Name: expression and purification of nuclease-free oxygen scavenger protocatechuate 3,4-dioxygenase
Uploaded: 2019-11-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo NIH GM121284 e AI126742 para key.

1. Induzir a expressão pcd em E. coli
<ol><li>Combine 1 μL pVP91A-pcaHG PCD expressão plasmid (20 ng/μL, Figura 1A)e 20 μL de E.coli BL21 (20 μL células comercialmente disponíveis, > 2 x 106 cfu/μg plasmid) em um tubo. Agite o tubo para misturar. Coloque o tubo no gelo 5 min.</li>
	<li>Coloque a transformação em 42 °C para 30 s. Em seguida, gelo 2 min.</li>
	<li>Adicionar 80 μL SOC media (super caldo ideal com repressão catabolite...

<ol>
	<li>Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+single+fluorescent+molecules.">Detection of single fluorescent molecules.</a> Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).</li><li>Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+reactive+oxygen+species+to+the+photobleaching+of+organic+fluorophores.">The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores.</a> Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).</li><li>Ha, T., Tinnefeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photophysics+of+fluorescent+probes+for+single-molecule+biophysics+and+super-resolution+imaging.">Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).</li><li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy:+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy.">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).</li><li>Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+species+formed+on+proteins+exposed+to+singlet+oxygen.">Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen.</a> Photochemical &#38; Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).</li><li>Sies, H., Menck, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Singlet+oxygen+induced+DNA+damage.">Singlet oxygen induced DNA damage.</a> Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).</li><li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments.">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li><li>Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+coupling+in+actomyosin+energy+transduction+studied+by+in+vitro+movement+assay.">Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay.</a> Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).</li><li>Shi, X., Lim, J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidification+of+the+oxygen+scavenging+system+in+single-molecule+fluorescence+studies:+in+situ+sensing+with+a+ratiometric+dual-emission+probe.">Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe.</a> Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).</li><li>Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+analyses+of+designed+and+selected+mutants+of+protocatechuate+3,4-dioxygenase1.">Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1.</a> Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).</li><li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems.">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li><li>Senavirathne, G., Lopez, M. A., Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+nuclease-free+protocatechuate+3,4-dioxygenase+for+prolonged+single-molecule+fluorescence+imaging.">Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging.</a> Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nature Communications. 7, 11409 (2016).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cascading+MutS+and+MutL+sliding+clamps+control+DNA+diffusion+to+activate+mismatch+repair.">Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair.</a> Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).</li></ol>

Sistemas de limpeza de oxigênio são comumente incluídos na microscopia de fluorescência de molécula única para reduzir o fotobranqueamento3,7,8. Essas técnicas de microscopia são freqüentemente usadas para observar ácidos nucleicos ou interações proteicas com ácidos nucleicos1,13,14. A contaminação dos SEs com nucleases p...

A biofísica de molécula única (SM) é um campo em rápido crescimento mudando a forma como olhamos para fenômenos biológicos. Este campo tem a capacidade única de ligar as leis fundamentais da física e da química à biologia. A microscopia da fluorescência é um método biofísico que pode alcançar a sensibilidade do SM. Fluorescência é usada para detectar biomoléculas, ligando-os a pequenos fluorofônicos orgânicos ou pontos quânticos1. Estas moléculas podem emitir fótons quando excitados por lasers antes do photobleaching irreversivelmente2. Photobleaching ocorre quando os rótulos fluorescentes sofrem danos químicos que destrói sua capacidade de excitar no comprimento de onda desejado2,3. A presença de espécies reativas de oxigênio (ROS) em tampão aquoso são uma das principais causas de fotobranqueamento2,4. Além disso, o ROS pode danificar biomoléculas e levar a observações errôneas nos experimentos sm5,6. Para evitar danos oxidativos, os sistemas de limpeza de oxigênio (OSS) podem ser usados3,7,8. O sistema de oxidase/catalase de glicose (GODCAT) é eficiente na remoção de oxigênio8,mas produz peróxidos potencialmente prejudiciais como intermediários. Estes podem ser prejudiciais para biomoléculas de interesse em estudos de SM.
Alternativamente, o protocatechuato 3,4 dioxygenase (PCD) removerá eficientemente O2 de uma solução aquosa usando seu ácido protocatechuic substrato (PCA)7,9. PCD é uma metalloenzima que usa ferro autónomos para coordenar PCA e catalisar a reação de abertura do anel catechol usando dissolvido O210. Esta reação de um passo é mostrado para ser um oss global melhor para melhorar a estabilidade do fluorofóbico em experimentos SM7. Infelizmente, muitas enzimas oss comercialmente disponíveis, incluindo PCD, contêm nucleases contaminantes11. Esses contaminantes podem levar ao dano de substratos à base de ácido nucleico usados em experimentos com SM. Este trabalho irá elucidar um protocolo de purificação à base de cromatografia para o uso de PCD recombinante em sistemas de SM. Pcd pode ser amplamente aplicado a qualquer experimento onde ROS estão prejudicando os substratos necessários para a aquisição de dados.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>&#946;ME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, Glacial Certified ACS</td>
			<td>Fisherl Chemical</td>
			<td>A38C-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Granulated</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>DF0145-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA FPLC System</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC201024</td>
			<td>10 kDa MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F-2262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS) Tablets</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>K833-100TABS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0339-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>DF0123173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90004-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIS-TRIS propane,&#62;=99.0% (titration)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6755-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0472-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96&#8211;Well Flat&#8211;Bottom EIA Plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2240096EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>P212121</td>
			<td>SV-DTT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 500ML</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G37-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granulated LB Broth Miller</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>1.10285.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Res Standard Agarose</td>
			<td>AGTC Bioproducts</td>
			<td>AG500D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0250-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11017128001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from Chicken Egg White</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0288-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>P212121</td>
			<td>RP-S23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow (100 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novagen BL21 Competent Cells</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>69-449-3</td>
			<td>SOC media included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0-267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>P-020-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0754-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN15642110</td>
			<td>PCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>P212121</td>
			<td>CI-00270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M2 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devises</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane &#62; 250mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-741-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane &#62; 500mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-741-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 12 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17517301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0761-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Ultra Pure</td>
			<td>Gojira Fine Chemicals</td>
			<td>UTS1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure EDTA</td>
			<td>Invitrogen/Gibco</td>
			<td>15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208086</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression and purification of nuclease-free oxygen scavenger protocatechuate 3,4-dioxygenase

A microscopia de molécula única (SM) é usada no estudo de interações moleculares dinâmicas de biomoléculas rotuladas por fluorofóforos em tempo real. No entanto, os fluorofônicos são propensos à perda de sinal através do fotobranqueamento por oxigênio dissolvido (O2). Para evitar o reclareamento e estender a vida fluorofônica, os sistemas de limpeza de oxigênio (OSS) são empregados para reduzir O2. OsS comercialmente disponíveis podem ser contaminados por nucleases que danificam ou degradam os ácidos nucleicos, confundindo a interpretação dos resultados experimentais. Aqui detalhamos um protocolo para a expressão e purificação de pseudomonas altamente ativas putida protocatechuato-3,4-dioxigenase (PCD) sem contaminação por nuclease detectável. Pcd pode remover eficientemente reativo O2 espécies através da conversão do ácido protocatecogênico substrato (PCA) para 3-carboxy-cis, ácido cis-muconic. Este método pode ser usado em qualquer sistema aquoso onde O2 desempenha um papel prejudicial na aquisição de dados. Este método é eficaz na produção de PCD altamente ativo, livre de nuclease em comparação com PCD comercialmente disponível.

Pcd de scavenger de oxigênio comercialmente disponível é freqüentemente contaminado com uma nuclease de DNA. Contaminar a atividade da nuclease pode levar a resultados espúrios em estudos fluorescentes, particularmente estudos que analisam proteínas interagindo com DNA ou DNA. Descobrimos que pcd recombinante, um heterodimer de hexahistidina marcado pcaH e pcaG, pode ser expressa em E. coli (Figura 1). O heterodimero é primeiro purificado pela cromatog...

Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase at JoVE.com

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Protocatechuato 3,4-dioxygenase (PCD) pode enzimática remover o oxigênio diatômico livre de um sistema aquoso usando seu ácido protocatechuic substrato (PCA). Este protocolo descreve a expressão, purificação e análise de atividade desta enzima de limpeza de oxigênio.

Expressão e purificação do protocatechuato de oxigênio sem nuclease 3,4-Dioxigenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Nosso protocolo produz PCD altamente ativo livre de nuclease detectável, que pode ser usado em qualquer solução onde o oxigênio aquoso é um contaminante. As técnicas que usamos são fáceis de replicar e garantem que não haja contaminantes nuclease no produto. Para começar, combine um microliter de expressão pVP91A-pcaHG PCD plasmid e 20 microliters de E.coli BL21 comercialmente disponível em um tubo.Flick o tubo para misturar, e coloque o tubo no gelo por cinco minutos. Para continuar a reação de transformação, coloque o tubo em um banho de água a 42 graus Celsius por 30 segundos, depois no gelo por dois minutos. Adicione 80 microliters de mídia SOC, e agite a 225 rpm e 37 graus Celsius por uma hora.Em seguida, despeje a mistura de reação de transformação em um ágar LB-ampicillin, e use um espalhador de placas para espalhar a mistura. Cubra a placa com uma tampa e incubar a placa a 37 graus Celsius por 16 a 18 horas. Depois disso, escolha uma colônia da placa, e inocula em 50 microlitrais de LB-ampicillin em um frasco erlenmeyer de 250 mililitros.Coloque o frasco em um shaker a 225 rpm para incubar a 37 graus Celsius por 16 a 18 horas. Em seguida, transfira 20 mililitros da cultura incubada para um frasco de quatro litros cheio de um litro de LB-ampicillin. Agite a 225 rpm a 37 graus Celsius.A cada hora, desenhe um mililitro da cultura em um cuvette para medir a densidade óptica em 600 nanômetros em um fotômetro. À medida que a densidade óptica da cultura aumenta perto de 0,5, aumente a frequência de medições a cada 15 minutos, até que o OD600 atinja 0,5. Então, transfira o frasco de quatro litros para uma caixa de gelo.Gire o frasco no banho de gelo para reduzir a temperatura da cultura. Transfira o frasco de quatro litros para uma incubadora a 17 graus Celsius e 180 rpm. Continue monitorando o OD600 a cada 20 minutos.A 0,7 OD600, adicione soluções de estoque de hexahidrato de ferro IPTG e amônio para atingir uma concentração final de 0,5 milimilitro e 10 miligramas por litro, respectivamente. Agitar a cultura a 180 rpm e 17 graus Celsius por 18 horas. Após a incubação, coloque o frasco de cultura no gelo por dois minutos.Colher um mililitro das células induzidas em um tubo de microcentrifuge de polipropileno de 1,5 mililitro para análise de SDS-PAGE. Em seguida, despeje a cultura bacteriana em garrafas, 500 mililitros cada garrafa, para centrifugação. Pelota a cultura a quatro graus Celsius e 3.000 vezes g por 20 minutos.Decantar os supernantes. Pipeta para resuspensar as pelotas, cada uma em 12,5 mililitros de PBS frio, e combinar a cada duas resuspensões em um tubo cônico de 50 mililitros. Pelotar as células novamente como anteriormente.Em seguida, descarte os supernacantes e use uma pipeta para adicionar 10 mililitros de tampão de lise em cada tubo para resuspensar as células. Depois de sonicar os tubos com células induzidas, despeje o linfit bacteriano em um frasco de policarbonato pré-refrigerado. Centrífuga por 60 minutos a 120.000 vezes g e quatro graus Celsius, e despeje o supernatante a um tubo cônico frio de 50 mililitros.Depois de preparar o instrumento FPLC com a coluna de resina carregada de níquel, carregue a amostra para a coluna a 0,15 mililitros por minuto. Lave a coluna com 20 mililitros de tampão de níquel a imidazol de 20 mililitros. Retenha a lavagem em um tubo de 50 mililitros para análise.Em seguida, lave a coluna com 15 mililitros de tampão de níquel a 125 mililitros imidazol. Colete a elução em 19 frações de 0,8 mililitros cada. Lave a coluna novamente com 15 mililitros de 100% de níquel tampão B, e colete 75 frações adicionais de 0,2 mililitros cada.Continue com a análise das frações coletadas em géis 12%SDS-PAGE para confirmar a presença de PCD. Primeiro, adicione 35 microliters de tampão de reação a um tubo de microcentrifuge de polipropileno de 1,5 mililitro. No tubo, combine cinco microlitadores das frações de cromatografia de pico e 500 nanogramas de três quilogramas de par de plasmídeos supervilecidos pXba.Coloque o tubo em um banho de água a 37 graus Celsius durante uma hora. Depois de preparar gel de ágarose de acordo com o manuscrito, adicione 30 microliters de cada reação em poços no gel. Eletroforese a 10 volts por centímetro a temperatura ambiente por aproximadamente uma hora.Agora, o corante G laranja chegou ao fim do gel. Imediatamente, use um scanner de fluorescência para imaginar o sinal de brometo de ethidium do gel. Com a função da intensidade e tamanho do pixel de imagem, determine o volume de pixels das várias espécies de DNA, como círculos supercoados, lineares e cortados.Para determinar a porcentagem de cada espécie de DNA, divida o volume de pixels de uma única espécie de DNA pelo volume total de pixels para todas as espécies individuais. A análise SDS-PAGE mostra que o segundo pico de elução contém contaminação mínima de proteína, o que representa heterodimer PCD quase puro e atividade nuclease mínima e indetectável. Assim, misture estas 10 frações da segunda eluição pcd em um tubo cônico de cinco mililitros para análise posterior.Após a purificação cromatografia de exclusão de tamanho do PCD, em uma sala fria de quatro graus Celsius, combine em um tubo de microcentrifuse volume apropriado de cloreto de sódio, cloridrato tris, cloreto de magnésio, dithiothreitol, PCA, e pXba plasmid supercoiled para fazer um estoque de 5X. Coloque uma placa de fundo plano de 96 poços no gelo e transfira 10 microliters da solução 5X combinada para os poços. Imediatamente antes da análise, adicione a cada poço 10 microliters das frações individuais da SEC PCD.Coloque o leitor de placas a uma temperatura interna de 37 graus Celsius e transfira a placa de 96 poços para o suporte da placa. Retire o suporte da placa no instrumento e meça a absorvância em 290 nanômetros em intervalos de 20 segundos durante uma hora. Coloque o instrumento para agitar a placa cinco segundos antes de cada leitura.Após uma hora, adicione 10 microliters de solução stop a cada poço para encerrar as reações. Realize a eletroforese de gel para as frações PCD SEC. Selecione frações com maior atividade de oxidação pca, indicadas pela diminuição da absorvância e sem contaminação por nuclease observada.Meça a absorvância em 280 nanômetros e calcule a concentração total de PCD com base na absorção e no coeficiente de extinção. Armazene as frações selecionadas para armazenamento a longo prazo a menos 80 graus Celsius. Neste experimento, verificou-se que o PCD recombinante, um heterodimer de hexahistidina marcado pcaH e pcaG, foi expresso em E.coli.O heterodimer foi purificado pela primeira vez por cromatografia de afinidade de níquel. A absorvância é mostrada em azul, e a concentração percentual de tampão de níquel B é mostrada em vermelho. O fluxo mostra as proteínas bacterianas solúveis que não se ligam à resina de níquel.Alguns PCD eluiram na presença de imidazol 125 milimiliar, mas a maioria da proteína eluiudiou em imidazol de 250 milimolares. A análise representativa da SDS-PAGE indica que as frações da etapa de elução estavam livres de contaminantes. Gel agarose de ensaio nuclease revela contaminação através da comparação com o controle negativo sem proteína adicionada e um controle positivo contaminado com uma nuclease de DNA.A quantitação das várias espécies de DNA observadas no ensaio de gel de agarose mostra que as frações 29 a 38 tinham pouca atividade nuclease, que foram escolhidas para serem combinadas, concentradas e ainda purificadas pela SEC. Dados de três frações representativas da SEC mostraram que o PCD purificado reduziu a absorção em 290 nanômetros, indicando oxidação de PCA. Após este procedimento, o PCD purificado pode ser usado e otimizado no sistema de limpeza de oxigênio desejado.Isso determinará a quantidade exata de PCD necessária para o sistema. Esta técnica tem sido usada para prolongar a vida fluorófora em experimentos de microscopia de molécula única, o que permitiu por períodos mais longos de coleta de dados. O ultracentrifuge usado é perigoso.Certifique-se de que as centrífugas estão adequadamente equilibradas antes de girar. Brometo de ethidium é um reagente perigoso. Evite o contato usando equipamentos de proteção individual e descarte-o adequadamente.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Termoestabilização, expressão, purificação e cristalização do transportador de serotonina humano Bound to<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Bioquímica

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Expressão, Purificação e Actividade Antimicrobiana de S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Purificação e reconstituição de TRPV1 para análise espectroscópica

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Expressão e purificação dos canais de íon Bestrophin mamíferos

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Amostragem e tratamento prévio de esmalte do dente carbonato de carbono estável e análise de isótopos de oxigênio

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Purificação de proteínas anaeróbica e análise cinética através do eletrodo de oxigênio para estudar a inibição e atividade dioxigenase DesB

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Medindo e interpretando a taxas de consumo de oxigênio em toda a cabeça segmentos de voar

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Expressão e purificação de TRPC3 os humanos sensíveis lipídico cação canal para determinação estrutural por microscopia de Single-particle Cryo-elétron

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Expressão, solubilização e purificação de transportadores eucarióticas borato

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...