Name: expression and purification of nuclease-free oxygen scavenger protocatechuate 3,4-dioxygenase
Uploaded: 2019-11-08T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por NIH GM121284 y AI126742 a KEY.

1. Inducir la expresión de PCD en E. coli
<ol><li>Combinar 1 plzantes de expresión PCD pVP91A-pcaHG (20 ng/L, Figura 1A) y 20 l de E.coli BL21 (células disponibles comercialmente de 20 l, > 2 x 106 cfu/g de plásmido) en un tubo. Deslice el tubo para mezclar. Coloque el tubo sobre hielo 5 min.</li>
	<li>Coloque la transformación a 42 oC durante 30 s. Luego hielo 2 min.</li>
	<li>Añadir medios SOC de 80 l (caldo súper óptimo con represió...

<ol>
	<li>Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+single+fluorescent+molecules.">Detection of single fluorescent molecules.</a> Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).</li><li>Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+reactive+oxygen+species+to+the+photobleaching+of+organic+fluorophores.">The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores.</a> Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).</li><li>Ha, T., Tinnefeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photophysics+of+fluorescent+probes+for+single-molecule+biophysics+and+super-resolution+imaging.">Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).</li><li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy:+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy.">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).</li><li>Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+species+formed+on+proteins+exposed+to+singlet+oxygen.">Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen.</a> Photochemical &#38; Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).</li><li>Sies, H., Menck, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Singlet+oxygen+induced+DNA+damage.">Singlet oxygen induced DNA damage.</a> Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).</li><li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments.">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li><li>Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+coupling+in+actomyosin+energy+transduction+studied+by+in+vitro+movement+assay.">Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay.</a> Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).</li><li>Shi, X., Lim, J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidification+of+the+oxygen+scavenging+system+in+single-molecule+fluorescence+studies:+in+situ+sensing+with+a+ratiometric+dual-emission+probe.">Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe.</a> Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).</li><li>Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+analyses+of+designed+and+selected+mutants+of+protocatechuate+3,4-dioxygenase1.">Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1.</a> Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).</li><li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems.">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li><li>Senavirathne, G., Lopez, M. A., Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+nuclease-free+protocatechuate+3,4-dioxygenase+for+prolonged+single-molecule+fluorescence+imaging.">Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging.</a> Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nature Communications. 7, 11409 (2016).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cascading+MutS+and+MutL+sliding+clamps+control+DNA+diffusion+to+activate+mismatch+repair.">Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair.</a> Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).</li></ol>

Los sistemas de barrido de oxígeno se incluyen comúnmente en la microscopía de fluorescencia de una sola molécula para reducir el fotoblanqueo3,7,8. Estas técnicas de microscopía se utilizan a menudo para observar ácidos nucleicos o interacciones proteicas con ácidos nucleicos1,13,14. La contaminación de los SSS con nucleasas p...

La biofísica de molécula única (SM) es un campo que cambia rápidamente la forma en que miramos los fenómenos biológicos. Este campo tiene la capacidad única de vincular las leyes fundamentales de la física y la química a la biología. La microscopía de fluorescencia es un método biofísico que puede lograr la sensibilidad SM. La fluorescencia se utiliza para detectar biomoléculas vinculándolas a pequeños fluoróforos orgánicos o puntos cuánticos1. Estas moléculas pueden emitir fotones cuando se excitan con láseres antes de fotoblanquear irreversiblemente2. El fotoblanqueo se produce cuando las etiquetas fluorescentes sufren daños químicos que destruyen su capacidad de excitar a la longitud de onda deseada2,3. La presencia de especies reactivas de oxígeno (ROS) en el tampón acuoso es una causa primaria del fotoblanqueo2,4. Además, ROS puede dañar las biomoléculas y dar lugar a observaciones erróneas en los experimentos SM5,6. Para prevenir el daño oxidativo, se pueden utilizar sistemas de barrido de oxígeno (OSS)3,7,8. El sistema de glucosa oxidasa/catalasa (GODCAT) es eficiente en la eliminación de oxígeno8,pero produce peróxidos potencialmente dañinos como intermedios. Estos pueden ser perjudiciales para las biomoléculas de interés en los estudios SM.
Alternativamente, el protocatechuato 3,4 dioxigenasa (PCD) eliminará eficientemente O2 de una solución acuosa utilizando su sustrato ácido protocatecúico (PCA)7,9. PCD es una metaloenzima que utiliza hierro no hemo para coordinar PCA y catalizar la reacción de apertura del anillo de catecol utilizando O210disuelto. Esta reacción de un paso se ha demostrado para ser un mejor OSS en general para mejorar la estabilidad del fluoróforo en los experimentos SM7. Desafortunadamente, muchas enzimas OSS disponibles comercialmente, incluyendo PCD, contienen nucleasas contaminantes11. Estos contaminantes pueden provocar el daño de sustratos a base de ácido nucleico utilizados en experimentos SM. Este trabajo aclare un protocolo de purificación basado en cromatografía para el uso de PCD recombinante en sistemas SM. PCD se puede aplicar ampliamente a cualquier experimento en el que ROS dañe los sustratos necesarios para la adquisición de datos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>&#946;ME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, Glacial Certified ACS</td>
			<td>Fisherl Chemical</td>
			<td>A38C-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Granulated</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>DF0145-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA FPLC System</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC201024</td>
			<td>10 kDa MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F-2262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS) Tablets</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>K833-100TABS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0339-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>DF0123173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90004-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIS-TRIS propane,&#62;=99.0% (titration)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6755-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0472-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96&#8211;Well Flat&#8211;Bottom EIA Plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2240096EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>P212121</td>
			<td>SV-DTT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 500ML</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G37-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granulated LB Broth Miller</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>1.10285.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Res Standard Agarose</td>
			<td>AGTC Bioproducts</td>
			<td>AG500D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0250-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11017128001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from Chicken Egg White</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0288-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>P212121</td>
			<td>RP-S23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow (100 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novagen BL21 Competent Cells</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>69-449-3</td>
			<td>SOC media included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0-267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>P-020-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0754-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN15642110</td>
			<td>PCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>P212121</td>
			<td>CI-00270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M2 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devises</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane &#62; 250mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-741-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane &#62; 500mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-741-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 12 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17517301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0761-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Ultra Pure</td>
			<td>Gojira Fine Chemicals</td>
			<td>UTS1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure EDTA</td>
			<td>Invitrogen/Gibco</td>
			<td>15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208086</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression and purification of nuclease-free oxygen scavenger protocatechuate 3,4-dioxygenase

La microscopía de molécula única (SM) se utiliza en el estudio de interacciones moleculares dinámicas de biomoléculas etiquetadas con fluoróforo en tiempo real. Sin embargo, los fluoróforos son propensos a la pérdida de señal a través del fotoblanqueo por oxígeno disuelto (O2). Para evitar el fotoblanqueo y prolongar la vida útil del fluoróforo, se emplean sistemas de barrido de oxígeno (OSS) para reducir O2. El SAO disponible comercialmente puede estar contaminado por nucleasas que dañan o degradan los ácidos nucleicos, interpretando confundiendo los resultados experimentales. Aquí detallamos un protocolo para la expresión y purificación de Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) sin contaminación nucleasa detectable. PCD puede eliminar eficientemente las especies reactivas de O2 mediante la conversión del sustrato ácido protocatecúico (PCA) a 3-carboxy-cis, ácido cis-muconic. Este método se puede utilizar en cualquier sistema acuoso donde O2 desempeña un papel perjudicial en la adquisición de datos. Este método es eficaz en la producción de PCD libre de nucleasas altamente activo en comparación con PCD disponible comercialmente.

El PCD carroñero de oxígeno disponible en el nombre comercial con frecuencia está contaminado con una nucleasa de ADN. La contaminación de la actividad nucleasa podría dar lugar a resultados espurios en estudios fluorescentes, particularmente estudios que analizan el ADN o las proteínas que interactúan con el ADN. Hemos encontrado que el PCD recombinante, un heterodérmero de hexahistidina etiquetado pcaH y pcaG, puede expresarse en E. coli (Figura 1)....

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Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Protocatechuato 3,4-dioxigenasa (PCD) puede eliminar enzimáticamente el oxígeno diatómico libre de un sistema acuoso utilizando su sustrato ácido protocatecúrico (PCA). Este protocolo describe la expresión, purificación y análisis de actividad de esta enzima de barrido de oxígeno.

Expresión y purificación de la distribución de oxígeno libre de nucleasa Protocatechuato 3,4-Dioxigenasa

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Nuestro protocolo produce PCD altamente activo libre de nucleasa detectable, que se puede utilizar en cualquier solución donde el oxígeno acuoso es un contaminante. Las técnicas que utilizamos son fáciles de replicar y aseguran que no haya contaminantes nuclesos presentes en el producto. Para empezar, combine un microlitros del plásmido de expresión PCD pVP91A-pcaHG y 20 microlitros de E.coli BL21 disponibles comercialmente en un tubo.Deslice el tubo para mezclar y coloque el tubo sobre hielo durante cinco minutos. Para continuar con la reacción de transformación, coloque el tubo en un baño de agua a 42 grados centígrados durante 30 segundos y luego sobre hielo durante dos minutos. Agregue 80 microlitros de medios SOC y agite a 225 rpm y 37 grados Celsius durante una hora.A continuación, vierta la mezcla de reacción de transformación en un agar LB-ampicilina, y utilice un esparcidor de placas para esparcir la mezcla. Cubra el plato con una tapa e incubar la placa a 37 grados Centígrados durante 16 a 18 horas. Después de eso, escoge una colonia de la placa, e inocular en 50 microlitros de LB-ampicilina en un matraz Erlenmeyer de 250 mililitros.Coloque el matraz en una coctelera a 225 rpm para incubar a 37 grados centígrados durante 16 a 18 horas. A continuación, transfiera 20 mililitros del cultivo incubado a un matraz de cuatro litros lleno de un litro de LB-ampicilina. Agitar a 225 rpm a 37 grados centígrados.Cada hora, dibuje un mililitro del cultivo en una cubeta para medir la densidad óptica a 600 nanómetros en un fotómetro. A medida que la densidad óptica del cultivo aumenta cerca de 0,5, aumente la frecuencia de las mediciones a cada 15 minutos, hasta que el OD600 alcance 0,5. Luego, transfiera el matraz de cuatro litros a un recipiente de hielo.Gire el matraz en el baño de hielo para reducir la temperatura de cultivo. Transfiera el matraz de cuatro litros a una incubadora a 17 grados centígrados y 180 rpm. Continúe monitoreando el OD600 cada 20 minutos.A 0,7 OD600, añada soluciones de stock de hexahidrato de sulfato de hierro IPTG y amonio para alcanzar una concentración final de 0,5 milimolares y 10 miligramos por litro, respectivamente. Agitar el cultivo a 180 rpm y 17 grados centígrados durante 18 horas. Después de la incubación, coloque el matraz de cultivo en hielo durante dos minutos.Cosecha un mililitro de las células inducidas en un tubo de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 mililitros para el análisis SDS-PAGE. A continuación, verter el cultivo bacteriano en botellas, 500 mililitros por botella, para centrifugación. Pele el cultivo a cuatro grados centígrados y 3.000 g durante 20 minutos.Decantar a los sobrenadantes. Pipetear para resuspender los pellets, cada uno en 12,5 mililitros de PBS frío, y combinar cada dos resuspensiones en un tubo cónico de 50 mililitros. Pele las células de nuevo como antes.Luego, deseche los sobrenadantes y use una pipeta para agregar 10 mililitros de tampón de lysis en cada tubo para resuspender las células. Después de sonicar los tubos con células inducidas, verter el izado bacteriano en una botella de policarbonato pre-refrigerado. Centrifugar durante 60 minutos a 120.000 veces g y cuatro grados Celsius, y vierta el sobrenadante en un tubo cónico frío de 50 mililitros.Después de preparar el instrumento FPLC con la columna de resina cargada de níquel, cargue la muestra en la columna a 0,15 mililitros por minuto. Lave la columna con 20 mililitros de tampón de níquel a 20 mililitrolares de imidazol. Conservar el lavado en un tubo de 50 mililitros para su análisis.A continuación, lave la columna con 15 mililitros de tampón de níquel a 125 mililitrolares de imidazol. Recoger la elución en 19 fracciones de 0,8 mililitros cada uno. Lave la columna de nuevo con 15 mililitros de 100% tampón de níquel B, y recoja 75 fracciones adicionales de 0,2 mililitros cada uno.Continuar con el análisis de las fracciones recogidas en geles 12%SDS-PAGE para confirmar la presencia de PCD. En primer lugar, añada 35 microlitros de tampón de reacción a un tubo de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 mililitros. En el tubo, combine cinco microlitros de las fracciones de cromatografía pico y 500 nanogramos de tres kilobases par plásmido supercoilado pXba.Coloque el tubo en un baño de agua a 37 grados centígrados durante una hora. Después de preparar el gel de agarosa según el manuscrito, añadir 30 microlitros de cada reacción en los pozos en el gel. Electroforoso a 10 voltios por centímetro a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora.Ahora, el tinte naranja G ha llegado al final del gel. Inmediatamente, utilice un escáner de fluorescencia para tomar imágenes de la señal de bromuro de etidio del gel. Con la función de la intensidad y el tamaño de píxel de la imagen, determine el volumen de píxeles de las distintas especies de ADN, como círculos superbobinados, lineales y nicked.Para determinar el porcentaje de cada especie de ADN, divida el volumen de píxeles de una sola especie de ADN por el volumen total de píxeles para todas las especies individuales. El análisis SDS-PAGE muestra que el segundo pico de elución contiene una contaminación proteica mínima, que representa heterodímero de PCD casi puro y una actividad de nucleasa mínima a indetectable. Por lo tanto, combine estas 10 fracciones de la segunda elución PCD en un tubo cónico de cinco mililitros para su posterior análisis.Después de la purificación de la cromatografía de exclusión de tamaño de PCD, en una sala fría de cuatro grados Celsius, se combinan en un tubo de microcentrífuga volumen adecuado de cloruro de sodio, clorhidrato de Tris, cloruro de magnesio, ditiothreitol, PCA y plásmido supercoilado pXba para hacer un stock de 5X. Coloque una placa plana de 96 pozos sobre hielo y transfiera 10 microlitros de la solución combinada 5X a los pozos. Inmediatamente antes del análisis, añadir a cada pozo 10 microlitros de las fracciones individuales de PCD SEC.Ajuste el lector de placas a una temperatura interna de 37 grados Celsius y transfiera la placa de 96 pozos al soporte de la placa. Retirar el soporte de la placa en el instrumento y medir la absorbancia a 290 nanómetros a intervalos de 20 segundos durante una hora. Ajuste el instrumento para agitar la placa cinco segundos antes de cada lectura.Después de una hora, añadir 10 microlitros de solución de parada a cada pozo para terminar las reacciones. Realizar electroforesis de gel para las fracciones PCD SEC. Seleccione fracciones con la mayor actividad de oxidación de PCA, indicada por disminución de la absorbancia y sin contaminación de nucleasa observada.Mida la absorbancia a 280 nanómetros y calcule la concentración total de PCD en función de la absorbancia y el coeficiente de extinción. Almacene las fracciones seleccionadas para almacenamiento a largo plazo en menos 80 grados centígrados. En este experimento, se encontró que la PCD recombinante, un heterodista de hexahistidina etiquetado pcaH y pcaG, se expresó en E.coli.El heterodímero fue purificado por primera vez por cromatografía de afinidad de níquel. La absorbancia se muestra en azul, y la concentración porcentual del búfer de níquel B se muestra en rojo. El flujo a través muestra las proteínas bacterianas solubles que no se unieron a la resina de níquel.Algunos PCD eluieron en presencia de imidazol de 125 mililitrolares, pero la mayoría de la proteína eluía en imidazol 250-mililolar. El análisis representativo SDS-PAGE indica que las fracciones de la etapa de elución estaban libres de contaminantes. El gel de agarosa del ensayo de nucleasa revela contaminación comparando con el control negativo sin proteína agregada y un control positivo contaminado con una nucleasa del ADN.La cuantificación de las diversas especies de ADN observadas en el ensayo de nucleasa de gel de agarosa muestra que las fracciones 29 a 38 tuvieron poca actividad de nucleasa, que fueron elegidas para ser combinadas, concentradas y purificadas por sec. Siguiendo este procedimiento, el PCD purificado se puede utilizar y optimizar en el sistema de barrido de oxígeno deseado.Esto determinará la cantidad exacta de PCD necesaria para el sistema. Esta técnica se ha utilizado para prolongar la vida útil del fluoróforo en experimentos de microscopía de molécula única, lo que ha permitido períodos más largos de recolección de datos. La ultracentrífuga utilizada es peligrosa.Asegúrese de que las centrífugas estén correctamente equilibradas antes de girar. El bromuro de etidio es un reactivo peligroso. Evite el contacto usando equipo de protección personal y deséchelo adecuadamente.

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Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Expresión y purificación de los canales iónicos de mamíferos Bestrophin

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Muestreo y tratamiento previo del esmalte de los dientes carbonato de carbono estable e isótopos de oxígeno

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Purificación de proteínas anaerobias y análisis cinético mediante electrodo de oxígeno para el estudio de la inhibición y la actividad de DesB dioxigenasa

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Medición e interpretación de las tasas de consumo de oxígeno en su totalidad operan segmentos de cabeza

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Expresión y purificación de los humanos sensibles a lípido catiónico canal TRPC3 para la determinación estructural por microscopia del Cryo-electrón de solo-partícula

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Expresión, solubilización y purificación de los transportadores de eucariotas borato de

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...