 pour analyse spectroscopique

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Expression et Purification des canaux ioniques de mammifères Bestrophin

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Échantillonnage et prétraitement de l’émail dentaire Carbonate pour stables du carbone et de l’analyse des isotopes d’oxygène

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Purification de protéine anaérobie et l’analyse cinétique via la sonde à oxygène pour l’étude de l’Inhibition et l’activité DesB Dioxygenase

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Mesure et l’interprétation des taux de consommation d’oxygène en tout volent tête Segments

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Expression et Purification de l’homme sensible lipides canal de Cation TRPC3 pour la détermination de structure par particule Cryo microscopie électronique

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Expression, solubilisation et Purification des transporteurs de Borate eucaryotes

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...