Name: expression and purification of nuclease-free oxygen scavenger protocatechuate 3,4-dioxygenase
Uploaded: 2019-11-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase at JoVE.com

Эта работа была поддержана NIH GM121284 и AI126742 в KEY.

1. Индуцировать выражение PCD в кишечной палочке
<ol><li>Объедините 1 l pVP91A-pcaHG PCD выражение плазмида (20 нг/Зл, Рисунок 1A) и 20 Зл E.coli BL21 (20 л коммерчески доступных клеток, 2 х 106 cfu/qsmid) в трубке. Флик трубки для смешивания. Поместите трубку на лед 5 мин.</li>
	<li>По...

<ol>
	<li>Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+single+fluorescent+molecules.">Detection of single fluorescent molecules.</a> Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).</li><li>Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+reactive+oxygen+species+to+the+photobleaching+of+organic+fluorophores.">The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores.</a> Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).</li><li>Ha, T., Tinnefeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photophysics+of+fluorescent+probes+for+single-molecule+biophysics+and+super-resolution+imaging.">Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).</li><li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy:+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy.">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).</li><li>Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+species+formed+on+proteins+exposed+to+singlet+oxygen.">Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen.</a> Photochemical &#38; Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).</li><li>Sies, H., Menck, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Singlet+oxygen+induced+DNA+damage.">Singlet oxygen induced DNA damage.</a> Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).</li><li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments.">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li><li>Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+coupling+in+actomyosin+energy+transduction+studied+by+in+vitro+movement+assay.">Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay.</a> Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).</li><li>Shi, X., Lim, J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidification+of+the+oxygen+scavenging+system+in+single-molecule+fluorescence+studies:+in+situ+sensing+with+a+ratiometric+dual-emission+probe.">Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe.</a> Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).</li><li>Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+analyses+of+designed+and+selected+mutants+of+protocatechuate+3,4-dioxygenase1.">Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1.</a> Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).</li><li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems.">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li><li>Senavirathne, G., Lopez, M. A., Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+nuclease-free+protocatechuate+3,4-dioxygenase+for+prolonged+single-molecule+fluorescence+imaging.">Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging.</a> Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nature Communications. 7, 11409 (2016).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cascading+MutS+and+MutL+sliding+clamps+control+DNA+diffusion+to+activate+mismatch+repair.">Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair.</a> Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).</li></ol>

Системы очистки кислорода обычно включаются в одну молекулу флуоресценции микроскопии, чтобы уменьшить фотоотбеление3,7,8. Эти методы микроскопии часто используются для наблюдения нуклеиновых кислот или белковых взаимодействий с нук?...

Биофизика одной молекулы (SM) является быстро растущим полем, меняющим то, как мы смотрим на биологические явления. Эта область обладает уникальной способностью связывать фундаментальные законы физики и химии с биологией. Флуоресцентная микроскопия является одним из биофизических методов, которые могут достичь чувствительности СМ. Флуоресценция используется для обнаружения биомолекул, связывая их с небольшими органическими флюорофорами или квантовыми точками1. Эти молекулы могут излучать фотоны, когда возбужденных лазерами до фотоотбелевания необратимо2. Фотоотбеление происходит, когда флуоресцентные этикетки проходят химические повреждения, которые разрушают их способность возбуждать на желаемой длине волны2,3. Присутствие реактивных видов кислорода (ROS) в вавном буфере являются основной причиной фотоотбелевания2,4. Кроме того, ROS может повредить биомолекулы и привести к ошибочным наблюдениям в SM экспериментов5,6. Для предотвращения окислительного повреждения можно использовать системы очистки кислорода (OSS)3,7,8. Глюкоза оксидаза / каталазы (GODCAT) система эффективна при удалении кислорода8, но она производит потенциально опасных перекиси в качестве промежуточных. Они могут нанести ущерб биомолекулам, представляющим интерес в исследованиях СМ.
Кроме того, протокатчуат 3,4 диоксигеназы (PCD) будет эффективно удалить O2 из вогового раствора с помощью субстрата protocatechuic кислоты (PCA)7,9. PCD является металлоэнзим, который использует nonheme железа для координации PCA и катализировать катехиз омрачаемого кольца открытия реакции с помощью растворенного O210. Это один шаг реакции показано, что в целом лучше OSS для улучшения стабильности фторофора в SM экспериментов7. К сожалению, многие коммерчески доступные ферменты OSS, включая ПХД, содержат загрязняющие нуклеазы11. Эти загрязняющие вещества могут привести к повреждению субстратов на основе нуклеиновой кислоты, используемых в экспериментах с СМ. Эта работа позволит разъяснить протокол очистки на основе хроматографии для использования рекомбинантных PcD в системах SM. PCD может быть широко применен к любому эксперименту, где ROS повреждает субстраты, необходимые для получения данных.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>&#946;ME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, Glacial Certified ACS</td>
			<td>Fisherl Chemical</td>
			<td>A38C-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Granulated</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>DF0145-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA FPLC System</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC201024</td>
			<td>10 kDa MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F-2262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS) Tablets</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>K833-100TABS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0339-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>DF0123173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90004-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIS-TRIS propane,&#62;=99.0% (titration)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6755-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0472-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96&#8211;Well Flat&#8211;Bottom EIA Plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2240096EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>P212121</td>
			<td>SV-DTT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 500ML</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G37-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granulated LB Broth Miller</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>1.10285.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Res Standard Agarose</td>
			<td>AGTC Bioproducts</td>
			<td>AG500D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0250-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11017128001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from Chicken Egg White</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0288-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>P212121</td>
			<td>RP-S23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow (100 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novagen BL21 Competent Cells</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>69-449-3</td>
			<td>SOC media included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0-267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>P-020-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0754-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN15642110</td>
			<td>PCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>P212121</td>
			<td>CI-00270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M2 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devises</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane &#62; 250mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-741-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane &#62; 500mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-741-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 12 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17517301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0761-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Ultra Pure</td>
			<td>Gojira Fine Chemicals</td>
			<td>UTS1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure EDTA</td>
			<td>Invitrogen/Gibco</td>
			<td>15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208086</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression and purification of nuclease-free oxygen scavenger protocatechuate 3,4-dioxygenase

Единая молекула (SM) микроскопия используется в изучении динамических молекулярных взаимодействий флюорофора помечены биомолекулы в режиме реального времени. Тем не менее, фторофоры склонны к потере сигнала через фотоотбеление растворенного кислорода (O2). Для предотвращения фотоотбеления и продления срока службы фторофора, системы очистки кислорода (OSS) используются для уменьшения O2. Коммерчески доступные ПСО могут быть загрязнены нуклеазами, которые повреждают или ухудшают нуклеиновой кислоты, сбивая с толку интерпретацию экспериментальных результатов. Здесь мы подробно протокол для выражения и очистки высокоактивных Pseudomonas putida протокатечуат-3,4-диоксигеназы (PCD) без каких-либо обнаруживаемых загрязнения нуклеазы. PCD может эффективно удалить реактивные O2 видов путем преобразования субстрата протокатчуйской кислоты (PCA) в 3-карбокси-цис, cis-muconic кислоты. Этот метод может быть использован в любой водной системе, где O2 играет пагубную роль в получении данных. Этот метод эффективен в производстве высокоактивных, нуклеаза бесплатно PCD по сравнению с коммерчески доступных PCD.

Коммерчески доступный кислородный мусорщик PCD часто загрязнен нуклеазой ДНК. Загрязнение нуклеаза деятельности может привести к ложным результатам в флуоресцентных исследований, в частности, исследования, которые анализируют ДНК или ДНК взаимодействующих белков. М?...

Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase at JoVE.com

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Протокатчуат 3,4-диоксигеназа (PCD) может ферментативно удалить свободный диатомический кислород из ваневой системы с помощью своего субстрата протокатчуйской кислоты (PCA). Этот протокол описывает экспрессию, очистку и анализ активности этого фермента очистки кислорода.

Выражение и очищение Nuclease-бесплатный кислород Scavenger Протокатечуат 3,4-Диоксигеназы

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Наш протокол дает очень активный PCD, свободный от обнаруживаемых нуклеазы, которые могут быть использованы в любом растворе, где aqueous кислорода является загрязняющим веществом. Методы, которые мы используем, просты в репликации и гарантируют, что в продукте нет загрязняющих веществ нуклеазы. Для начала объедините в трубке один микролитер pVP91A-pcaHG PCD-плазмид и 20 микролитров коммерчески доступных E.coli BL21.Флик трубки для смешивания, и поместите трубку на лед в течение пяти минут. Чтобы продолжить реакцию преобразования, поместите трубку в водяной бане при 42 градусах по Цельсию в течение 30 секунд, затем на лед в течение двух минут. Добавить 80 микролитров SOC средств массовой информации, и встряхнуть при 225 об / мин и 37 градусов по Цельсию в течение одного часа.Далее, залить смесь реакции преобразования на LB-ампициллин агар, и использовать пластины распространитель для распространения смеси. Обложка пластины с крышкой, и инкубировать пластины при 37 градусов по Цельсию в течение 16 до 18 часов. После этого выберите одну колонию из тарелки и прививки в 50 микролитров LB-ампициллина в 250-миллилитровой колбе Эрленмайера.Поместите колбу на шейкер при 225 об/мин, чтобы инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 16-18 часов. Затем перенесите 20 миллилитров инкубационой культуры в четырехлитровую колбу, наполненную одним литром LB-ампициллина. Встряхните при 225 об/мин при 37 градусах по Цельсию.Каждый час, привлечь один миллилитр культуры в кювет для измерения оптической плотности на 600 нанометров на фотометре. По мере увеличения оптической плотности культуры около 0,5, увеличить частоту измерений каждые 15 минут, пока OD600 не достигнет 0,5. Затем перенесите четырехлитровую колбу в корзину со льдом.Закружить колбу в ледяной ванне, чтобы снизить температуру культуры. Перенесите четырехлитровую колбу в инкубатор при 17 градусах Цельсия и 180 об/мин. Продолжайте следить за OD600 каждые 20 минут.При 0,7 OD600 добавьте растворы для гексагидрата IPTG и аммония железа сульфат гексагидрата, чтобы достичь конечной концентрации 0,5 миллимолара и 10 миллиграммов на литр, соответственно. Встряхните культуру при 180 об/мин и 17 градусах по Цельсию в течение 18 часов. После инкубации поместите культурную колбу во льду на две минуты.Урожай один миллилитр индуцированных клеток в 1,5-миллилитровый полипропилен микроцентрифуг трубки для анализа SDS-PAGE. Далее, залить бактериальной культуры в бутылки, 500 миллилитров каждую бутылку, для центрифугации. Пеллет культуры при четырех градусах по Цельсию и 3000 раз г в течение 20 минут.Декант супернатантов. Пипетку, чтобы повторно гранулы, каждый в 12,5 миллилитров холодного PBS, и объединить каждые два повторного незаменимия в 50-миллилитровой конической трубки. Пеллет клетки снова, как и раньше.Затем отбросьте супернатанты и используйте пипетку, чтобы добавить 10 миллилитров буфера лиза в каждую трубку для повторного перерасхода клеток. После sonicating трубок с индуцированными клетками, залить бактериальный лизат в предварительно охлажденной поликарбонат бутылки. Центрифуга в течение 60 минут при 120 000 раз г и четыре градуса Цельсия, и залить супернатант холодной 50-миллилитровой конической трубки.После подготовки прибора FPLC с никель-заряженной смолой колонки, загрузите образец в столбец на 0,15 миллилитров в минуту. Вымойте колонку с 20 миллилитров никеля буфера на 20-миллимолярный имидазол. Сохраните стирку в 50-миллилитровой трубке для анализа.Затем вымойте столбец 15 миллилитров буфера никеля на 125-миллимолярный имидазол. Соберите элюцион в 19 фракций по 0,8 миллилитров каждый. Вымойте столбец снова с 15 миллилитров 100%nickel буфер B, и собрать дополнительные 75 фракций по 0,2 миллилитров каждый.Продолжить анализ собранных фракций на 12%SDS-PAGE гели, чтобы подтвердить наличие PCD. Во-первых, добавьте 35 микролитров буфера реакции в 1,5-миллилитровую полипропиленовую микроцентрифугную трубку. В трубке смешайте пять микролитров пиковых хроматографических фракций и 500 нанограммов трехкилограммовой пары с суперколеной плазмидной pXba.Поместите трубку в водяную баню при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа. После приготовления агарозного геля в соответствии с рукописью, добавьте 30 микролитров каждой реакции в скважины в геле. Электрофорез на 10 вольт в сантиметр при температуре окружающей среды в течение примерно одного часа.Теперь, оранжевый краситель G достиг конца геля. Немедленно используйте сканер флуоресценции для изображения бромистого сигнала этидия геля. С функцией интенсивности и размера пикселя изображения, определить объем пикселей различных видов ДНК, таких как supercoiled, линейные и nicked круги.Чтобы определить процент каждого вида ДНК, разделите объем пикселей одного вида ДНК на общий объем пикселей для всех отдельных видов. Анализ SDS-PAGE показывает, что второй пик элюции содержит минимальное белковое загрязнение, которое представляет собой почти чистый гетенодимер PCD и минимальное до необнаруживаемой активности нуклеазы. Таким образом, объединить эти 10 фракций от второго PCD elution в пятими миллилитровой конической трубки для дальнейшего анализа.После очистки хроматографии размера-исключения PCD, в четырехградумной холодной комнате Цельсия, объединить в микроцентрифуг трубки соответствующий объем хлорида натрия, Tris гидрохлорид, хлорид магния, дитиотрейтол, PCA, и supercoiled плазмид pXba, чтобы сделать 5X запас. Поместите на лед 96-хорошо плоскую нижнюю пластину и перенесите 10 микролитров комбинированного 5X-раствора на скважины. Непосредственно перед анализом добавьте к каждому колодец по 10 микролитров отдельных фракций PCD SEC.Установите считыватель пластины до внутренней температуры 37 градусов по Цельсию, и передать 96-хорошо пластины на держатель пластины. Свясть держатель пластины в инструмент, и измерить абсорбтность на 290 нанометров с 20-секундными интервалами в течение одного часа. Установите инструмент, чтобы встряхнуть пластину за пять секунд до каждого чтения.Через час добавьте 10 микролитров стоп-раствора к каждому хорошо, чтобы прекратить реакции. Выполните гель электрофорез для фракций PCD SEC. Выберите фракции с наибольшей активностью окисления PCA, о чем свидетельствует снижение абсорбции и отсутствие наблюдаемого загрязнения нуклеазы.Измерьте абсорбанс на 280 нанометров и рассчитайте общую концентрацию ПХД на основе абсорбанса и коэффициента вымирания. Храните выбранные фракции для длительного хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию. В этом эксперименте было установлено, что рекомбинантный ПХД, гетередимер гексахистидина с тегами pcaH и pcaG, был выражен в E.coli.Гетеродимер был впервые очищен хроматографией сродства никеля. Абсорбанс показан синим цветом, а процентная концентрация буфера никеля B показана красным цветом. Поток через показывает растворимые бактериальные белки, которые не связываются с никель смолы.Некоторые PCD eluted в присутствии 125-миллимолярского имидазола, но большинство белка eluted в 250-миллимола имидазола. Репрезентативный анализ SDS-PAGE показывает, что фракции от шага элюции были свободны от загрязняющих веществ. Агарозовый гель нуклеазы показывает загрязнение путем сравнения с отрицательным контролем без добавления белка и положительного контроля, загрязненного нуклеазой ДНК.Квантитация различных видов ДНК, наблюдаемых в анализе нуклеазы агарозного геля, показывает, что фракции от 29 до 38 имели небольшую активность нуклеазы, которые были выбраны для комбинированной, концентрированной и дальнейшей очистки SEC. Данные трех репрезентативных фракций SEC показали, что очищенный ПХД снизил абсорбцию на 290 нанометров, что указывает на окисление PCA. После этой процедуры очищенный ПХД может быть использован и оптимизирован в желаемой системе очистки кислорода.Это определит точное количество PCD, необходимое для системы. Этот метод был использован для продления срока службы флюорофора в экспериментах по микроскопии одной молекулы, что позволило в течение более длительных периодов сбора данных. Ультрацентрифуг используется является опасным.Убедитесь, что центрифуги должным образом сбалансированы до вращения. Бромид этидия является опасным реагентом. Избегайте контакта, нося средства индивидуальной защиты, и распоряжаться им надлежащим образом.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Термостабилизации, Expression, очистки и кристаллизации Серотонин Transporter человека Обязанный<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Экспрессия, очистка и антимикробная активность S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Очистка и восстановление TRPV1 для спектроскопического анализа

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Выражение и очистки от млекопитающих Bestrophin ионных каналов

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Выборки и предварительной обработки эмали зубов карбонат для стабильной углерода и кислорода изотопный анализ

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Очищение протеина анаэробных и кинетический анализ через электрод кислорода для изучения DesB Dioxygenase деятельность и ингибирование

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Измерение и интерпретации показателей потребления кислорода в целом летать головы сегментов

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Выражение и очищение человека липидов чувствительных катионного канала TRPC3 структурные определения по одной частицы крио электронная микроскопия

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Выражение, солюбилизация и очистки эукариотических Борат транспортеров

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...