Name: expression and purification of nuclease-free oxygen scavenger protocatechuate 3,4-dioxygenase
Uploaded: 2019-11-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH GM121284 og AI126742 til KEY.

1. indusere PCD-uttrykk i E. coli
<ol><li>Kombiner 1 μL pVP91A-pcaHG PCD-uttrykk plasmider (20 ng/μL, figur 1A) og 20 μL av E. coli BL21 (20 μL kommersielt tilgjengelige celler, > 2 x 106 CFU/μg plasmider) i et rør. Flick røret å mikse. Plasser røret på is 5 min.</li>
	<li>Sted transformasjon ved 42 ° c for 30 s. Så is 2 min.</li>
	<li>Tilsett 80 μL SOC Media (super optimal buljong med catabolite undertrykkelse: 2,5 mM KCl, 10 mM N...

<ol>
	<li>Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+single+fluorescent+molecules.">Detection of single fluorescent molecules.</a> Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).</li><li>Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+reactive+oxygen+species+to+the+photobleaching+of+organic+fluorophores.">The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores.</a> Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).</li><li>Ha, T., Tinnefeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photophysics+of+fluorescent+probes+for+single-molecule+biophysics+and+super-resolution+imaging.">Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).</li><li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy:+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy.">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).</li><li>Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+species+formed+on+proteins+exposed+to+singlet+oxygen.">Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen.</a> Photochemical &#38; Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).</li><li>Sies, H., Menck, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Singlet+oxygen+induced+DNA+damage.">Singlet oxygen induced DNA damage.</a> Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).</li><li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments.">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li><li>Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+coupling+in+actomyosin+energy+transduction+studied+by+in+vitro+movement+assay.">Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay.</a> Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).</li><li>Shi, X., Lim, J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidification+of+the+oxygen+scavenging+system+in+single-molecule+fluorescence+studies:+in+situ+sensing+with+a+ratiometric+dual-emission+probe.">Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe.</a> Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).</li><li>Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+analyses+of+designed+and+selected+mutants+of+protocatechuate+3,4-dioxygenase1.">Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1.</a> Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).</li><li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems.">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li><li>Senavirathne, G., Lopez, M. A., Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+nuclease-free+protocatechuate+3,4-dioxygenase+for+prolonged+single-molecule+fluorescence+imaging.">Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging.</a> Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nature Communications. 7, 11409 (2016).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cascading+MutS+and+MutL+sliding+clamps+control+DNA+diffusion+to+activate+mismatch+repair.">Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair.</a> Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).</li></ol>

Oksygen rensing systemer er vanligvis inkludert i enkelt molekyl fluorescens mikroskopi å redusere photobleaching3,7,8. Disse mikroskopi teknikkene brukes ofte til å observere nukleinsyre syrer eller protein interaksjoner med nukleinsyre syrer1,13,14. Forurensning av OSSs med nukleaser kan føre til falske resultater.
<p class="jo...

Enkelt molekyl (SM) biofysikk er et raskt voksende felt endre måten vi ser på biologiske fenomener. Dette feltet har den unike evnen til å knytte grunnleggende lover i fysikk og kjemi til biologi. Fluorescens mikroskopi er en Biofysiske metode som kan oppnå SM følsomhet. Fluorescens brukes til å oppdage biomolekyler ved å koble dem til små organiske fluorophores eller kvante prikker1. Disse molekylene kan avgi fotoner når de er opphisset av lasere før photobleaching irreversibelt2. Photobleaching oppstår når fluorescerende etiketter gjennomgår kjemiske skader som ødelegger deres evne til å opphisse på ønsket bølgelengde2,3. Tilstedeværelsen av reaktive oksygen arter (ros) i vandig buffer er en primær årsak til photobleaching2,4. I tillegg kan ros skade biomolekyler og føre til feilaktige observasjoner i SM eksperimenter5,6. For å forebygge oksidativt skade, kan oksygen rensing systemer (oss) brukes3,7,8. Glukose oksidase/catalase (GODCAT) systemet er effektiv på å fjerne oksygen8, men det gir potensielt skadelige peroksider som mellom produkter. Dette kan være skadelig for biomolekyler av interesse i SM studier.
Alternativt vil protocatechuate dioxygenase (PCD) effektivt fjerne O2 fra en vandig oppløsning ved hjelp av dens substrat protocatechuic acid (PCA)7,9. PCD er en metalloenzyme som bruker negemovoj jern for å koordinere PCA og katalysere catechol ring åpnings reaksjonen ved hjelp av oppløst O210. Dette ett trinn reaksjon er vist å være en helhetlig bedre OSS for å forbedre fluoroforen stabilitet i SM eksperimenter7. Dessverre, mange kommersielt tilgjengelige OSS-enzymer, inkludert PCD, inneholder forurensende nukleaser11. Disse forurensninger kan føre til skade av nukleinsyre syre-baserte underlag som brukes i SM eksperimenter. Dette arbeidet vil belyse en kromatografi-basert rensing protokoll for bruk av rekombinant PCD i SM systemer. PCD kan grovt brukes på alle eksperiment der ROS er skadelige underlag som trengs for datainnsamling.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>&#946;ME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, Glacial Certified ACS</td>
			<td>Fisherl Chemical</td>
			<td>A38C-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Granulated</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>DF0145-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA FPLC System</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC201024</td>
			<td>10 kDa MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F-2262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS) Tablets</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>K833-100TABS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0339-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>DF0123173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90004-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIS-TRIS propane,&#62;=99.0% (titration)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6755-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0472-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96&#8211;Well Flat&#8211;Bottom EIA Plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2240096EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>P212121</td>
			<td>SV-DTT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 500ML</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G37-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granulated LB Broth Miller</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>1.10285.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Res Standard Agarose</td>
			<td>AGTC Bioproducts</td>
			<td>AG500D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0250-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11017128001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from Chicken Egg White</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0288-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>P212121</td>
			<td>RP-S23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow (100 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novagen BL21 Competent Cells</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>69-449-3</td>
			<td>SOC media included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0-267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>P-020-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0754-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN15642110</td>
			<td>PCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>P212121</td>
			<td>CI-00270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M2 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devises</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane &#62; 250mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-741-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane &#62; 500mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-741-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 12 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17517301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0761-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Ultra Pure</td>
			<td>Gojira Fine Chemicals</td>
			<td>UTS1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure EDTA</td>
			<td>Invitrogen/Gibco</td>
			<td>15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208086</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression and purification of nuclease-free oxygen scavenger protocatechuate 3,4-dioxygenase

Enkelt molekyl (SM) mikroskopi brukes i studiet av dynamiske molekylære interaksjoner av fluoroforen merket biomolekyler i sanntid. Men fluorophores er utsatt for tap av signal via photobleaching av oppløst oksygen (O2). For å hindre photobleaching og forlenge fluoroforen levetid, er oksygen rensing systemer (OSS) ansatt for å redusere O2. Kommersielt tilgjengelige operativsystemer kan være forurenset av nukleaser som skader eller forringe nukleinsyre syrer, forvirrende tolkning av eksperimentelle resultater. Her detalj vi en protokoll for uttrykk og rensing av svært aktive Pseudomonas putida protocatechuate-3, 4-DIOXYGENASE (PCD) uten synlig nuklease forurensning. PCD kan effektivt fjerne reaktiv O2 arter ved konvertering av underlaget protocatechuic acid (PCA) til 3-carboxy-CIS, CIS-muconic acid. Denne metoden kan brukes i alle vandige systemer der O2 spiller en ødeleggende rolle i datainnhenting. Denne metoden er effektiv i å produsere svært aktiv, nuklease gratis PCD i sammenligning med kommersielt tilgjengelige PCD.

Kommersielt tilgjengelig oksygen renovasjons-PCD er ofte forurenset med en DNA-nuklease. Forurensende nuklease aktivitet kan føre til falske resultater i fluorescerende studier, spesielt studier som analyserer DNA eller DNA samspill proteiner. Vi har funnet at rekombinant PCD, en heterodimer av hexahistidine merket pcaH og pcaG, kan uttrykkes i E. coli (figur 1). Heterodimer blir først renset av nikkel affinitet kromatografi (figur 2</s...

Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase at JoVE.com

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Protocatechuate 3, 4-dioxygenase (PCD) kan enzymatisk fjerne fritt diatomic oksygen fra et vandig system ved hjelp av sitt substrat protocatechuic syre (PCA). Denne protokollen beskriver uttrykket, rensing, og aktivitet analyse av dette oksygen rensing enzymet.

Uttrykk og rensing av Nuklease-gratis Oxygen renovasjons Protocatechuate 3, 4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Vår protokoll gir svært aktiv PCD uten påviselig kjerne, som kan brukes i enhver løsning der vandig oksygen er en forurensning. Teknikkene vi bruker er enkle å replikere og sikrer at det ikke finnes nukleasekontaminanter i produktet. For å begynne, kombinere en mikroliter pVP91A-pcaHG PCD uttrykk plasmid og 20 mikroliter av kommersielt tilgjengelig E.coli BL21 i et rør.Knips røret for å blande, og legg røret på is i fem minutter. For å fortsette transformasjonsreaksjonen, legg røret i et vannbad på 42 grader Celsius i 30 sekunder, deretter på is i to minutter. Tilsett 80 mikroliter SOC-medier, og rist ved 225 o/min og 37 grader Celsius i en time.Deretter helles transformasjonsreaksjonsblandingen på en LB-ampicillin agar, og bruk en platespreder til å spre blandingen. Dekk platen med et lokk, og inkuber platen ved 37 grader Celsius i 16 til 18 timer. Deretter plukker du en koloni fra platen, og inokulerer i 50 mikroliter LB-ampicillin i en 250-milliliter Erlenmeyer kolbe.Plasser kolben på en shaker på 225 rpm for å inkubere ved 37 grader Celsius i 16 til 18 timer. Deretter overfører du 20 milliliter av inkubert kultur til en fire-liters kolbe fylt med en liter LB-ampicillin. Rist ved 225 rpm ved 37 grader Celsius.Hver time, trekk en milliliter av kulturen inn i en cuvette for å måle den optiske tettheten på 600 nanometer på et fotometer. Etter hvert som kulturens optiske tetthet øker nær 0,5, øker du frekvensen av målinger til hvert 15. Deretter overfører du fire liters kolbe til en beholder med is.Virvle kolben i isbadet for å redusere kulturtemperaturen. Overfør fire-liters kolbe til en inkubator ved 17 grader Celsius og 180 rpm. Fortsett å overvåke OD600 hvert 20.Ved 0,7 OD600, tilsett IPTG og ammonium jernsulfat heksahydrat lager løsninger for å nå en endelig konsentrasjon på 0,5 millimolar og 10 milligram per liter, henholdsvis. Rist kulturen på 180 rpm og 17 grader Celsius i 18 timer. Etter inkubasjon, legg kulturkolbe i is i to minutter.Høst en milliliter av de induserte cellene i et 1,5-milliliter polypropylen mikrocentrifugerør for SDS-PAGE-analyse. Deretter helles bakteriekulturen i flasker, 500 milliliter hver flaske, for sentrifugering. Pellet kulturen på fire grader Celsius og 3000 ganger g i 20 minutter.Dekanter supernativa. Pipette for å gjenbruke pellets, hver i 12,5 milliliter kald PBS, og kombinere hver to resuspensjoner i en 50-milliliter konisk rør. Pellet cellene igjen som tidligere.Kast deretter supernativa, og bruk en pipette til å legge til 10 milliliter lysisbuffer i hvert rør for å gjenbruke cellene. Etter sonikering av rørene med induserte celler, hell bakterielylat i en prekjølt polykarbonatflaske. Sentrifuge i 60 minutter ved 120, 000 ganger g og fire grader Celsius, og hell supernatanten til et kaldt 50-milliliter konisk rør.Etter å ha klargjørt FPLC-instrumentet med den nikkelladede harpikskolonnen, laster du prøven til kolonnen med 0,15 milliliter per minutt. Vask kolonnen med 20 milliliter nikkelbuffer ved 20 millimolar imidazol. Behold vasken i et 50-milliliter rør for analyse.Deretter vasker du kolonnen med 15 milliliter nikkelbuffer ved 125 millimolar imidazol. Samle elution i 19 fraksjoner av 0,8 milliliter hver. Vask kolonnen igjen med 15 milliliter med 100% nikkelbuffer B, og samle ytterligere 75 brøkdeler av 0,2 milliliter hver.Fortsett med analysen av de innsamlede brøkene på 12% SDS-PAGE geler for å bekrefte tilstedeværelse av PCD. Tilsett først 35 mikroliter reaksjonsbuffer til et 1,5 milliliter polypropylenmikrocentrifugrør. I røret kombinerer du fem mikroliter av toppkromatografifraksjonene og 500 nanogram med tre kilobasepar supercoiled plasmid pXba.Plasser røret i et vannbad ved 37 grader Celsius i en time. Etter å ha forberedt agarose gel i henhold til manuskriptet, tilsett 30 mikroliter av hver reaksjon i brønner i gelen. Elektroforese ved 10 volt per centimeter ved omgivelsestemperatur i omtrent en time.Nå har det oransje G-fargestoffet nådd enden av gelen. Bruk umiddelbart en fluorescensskanner til å bilde av ethidiumbromidsignalet til gelen. Med funksjonen til intensitets- og bildepikselstørrelsen bestemmer du pikselvolumet til de ulike DNA-artene, for eksempel supercoiled, lineære og nicked sirkler.For å bestemme prosentandelen av hver DNA-art, del pikselvolumet til en enkelt DNA-art med det totale pikselvolumet for alle enkeltarter. SDS-PAGE-analysen viser at den andre elutiontoppen inneholder minimal proteinforurensning, som representerer nesten ren PCD-heterodimer og minimal til umulig å oppdage kjerneaktivitet. Dermed kombinere disse 10 brøkene fra den andre PCD elution i en fem-milliliter konisk rør for videre analyse.Etter størrelse-eksklusjon kromatografi rensing av PCD, i en fire-graders Celsius kaldt rom, kombinere i en mikrocentrifuge tube passende volum av natriumklorid, Tris hydroklorid, magnesiumklorid, diothiothreitol, PCA, og supercoiled plasmid pXba å lage en 5X lager. Plasser en 96-brønns flat bunnplate på is, og overfør 10 mikroliter av den kombinerte 5X-løsningen til brønnene. Umiddelbart før analyse, legg til hver godt 10 mikroliter av de enkelte PCD SEC-brøkene.Sett plateleseren til en intern temperatur på 37 grader Celsius, og overfør 96-brønnsplaten til plateholderen. Trekk plateholderen inn i instrumentet, og mål absorbansen ved 290 nanometer med 20-sekunders intervaller i en time. Sett instrumentet til å riste platen fem sekunder før hver avlesning.Etter en time legger du til 10 mikroliter stoppløsning til hver brønn for å avslutte reaksjonene. Utfør gelelektroforese for PCD SEC-brøker. Velg brøker med mest PCA oksidasjonsaktivitet, indikert med redusert absorbans og ingen observert kjerneforurensning.Mål absorbansen ved 280 nanometer, og beregn den totale PCD-konsentrasjonen basert på absorbansen og utryddelseskoeffisienten. Oppbevar de valgte brøkene for langtidslagring ved minus 80 grader Celsius. I dette eksperimentet ble det funnet at rekombinant PCD, en heterodimer av hexahistidine merket pcaH og pcaG, ble uttrykt i E.coli.Heterodimeren ble først renset av nikkel affinitet kromatografi. Absorbansen er vist i blått, og prosentkonsentrasjonen av nikkelbuffer B vises i rødt. Gjennomstrømningen viser de oppløselige bakterieproteinene som ikke binder seg til nikkelharpiksen.Noen PCD eluted i nærvær av 125-millimolar imidazol, men flertallet av proteinet eluted i 250-millimolar imidazol. Representativ SDS-PAGE-analyse indikerer at brøkene fra elution-trinnet var fri for forurensninger. Agarose gel av kjerneanalyse avslører forurensning gjennom sammenligning med den negative kontrollen uten tilsatt protein og en positiv kontroll forurenset med en DNA-kjerne.Kvantisering av de ulike DNA-artene observert i agarose gelkjerneanalysen viser at fraksjoner 29 til 38 hadde liten nukleaseaktivitet, som ble valgt til å kombineres, konsentreres og ytterligere renset av SEC. Data fra tre representative SEC-fraksjoner viste at renset PCD reduserte absorbansen ved 290 nanometer, noe som indikerer oksidasjon av PCA. Etter denne prosedyren kan den rensede PCD brukes og optimaliseres i ønsket oksygen scavenging system.Dette vil avgjøre den nøyaktige mengden PCD som kreves for systemet. Denne teknikken har blitt brukt til å forlenge fluoroforlevetiden i enkeltmolekylmikroskopieksperimenter, som har tillatt lengre perioder med datainnsamling. Den ultracentrifuge som brukes er farlig.Pass på at sentrifuger er riktig balansert før spinning. Ethidiumbromid er et farlig reagens. Unngå kontakt ved å bruke personlig verneutstyr, og kast det på riktig måte.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Rensing, og Krystallisering av Human Serotonin Transporter Bound til<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Ekspresjon, rensing og antimikrobiell aktivitet av S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rensing og rekonstituering av TRPV1 for Spectroscopic analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Uttrykk og rensing av pattedyr Bestrophin Ion kanaler

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Prøvetaking og forbehandling av tannemaljen karbonat stabil karbon-og oksygen isotop analyse

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerob Protein rensing og kinetisk analyse via oksygen elektrode for å studere DesB Dioxygenase aktivitet og hemming

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Måling og tolke oksygen forbruk priser helt Fly hodet segmenter

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Uttrykk og rensing av menneskelige Lipid-sensitive kasjon kanal-TRPC3 for strukturelle vilje av Single-partikkel Cryo-elektronmikroskop

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Uttrykk, Solubilization og rensing av eukaryote Borate transportører

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...