Name: expression and purification of nuclease-free oxygen scavenger protocatechuate 3,4-dioxygenase
Uploaded: 2019-11-08T13:00:00
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1. Indurre l'espressione PCD in E. coli
<ol><li>Unire 1 pVP91A-pcaHG di espressione PCD espressione pVP91A-pcaHG espressione plasmid (20 ng/l, Figura 1A) e 20 L di E.coli BL21 (20 cellule disponibili in commercio, > 2 x 106 cfu / plaspilofo) in un tubo. Scorrere il tubo per mescolare. Posizionare il tubo sul ghiaccio 5 min.</li>
	<li>Collocare la trasformazione a 42 gradi centigradi per 30 s. Poi ghiaccio 2 min.</li>
	<li>Aggiungere 80 supporti...

<ol>
	<li>Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+single+fluorescent+molecules.">Detection of single fluorescent molecules.</a> Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).</li><li>Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+reactive+oxygen+species+to+the+photobleaching+of+organic+fluorophores.">The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores.</a> Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).</li><li>Ha, T., Tinnefeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photophysics+of+fluorescent+probes+for+single-molecule+biophysics+and+super-resolution+imaging.">Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).</li><li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy:+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy.">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).</li><li>Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+species+formed+on+proteins+exposed+to+singlet+oxygen.">Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen.</a> Photochemical &#38; Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).</li><li>Sies, H., Menck, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Singlet+oxygen+induced+DNA+damage.">Singlet oxygen induced DNA damage.</a> Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).</li><li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments.">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li><li>Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+coupling+in+actomyosin+energy+transduction+studied+by+in+vitro+movement+assay.">Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay.</a> Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).</li><li>Shi, X., Lim, J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidification+of+the+oxygen+scavenging+system+in+single-molecule+fluorescence+studies:+in+situ+sensing+with+a+ratiometric+dual-emission+probe.">Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe.</a> Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).</li><li>Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+analyses+of+designed+and+selected+mutants+of+protocatechuate+3,4-dioxygenase1.">Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1.</a> Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).</li><li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems.">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li><li>Senavirathne, G., Lopez, M. A., Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+nuclease-free+protocatechuate+3,4-dioxygenase+for+prolonged+single-molecule+fluorescence+imaging.">Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging.</a> Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nature Communications. 7, 11409 (2016).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cascading+MutS+and+MutL+sliding+clamps+control+DNA+diffusion+to+activate+mismatch+repair.">Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair.</a> Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).</li></ol>

I sistemi di scavenging dell'ossigeno sono comunemente inclusi nella microscopia a fluorescenza a singola molecola per ridurre il fotosbiancamento3,7,8. Queste tecniche di microscopia sono spesso utilizzate per osservare gli acidi nucleici o le interazioni proteiche con gli acidinucleici1,13,14. La contaminazione di OSS con nucleasi pu?...

La biofisica a singola molecola (SM) è un campo in rapida crescita che cambia il modo in cui guardiamo ai fenomeni biologici. Questo campo ha la capacità unica di collegare le leggi fondamentali della fisica e della chimica alla biologia. La microscopia a fluorescenza è un metodo biofisico che può raggiungere la sensibilità SM. La fluorescenza viene utilizzata per rilevare le biomolecole collegandole a piccoli fluorofori organici o punti quantici1. Queste molecole possono emettere fotoni quando sono eccitate dai laser prima del fotosbiancamento irreversibilmente2. Il fotosbiancamento si verifica quando le etichette fluorescenti subiscono danni chimici che distruggono la loro capacità di eccitare alla lunghezza d'onda desiderata2,3. La presenza di specie reattive dell'ossigeno (ROS) in tamponanti acquosi sono una causa primaria di fotosbiancamento2,4. Inoltre, ROS può danneggiare le biomolecole e portare a osservazioni errate negli esperimenti SM5,6. Per prevenire danni ossidativi, i sistemi di scavenging dell'ossigeno (OSS) possono essere utilizzati3,7,8. Il sistema di ossidasi/catalasi di glucosio (GODCAT) è efficiente nella rimozione dell'ossigeno8, ma produce come intermedi. Questi possono essere dannosi per le biomolecole di interesse negli studi SM.
In alternativa, protocatechuate 3,4 diossigenasi (PCD) rimuoverà in modo efficiente O2 da una soluzione acquosa utilizzando il suo acido protocatechuic substrato (PCA)7,9. PCD è un metalloenze che utilizza ferro nonheme per coordinare PCA e catalizzare la reazione di apertura dell'anello catechol utilizzando disciolto O210. Questa reazione in un solo passo è indicata per essere un OSS nel complesso migliore per migliorare la stabilità del fluoroforo negli esperimenti SM7. Sfortunatamente, molti enzimi OSS disponibili in commercio, tra cui PCD, contengono nucleasi contaminati11. Questi contaminanti possono portare al danno dei substrati a base di acido nucleico utilizzati negli esperimenti SM. Questo lavoro chiarirà un protocollo di purificazione basato sulla cromatografia per l'uso di PCD ricombinanti nei sistemi SM. La PCD può essere ampiamente applicata a qualsiasi esperimento in cui i ROS danneggiano i substrati necessari per l'acquisizione dei dati.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>&#946;ME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, Glacial Certified ACS</td>
			<td>Fisherl Chemical</td>
			<td>A38C-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Granulated</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>DF0145-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA FPLC System</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC201024</td>
			<td>10 kDa MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F-2262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS) Tablets</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>K833-100TABS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0339-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>DF0123173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90004-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIS-TRIS propane,&#62;=99.0% (titration)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6755-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0472-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96&#8211;Well Flat&#8211;Bottom EIA Plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2240096EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>P212121</td>
			<td>SV-DTT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 500ML</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G37-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granulated LB Broth Miller</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>1.10285.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Res Standard Agarose</td>
			<td>AGTC Bioproducts</td>
			<td>AG500D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0250-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11017128001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from Chicken Egg White</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0288-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>P212121</td>
			<td>RP-S23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow (100 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novagen BL21 Competent Cells</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>69-449-3</td>
			<td>SOC media included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0-267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>P-020-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0754-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN15642110</td>
			<td>PCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>P212121</td>
			<td>CI-00270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M2 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devises</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane &#62; 250mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-741-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane &#62; 500mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-741-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 12 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17517301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0761-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Ultra Pure</td>
			<td>Gojira Fine Chemicals</td>
			<td>UTS1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure EDTA</td>
			<td>Invitrogen/Gibco</td>
			<td>15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208086</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression and purification of nuclease-free oxygen scavenger protocatechuate 3,4-dioxygenase

La microscopia a singola molecola (SM) viene utilizzata nello studio delle interazioni molecolari dinamiche delle biomolecole con etichetta fluoroforo in tempo reale. Tuttavia, i fluorofori sono inclini alla perdita di segnale tramite fotosbiancamento mediante ossigeno disciolto (O2). Per prevenire il fotosbiancamento ed estendere la durata del fluoroforo, vengono impiegati sistemi di scavenging dell'ossigeno (OSS) per ridurre O2. L'OSS commercialmente disponibile può essere contaminato da nucleasi che danneggiano o degradano gli acidi nucleici, confondendo l'interpretazione dei risultati sperimentali. Qui abbiamo dettagliato un protocollo per l'espressione e la purificazione di Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-diossigenasi (PCD) senza contaminazione da nuclease rilevabile. La PCD può rimuovere in modo efficiente le specie reattive di O2 mediante la conversione dell'acido protocatechuic del substrato (PCA) in 3 carboxy-cis, acido cis-muconico. Questo metodo può essere utilizzato in qualsiasi sistema acquoso in cui O2 svolge un ruolo dannoso nell'acquisizione dei dati. Questo metodo è efficace nella produzione di PCD altamente attivo e privo di nuclesi o meno rispetto al PCD disponibile in commercio.

La PCD per scavenger di ossigeno disponibile in commercio è spesso contaminata da una nucleasi di DNA. La contaminazione dell'attività nuclease potrebbe portare a risultati spuri negli studi fluorescenti, in particolare gli studi che analizzano le proteine che interagiscono con il DNA o il DNA. Abbiamo scoperto che il PCD ricombinante, un eterodimero dell'esaracena etichettata pcaH e pcaG, può essere espresso in E. coli (Figura 1). L'eterodimero viene prim...

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Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Protocatechuate 3,4-diossigenasi (PCD) può rimuovere ezimaticamente l'ossigeno diatomico libero da un sistema acquoso utilizzando il suo acido protocatechuico del substrato (PCA). Questo protocollo descrive l'espressione, la purificazione e l'analisi dell'attività di questo enzima di scavenging dell'ossigeno.

Espressione e purificazione di Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Diossigenasi

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Il nostro protocollo produce PCD altamente attivo privo di nucleasi rilevabile, che può essere utilizzato in qualsiasi soluzione in cui l'ossigeno acquoso è un contaminante. Le tecniche che utilizziamo sono facili da replicare e assicurano che non siano presenti contaminanti nucleasi nel prodotto. Per iniziare, combinare un microlitro di pVP91A-pcaHG plasmide di espressione PCD e 20 microlitri di E.coli BL21 disponibile in commercio in un tubo.Scorrere il tubo per mescolare e posizionare il tubo sul ghiaccio per cinque minuti. Per continuare la reazione di trasformazione, posizionare il tubo in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius per 30 secondi, quindi sul ghiaccio per due minuti. Aggiungere 80 microlitri di supporti SOC e agitare a 225 giri/min e 37 gradi Celsius per un'ora.Quindi, versare la miscela di reazione di trasformazione su un agar LB-ampicillina e utilizzare uno spargitore di piastre per stendere la miscela. Coprire la piastra con un coperchio e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 16-18 ore. Successivamente, scegli una colonia dalla piastra e inocula in 50 microlitri di LB-ampicillina in un pallone Erlenmeyer da 250 millilitri.Posizionare il pallone su uno shaker a 225 giri/min per incubare a 37 gradi Celsius per 16-18 ore. Quindi, trasferire 20 millilitri della coltura incubata in un pallone da quattro litri riempito con un litro di LB-ampicillina. Agitare a 225 giri/min a 37 gradi Celsius.Ogni ora, disegna un millilitro della coltura in una cuvetta per misurare la densità ottica a 600 nanometri su un fotometro. Man mano che la densità ottica della coltura aumenta vicino a 0,5, aumentare la frequenza delle misurazioni ogni 15 minuti, fino a quando l'OD600 raggiunge 0,5. Quindi, trasferire il pallone da quattro litri in un bidone di ghiaccio.Ruotare il pallone nel bagno di ghiaccio per ridurre la temperatura di coltura. Trasferire il pallone da quattro litri in un'incubatrice a 17 gradi Celsius e 180 giri/min. Continuare a monitorare l'OD600 ogni 20 minuti.A 0,7 OD600, aggiungere soluzioni di stock esaidrato di solfato di ferro IPTG e ammonio per raggiungere una concentrazione finale rispettivamente di 0,5 millimolare e 10 milligrammi per litro. Scuoti la cultura a 180 giri/min e 17 gradi Celsius per 18 ore. Dopo l'incubazione, mettere il pallone di coltura nel ghiaccio per due minuti.Raccogliere un millilitro delle cellule indotte in un tubo di microcentrifugo in polipropilene da 1,5 millilitri per l'analisi SDS-PAGE. Quindi, versare la coltura batterica in bottiglie, 500 millilitri per bottiglia, per la centrifugazione. Pellet la coltura a quattro gradi Celsius e 3.000 volte g per 20 minuti.Decantare i supernatanti. Pipetta per rimostrare i pellet, ciascuno in 12,5 millilitri di PBS freddo, e combinare ogni due resuspensioni in un tubo conico da 50 millilitri. Pellettare nuovamente le celle come in precedenza.Quindi, scartare i supernaganti e utilizzare una pipetta per aggiungere 10 millilitri di tampone di lisi in ogni tubo per rimescolare le cellule. Dopo aver sonicato i tubi con cellule indotte, versare il lysate batterico in una bottiglia di policarbonato pre-refrigerata. Centrifugare per 60 minuti a 120.000 volte g e quattro gradi Celsius e versare il supernatante in un tubo conico freddo da 50 millilitri.Dopo aver preparato lo strumento FPLC con la colonna di resina caricata al nichel, caricare il campione sulla colonna a 0,15 millilitri al minuto. Lavare la colonna con 20 millilitri di tampone di nichel a imidazolo da 20 millimolare. Conservare il lavaggio in un tubo da 50 millilitri per l'analisi.Quindi, lavare la colonna con 15 millilitri di tampone di nichel a imidazolo da 125 millimolare. Raccogliere l'eluizione in 19 frazioni di 0,8 millilitri ciascuna. Lavare nuovamente la colonna con 15 millilitri di tampone di nichel B al 100% e raccogliere altre 75 frazioni di 0,2 millilitri ciascuna.Continuare con l'analisi delle frazioni raccolte su gel 12%SDS-PAGE per confermare la presenza di PCD. In primo luogo, aggiungere 35 microlitri di tampone di reazione a un tubo di microcentrifugo in polipropilene da 1,5 millilitri. Nel tubo, unire cinque microlitri delle frazioni di cromatografia di picco e 500 nanogrammi di coppia di tre chili di pXba plasmide supercoiled.Posizionare il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per un'ora. Dopo aver preparato il gel di agarosio secondo il manoscritto, aggiungere 30 microlitri di ogni reazione nei pozzi nel gel. Elettroforrese a 10 volt per centimetro a temperatura ambiente per circa un'ora.Ora, il colorante G arancione ha raggiunto la fine del gel. Immediatamente, utilizzare uno scanner a fluorescenza per immaginere il segnale di bromuro di etidio del gel. Con la funzione dell'intensità e della dimensione dei pixel dell'immagine, determinare il volume in pixel delle varie specie di DNA, come i cerchi supercoiled, lineari e nicked.Per determinare la percentuale di ogni specie di DNA, dividere il volume di pixel di una singola specie di DNA per il volume totale di pixel per tutte le singole specie. L'analisi SDS-PAGE mostra che il secondo picco di eluizione contiene una contaminazione proteica minima, che rappresenta un eterodimero PCD quasi puro e un'attività nucleasi minima o non rilevabile. Pertanto, combinare queste 10 frazioni dalla seconda eluizione PCD in un tubo conico a cinque millilitri per ulteriori analisi.Dopo la purificazione cromatografica a esclusione di dimensioni del PCD, in una stanza fredda di quattro gradi Celsius, combinare in un tubo di microcentrifugo un volume appropriato di cloruro di sodio, cloridrato di Tris, cloruro di magnesio, ditiotreitolo, PCA e pXba plasmide supercoiled per fare uno stock 5X. Posizionare una piastra a fondo piatto da 96 poggianti sul ghiaccio e trasferire 10 microlitri della soluzione 5X combinata ai pozzi. Immediatamente prima dell'analisi, aggiungere ad ogni pozzo 10 microlitri delle singole frazioni PCD SEC.Impostare il lettore di piastre su una temperatura interna di 37 gradi Celsius e trasferire la piastra da 96 pozzi sul supporto della piastra. Ritrarre il supporto della piastra nello strumento e misurare l'assorbanza a 290 nanometri a intervalli di 20 secondi per un'ora. Impostare lo strumento per scuotere la piastra cinque secondi prima di ogni lettura.Dopo un'ora, aggiungere 10 microlitri di soluzione di arresto a ciascun pozzo per terminare le reazioni. Eseguire l'elettroforesi del gel per le frazioni PCD SEC. Selezionare le frazioni con la maggior parte dell'attività di ossidazione pca, indicata da una diminuzione dell'assorbanza e da nessuna contaminazione da nucleasi osservata.Misurare l'assorbanza a 280 nanometri e calcolare la concentrazione totale di PCD in base all'assorbanza e al coefficiente di estinzione. Conservare le frazioni selezionate per l'archiviazione a lungo termine a meno 80 gradi Celsius. In questo esperimento, è stato scoperto che il PCD ricombinante, un eterodimero di esahistidina taggato pcaH e pcaG, è stato espresso in E.coli.L'eterodimero fu purificato per la prima volta dalla cromatografia ad affinità al nichel. L'assorbanza è mostrata in blu, e la concentrazione percentuale di nichel buffer B è mostrata in rosso. Il flusso-through mostra le proteine batteriche solubili che non si legavano alla resina di nichel.Alcuni PCD eluivano in presenza di imidazolo 125 millimolare, ma la maggior parte della proteina eluizzava nell'imidazolo 250 millimolare. L'analisi rappresentativa SDS-PAGE indica che le frazioni della fase di eluizione erano libere da contaminanti. Il gel di agarosio del test della nucleasi rivela contaminazione confrontandolo con il controllo negativo senza proteine aggiunte e un controllo positivo contaminato da una nucleasi del DNA.La quantificazione delle varie specie di DNA osservate nel saggio di nucleasi del gel di agarosio mostra che le frazioni da 29 a 38 avevano poca attività di nucleasi, che sono state scelte per essere combinate, concentrate e ulteriormente purificate dalla SEC. Seguendo questa procedura, il PCD purificato può essere utilizzato e ottimizzato nel sistema di scavenging dell'ossigeno desiderato.Questo determinerà la quantità esatta di PCD necessaria per il sistema. Questa tecnica è stata utilizzata per prolungare la durata del fluoroforo negli esperimenti di microscopia a singola molecola, che ha permesso periodi più lunghi di raccolta dei dati. L'ultracentrifugo utilizzato è pericoloso.Assicurarsi che le centrifughe siano correttamente bilanciate prima della filatura. Il bromuro di etidio è un reagente pericoloso. Evitare il contatto indossando dispositivi di protezione individuale e smaltirli in modo appropriato.

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JoVE Journal

Biochemistry

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Biochimica

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Espressione, purificazione e attività antimicrobica di S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Purificazione e la ricostituzione di TRPV1 per analisi spettroscopiche

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Espressione e purificazione dei canali ionici di mammiferi Bestrophin

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Campionamento e pretrattamento dello smalto dei denti carbonato per carbonio stabile e analisi di isotopi di ossigeno

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Purificazione della proteina anaerobica e analisi cinetica tramite elettrodo di ossigeno per lo studio di inibizione e attività di Dioxygenase di Giuroma90

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Misurare e interpretare i tassi di consumo di ossigeno in tutto Vola testa segmenti

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Espressione e purificazione di TRPC3 la scanalatura del catione del lipido sensibili umani per determinazione strutturale di singola particella cRIO-microscopia elettronica

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Espressione, solubilizzazione e purificazione dei trasportatori eucariotiche borato

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...