Name: expression and purification of nuclease-free oxygen scavenger protocatechuate 3,4-dioxygenase
Uploaded: 2019-11-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי NIH GM121284 ו-AI126742 ל-KEY.

1. לגרום PCD ביטוי E. coli
<ol><li>שילוב 1 μL pVP91A-pcaHG ביטוי PCD ביטויים באמצע (20 ng/μL, איור 1A) ו 20 μl של E. coli BL21 (20מסחריתהתאים זמין, > 2 x 106 cfu/μg פלבאמצע) בצינור. קפיצי את הצינור כדי לערבב. . שים את השפופרת על קרח 5 דקות</li>
	<li>מניחים שינוי ב 42 ° c עבור 30 s. . ואז קרח 2 דקות</li>
	<l...

<ol>
	<li>Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+single+fluorescent+molecules.">Detection of single fluorescent molecules.</a> Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).</li><li>Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+reactive+oxygen+species+to+the+photobleaching+of+organic+fluorophores.">The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores.</a> Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).</li><li>Ha, T., Tinnefeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photophysics+of+fluorescent+probes+for+single-molecule+biophysics+and+super-resolution+imaging.">Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).</li><li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy:+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy.">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).</li><li>Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+species+formed+on+proteins+exposed+to+singlet+oxygen.">Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen.</a> Photochemical &#38; Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).</li><li>Sies, H., Menck, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Singlet+oxygen+induced+DNA+damage.">Singlet oxygen induced DNA damage.</a> Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).</li><li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments.">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li><li>Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+coupling+in+actomyosin+energy+transduction+studied+by+in+vitro+movement+assay.">Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay.</a> Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).</li><li>Shi, X., Lim, J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidification+of+the+oxygen+scavenging+system+in+single-molecule+fluorescence+studies:+in+situ+sensing+with+a+ratiometric+dual-emission+probe.">Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe.</a> Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).</li><li>Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+analyses+of+designed+and+selected+mutants+of+protocatechuate+3,4-dioxygenase1.">Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1.</a> Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).</li><li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems.">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li><li>Senavirathne, G., Lopez, M. A., Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+nuclease-free+protocatechuate+3,4-dioxygenase+for+prolonged+single-molecule+fluorescence+imaging.">Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging.</a> Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nature Communications. 7, 11409 (2016).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cascading+MutS+and+MutL+sliding+clamps+control+DNA+diffusion+to+activate+mismatch+repair.">Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair.</a> Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).</li></ol>

מערכות ניקוי חמצן כלולים בדרך כלל במיקרוסקופ יחיד מיקרוסקופ פלואורסצנטית כדי להפחית את הלבנה3,7,8. טכניקות אלה מיקרוסקופיה משמשות לעתים קרובות כדי להתבונן חומצות גרעין או אינטראקציות חלבונים עם חומצות גרעין1,...

מולקולה יחידה (SM) ביופיזיקה היא שדה הצומח במהירות שינוי הדרך בה אנו מסתכלים על תופעות ביולוגיות. לשדה זה יש את היכולת הייחודית לקשר בין חוקי הפיסיקה והכימיה לביולוגיה. מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית היא אחת שיטה ביופיזית שיכולה להשיג רגישות SM. הקרינה הפלואורסצנטית משמש כדי לזהות biomolecules על ידי קישור אותם fluorophores אורגני קטן או נקודות הקוונטים1. מולקולות אלה יכול לפלוט פוטונים כאשר מתרגש על ידי לייזרים לפני הלבנת הלבנה2. הלבנה מתרחשת כאשר תוויות פלורסנט לעבור נזק כימי אשר הורס את היכולת שלהם להלהיב באורך הגל הרצוי2,3. הנוכחות של מינים חמצן תגובתי (ROS) במאגר מימית הם הגורם העיקרי של photobleaching לבנה2,4. בנוסף, רוס יכול לגרום נזק biomolecules ולהוביל תצפיות שגויות ב ניסויים SM5,6. כדי למנוע נזק חמצוני, מערכות ניקוי חמצן (OSS) ניתן להשתמש3,7,8. מערכת הגלוקוז אוקסידאז/קטלאז (GODCAT) יעילה בסילוק חמצן8, אך היא מייצרת הפרזות עשויות להזיק כintermediates. אלה עלולים להזיק לbiomolecules של עניין בלימודי SM.
לחילופין, protocatechuate 3, 4 diחמצון (pcd) ביעילות להסיר O2 מתוך פתרון מימית באמצעות המצע שלה protocatechuic חומצה (pcd)7,9. PCD הוא מטלואנזים המשתמשת בברזל nonheme כדי לתאם PCD ולזרז את תגובת הפתיחה catechol ring באמצעות מומס O210. זו תגובה צעד אחד מוצג להיות OSS הכולל טוב יותר לשיפור יציבות fluorophore ב ניסויים SM7. למרבה הצער, הרבה אנזימי OSS זמינים מסחרית, כולל PCD, מכילים נוקלאוסים מזהם11. מזהמים אלה יכולים לגרום לנזק של הגרעין מבוססי חומצות מצעים המשמשים בניסויים SM. עבודה זו להבהיר פרוטוקול טיהור מבוסס כרומטוגרפיה לשימוש PCD רקומביננטי במערכות SM. PCD ניתן להחיל באופן כללי על כל ניסוי שבו ROS הם מזיקים מצעים הדרושים עבור רכישת נתונים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>&#946;ME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, Glacial Certified ACS</td>
			<td>Fisherl Chemical</td>
			<td>A38C-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Granulated</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>DF0145-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA FPLC System</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC201024</td>
			<td>10 kDa MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F-2262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS) Tablets</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>K833-100TABS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0339-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>DF0123173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90004-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIS-TRIS propane,&#62;=99.0% (titration)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6755-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0472-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96&#8211;Well Flat&#8211;Bottom EIA Plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2240096EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>P212121</td>
			<td>SV-DTT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 500ML</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G37-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granulated LB Broth Miller</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>1.10285.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Res Standard Agarose</td>
			<td>AGTC Bioproducts</td>
			<td>AG500D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0250-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11017128001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from Chicken Egg White</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0288-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>P212121</td>
			<td>RP-S23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow (100 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novagen BL21 Competent Cells</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>69-449-3</td>
			<td>SOC media included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0-267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>P-020-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0754-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN15642110</td>
			<td>PCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>P212121</td>
			<td>CI-00270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M2 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devises</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane &#62; 250mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-741-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane &#62; 500mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-741-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 12 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17517301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0761-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Ultra Pure</td>
			<td>Gojira Fine Chemicals</td>
			<td>UTS1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure EDTA</td>
			<td>Invitrogen/Gibco</td>
			<td>15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208086</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression and purification of nuclease-free oxygen scavenger protocatechuate 3,4-dioxygenase

מיקרוסקופ אחד (SM) משמש במחקר של אינטראקציות מולקולריות דינמיות של fluorophore המסומנים בזמן אמת. עם זאת, fluorophores נוטים לאבד את האות דרך photobleaching לבנה על ידי חמצן מומס (O2). כדי למנוע הלבנת ולהאריך את תקופת החיים fluorophore מערכות ניקוי חמצן (OSS) מועסקים כדי להפחית O2. OSS זמין מסחרית יכול להיות מזוהם על ידי נוקלאוסים כי נזק או לבזות חומצות גרעין, פרשנות מייסדת של תוצאות ניסיוני. כאן אנו מפרטים פרוטוקול עבור הביטוי והטיהור של פסאודומונס מאוד פעיל protocatechuate-3, 4-diחמצון (pcd) ללא זיהום נוקלאז לזיהוי. PCD יכול באופן יעיל להסיר מינים מגיב O2 על ידי המרה של המצע protocatechuic חומצה (pcd) ל 3-קרבוxy-cis, cis-muconic חומצה. שיטה זו יכולה לשמש בכל מערכת ימית שבה O2 ממלאת תפקיד מזיק ברכישת נתונים. שיטה זו יעילה בהפקת פעיל מאוד, נוקלאז חינם pcd בהשוואה pcd זמין מסחרית.

מסחרית זמין החמצן PCD הוא מזוהם לעתים קרובות עם nuclease DNA. פעילות מזהם נוקלאז עלולה להוביל לתוצאות מזויפות בלימודי פלורסנט, בעיקר מחקרים שניתוח dna או dna אינטראקציה חלבונים. מצאנו כי רקומביננטי PCD, הטרודימר של הקסאחדין מתויג למעלה ו-Pcd, ניתן להתבטא ב-E. coli (איור 1). ...

Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase at JoVE.com

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Protocatechuate 3, 4-דיחמצן (PCD) ניתן להסיר בחינם חמצן diאטומית ממערכת מימית באמצעות המצע שלה protocatechuic חומצה (PCD). פרוטוקול זה מתאר את הביטוי, הטיהור וניתוח הפעילות של אנזים ניקוי החמצן.

ביטוי וטיהור של Nuclease-מזבל החמצן חינם Protocatechuate 3, 4-דיחמצן

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

הפרוטוקול שלנו מניב PCD פעיל מאוד ללא גרעין לגילוי, אשר ניתן להשתמש בו בכל פתרון שבו חמצן מים הוא מזהם. הטכניקות בהן אנו משתמשים קלות לשכפול ומבטיחות שלא יהיו מזהמי גרעין במוצר. כדי להתחיל, לשלב מיקרוליטר אחד של pVP91A-pcaHG PCD ביטוי פלסמיד ו 20 microliters של מסחרי זמין E.coli BL21 בצינור.מצליפים בצינור כדי לערבב, ומ מניחים את הצינור על קרח במשך חמש דקות. כדי להמשיך את תגובת השינוי, מניחים את הצינור באמבט מים ב 42 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות, ולאחר מכן על קרח במשך שתי דקות. הוסיפו 80 מיקרוליטרים של מדיה SOC, ונערו במהירות של 225 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס למשך שעה.לאחר מכן, יוצקים את תערובת תגובת הטרנספורמציה על אגר LB-ampicillin, ולהשתמש מפזר צלחת כדי להפיץ את התערובת. מכסים את הצלחת במכסה, ודוררים את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 עד 18 שעות. לאחר מכן, בחר מושבה אחת מהצלחת, וחסן ב 50 microliters של LB-אמפיצילין בבקבוק ארלנזייר 250 מיליליטר.מניחים את הבקבוקון על שייקר ב 225 סל"ד כדי דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 עד 18 שעות. לאחר מכן, להעביר 20 מיליליטר של התרבות דגירה לבקבוק ארבעה ליטר מלא ליטר אחד של LB-ampicillin. לנער ב 225 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס.בכל שעה, לצייר מיליליטר אחד של התרבות לתוך cuvette כדי למדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר על פוטומטר. ככל שהצפיפות האופטית התרבותית עולה קרוב ל- 0.5, הגדל את תדירות המדידות לכל 15 דקות, עד שה- OD600 יגיע ל- 0.5. לאחר מכן, להעביר את בקבוק ארבעה ליטר לפח קרח.מערבלים את הבקבוק באמבט הקרח כדי להפחית את טמפרטורת התרבות. מעבירים את בקבוק הארבעה ליטר לאנקובטור ב-17 מעלות צלזיוס ו-180 סל"ד. המשך לפקח על OD600 כל 20 דקות.ב 0.7 OD600, להוסיף IPTG ו אמוניום ברזל סולפט hexahydrate פתרונות מלאי להגיע לריכוז הסופי של 0.5 מילימולאר ו 10 מיליגרם לליטר, בהתאמה. לנער את התרבות ב 180 סל"ד ו 17 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות. לאחר הדגירה, מניחים את בקבוק התרבות בקרח במשך שתי דקות.לקצור מיליליטר אחד של התאים המושרה בצינור מיקרו-מרכזיפוג פוליפרופילן 1.5 מיליליטר לניתוח SDS-PAGE. לאחר מכן, יוצקים את תרבות החיידקים לתוך בקבוקים, 500 מיליליטר כל בקבוק, עבור צנטריפוגה. גלולה את התרבות בארבע מעלות צלזיוס ו 3, 000 פעמים גרם במשך 20 דקות.תדקן את העל-טבעיים. פיפטה כדי לעכל מחדש את כדורי, כל אחד 12.5 מיליליטר של PBS קר, ולשלב כל שני resuspensions בצינור חרוט 50 מיליליטר. גלולה התאים שוב כמו קודם לכן.לאחר מכן, השלך את העל-טבעיים, ולהשתמש בפיגט כדי להוסיף 10 מיליליטר של מאגר תיזה בכל צינור כדי לנצל מחדש את התאים. לאחר sonicating את הצינורות עם תאים המושרה, יוצקים את lysate חיידקי לתוך בקבוק פוליקרבונט מקורר מראש. צנטריפוגה במשך 60 דקות ב 120, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס, ויוצקים את העל טבעי לצינור חרוט קר 50 מיליליטר.לאחר הכנת מכשיר FPLC עם עמודת שף טעון ניקל, לטעון את המדגם לעמודה ב 0.15 מיליליטר לדקה. לשטוף את העמוד עם 20 מיליליטר של חיץ ניקל ב imidazole 20 מילימולאר. שמור את הכביסה בצינור 50 מיליליטר לניתוח.לאחר מכן, לשטוף את העמוד עם 15 מיליליטר של חיץ ניקל ב 125 מילימולרים imidazole. לאסוף את האלוטיון ב 19 שברים של 0.8 מיליליטר כל אחד. לשטוף את הטור שוב עם 15 מיליליטר של 100% ניקל חיץ B, ולאסוף 75 שברים נוספים של 0.2 מיליליטר כל אחד.המשך עם הניתוח של שברים שנאספו על 12% SDS-PAGE ג'לים כדי לאשר נוכחות של PCD. ראשית, להוסיף 35 microliters של חיץ תגובה לצינור מיקרו-מרכזיפוג פוליפרופילן 1.5 מיליליטר. בצינור, לשלב חמישה microliters של שברי כרומטוגרפיה שיא 500 ננוגרם של שלושה קילו-ק"מ זוג פלסמיד pXba supercoiled.מניחים את הצינור באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר הכנת ג'ל אגרוז על פי כתב היד, מוסיפים 30 מיקרוליטרים של כל תגובה לתוך בארות בג'ל. אלקטרופורזה ב 10 וולט בסנטימטר בטמפרטורת הסביבה במשך כשעה.עכשיו, צבע הג'י הכתום הגיע לקצה הג'ל. מיד, השתמש בסורק פלואורסצנטי כדי לדמיין את אות האתידיום ברומיד של הג'ל. עם הפונקציה של העוצמה וגודל פיקסל התמונה, קבע את נפח הפיקסלים של מיני הדנ"א השונים, כגון עיגולים על-צבעיים, ליניאריים ועיגולים חתוכים.כדי לקבוע את האחוז של כל מין דנ"א, חלק את נפח הפיקסלים של מין דנ"א יחיד בנפח הפיקסלים הכולל עבור כל המינים הבודדים. ניתוח SDS-PAGE מראה את שיא האלוטיון השני מכיל זיהום חלבון מינימלי, המייצג הטרודימר PCD כמעט טהור ופעילות נוקלאאז מינימלית עד בלתי ניתנת לגילוי. לכן, לשלב אלה 10 שברים מן elution PCD השני בצינור חרוט חמישה מיליליטר לניתוח נוסף.לאחר טיהור כרומטוגרפיה של PCD, בחדר קר של ארבע מעלות צלזיוס, לשלב בצינור microcentrifuge נפח מתאים של נתרן כלורי, טריס הידרוכלוריד, מגנזיום כלורי, dithiothreitol, PCA, ו pXba פלסמיד supercoiled לעשות מלאי 5X. מניחים צלחת שטוחה תחתונה 96 היטב על קרח, ולהעביר 10 microliters של פתרון 5X משולב ל בארות. מיד לפני הניתוח, להוסיף לכל באר 10 microliters של שברי PCD SEC בודדים.קבעו את קורא הלוחות לטמפרטורה פנימית של 37 מעלות צלזיוס, והעבירו את צלחת ה-96 היטב למחזיק הצלחת. יש לסגת ממחזיק הלוח לתוך המכשיר, ולמדוד ספיגה ב-290 ננומטר במרווחים של 20 שניות למשך שעה. הגדר את הכלי לנער את הצלחת חמש שניות לפני כל קריאה.לאחר שעה אחת, להוסיף 10 microliters של פתרון עצירה לכל באר כדי לסיים את התגובות. בצע אלקטרופורזה ג'ל עבור שברי ה-SEC PCD. בחר שברים עם פעילות חמצון PCA ביותר, המצוין על ידי ספיגה מופחתת ולא זיהום גרעין שנצפה.למדוד את הספיגה ב 280 ננומטר, ולחשב את ריכוז PCD הכולל מבוסס על ספיגת מקדם ההכחדה. אחסן את השברים שנבחרו לאחסון לטווח ארוך במינוס 80 מעלות צלזיוס. בניסוי זה, נמצא כי PCD רקומביננטי, הטרודימר של hexahistidine מתויג pcaH ו pcaG, בא לידי ביטוי E.coli.ההטרודימר טוהר לראשונה על ידי כרומטוגרפיה של זיקה לניקל. הספיגה מוצגת בכחול, ואת הריכוז אחוז של חיץ ניקל B מוצג באדום. הזרימה מראה את החלבונים החיידקיים המסיסים שלא נקשרו לאסין הניקל.כמה PCD אלוט בנוכחות imidazole 125-מילימולאר, אבל רוב החלבון eluted ב imidazole 250 מילימולאר. ניתוח SDS-PAGE מייצג מציין שהשברים מצעד האלוטיון היו נקיים ממזהמים. ג'ל אגרוז של בדיקת גרעין חושף זיהום באמצעות השוואה עם השליטה השלילית ללא תוספת חלבון ושליטה חיובית מזוהמת בגרעין DNA.כימות של מיני ה-DNA השונים שנצפו בבדיקת ג'ל ג'ל אגרוז מראה שברים 29 עד 38 הייתה פעילות נוקלאז קטנה, אשר נבחרו להיות משולבים, מרוכזים, ומטוהרים עוד יותר על ידי ה-SEC. נתונים משלושה שברי SEC מייצגים הראו כי PCD מטוהר הפחית את הספיגה ב 290 ננומטר, המציין חמצון של PCA. בעקבות הליך זה, PCD מטוהרים ניתן להשתמש אופטימיזציה במערכת ניקוי החמצן הרצוי.פעולה זו תקבע את הכמות המדויקת של PCD הנדרש עבור המערכת. טכניקה זו שימשה כדי להאריך את אורך החיים פלואורופור בניסויים מיקרוסקופיים מולקולה אחת, אשר אפשרה תקופות ארוכות יותר של איסוף נתונים. האולטרהצנטריפוגה המשמשת מסוכנת.ודא כי צנטריפוגות מאוזנות כראוי לפני ספינינג. אתידיום ברומיד הוא רהוט מסוכן. הימנע ממגע על ידי לבישת ציוד מגן אישי, והיפטר ממנו כראוי.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, ביטוי, טיהור, התגבשות של Transporter סרוטונין האדם Bound כדי<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

הביטוי, טיהור, פעילות אנטי מיקרוביאלית של S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

טיהור, בנייתו מחדש של TRPV1 לניתוח Spectroscopic

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

ביטוי וטיהור של תעלות יונים Bestrophin מידע יונקים

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

דגימה רעלני של זגוגית השן פחמתי פחמן יציב וניתוח איזוטופ החמצן

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

חלבון אנאירובית טיהור וניתוח קינטי באמצעות אלקטרודה חמצן ללמוד DesB Dioxygenase פעילות וניגוד

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

מדידת ופרשנות חמצן קצב הצריכה כולה לטוס הראש מקטעים

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

הביטוי ולטיהור TRPC3 האדם רגיש השומנים הקטיון ערוץ לקביעת מבניים על-ידי הקפאה יחיד-חלקיקים-מיקרוסקופ

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

ביטוי Solubilization, טיהור של בוראט האיקריוטים שנאים

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...