Name: expression and purification of nuclease-free oxygen scavenger protocatechuate 3,4-dioxygenase
Uploaded: 2019-11-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH GM121284 och AI126742 till KEY.

1. inducera PCD-uttryck i E. coli
<ol><li>Kombinera 1 μL pVP91A-pcaHG PCD uttryck plasmid (20 ng/μL, figur 1A) och 20 μl av E. coli BL21 (20 μl kommersiellt tillgängliga celler, > 2 x 106 CFU/μg plasmid) i ett rör. Svep röret för att blanda. Placera röret på is 5 min.</li>
	<li>Förlägga omformningen på 42 ° c för 30 s. Sedan Ice 2 min.</li>
	<li>Tillsätt 80 μL SOC-media (Super optimal buljong med katabolit förtryck: 2,5 mM KC...

<ol>
	<li>Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+single+fluorescent+molecules.">Detection of single fluorescent molecules.</a> Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).</li><li>Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+reactive+oxygen+species+to+the+photobleaching+of+organic+fluorophores.">The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores.</a> Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).</li><li>Ha, T., Tinnefeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photophysics+of+fluorescent+probes+for+single-molecule+biophysics+and+super-resolution+imaging.">Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).</li><li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy:+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy.">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).</li><li>Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+species+formed+on+proteins+exposed+to+singlet+oxygen.">Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen.</a> Photochemical &#38; Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).</li><li>Sies, H., Menck, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Singlet+oxygen+induced+DNA+damage.">Singlet oxygen induced DNA damage.</a> Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).</li><li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments.">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li><li>Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+coupling+in+actomyosin+energy+transduction+studied+by+in+vitro+movement+assay.">Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay.</a> Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).</li><li>Shi, X., Lim, J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidification+of+the+oxygen+scavenging+system+in+single-molecule+fluorescence+studies:+in+situ+sensing+with+a+ratiometric+dual-emission+probe.">Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe.</a> Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).</li><li>Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+analyses+of+designed+and+selected+mutants+of+protocatechuate+3,4-dioxygenase1.">Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1.</a> Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).</li><li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems.">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li><li>Senavirathne, G., Lopez, M. A., Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+nuclease-free+protocatechuate+3,4-dioxygenase+for+prolonged+single-molecule+fluorescence+imaging.">Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging.</a> Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nature Communications. 7, 11409 (2016).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cascading+MutS+and+MutL+sliding+clamps+control+DNA+diffusion+to+activate+mismatch+repair.">Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair.</a> Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).</li></ol>

Syre rensning system ingår vanligen i Single molekylens fluorescens mikroskopi att minska photoblekning3,7,8. Dessa mikroskopi tekniker används ofta för att observera nukleinsyror eller protein interaktioner med nukleinsyror1,13,14. Kontaminering av OSSs med nukleaser kan leda till falska resultat.
Kommers...

En enda molekyl (SM) biofysik är ett snabbt växande område som förändrar hur vi ser på biologiska fenomen. Detta område har den unika förmågan att koppla grundläggande fysikens lagar och kemi till biologi. Fluorescens-mikroskopi är en biofysisk metod som kan uppnå SM-känslighet. Fluorescens används för att detektera biomolekyler genom att länka dem till små organiska fluorofomedel eller kvantprickar1. Dessa molekyler kan avge fotoner när upphetsad av lasrar innan photoblekning oåterkalleligt2. Photoblekning uppstår när fluorescerande etiketter genomgår kemisk skada som förstör deras förmåga att excitera vid önskad våglängd2,3. Förekomst av reaktiva syreradikaler (ros) i vattenbuffert är en primär orsak till foto blekning2,4. Dessutom kan ros skada biomolekyler och leda till felaktiga observationer i SM-experiment5,6. För att förhindra oxidativ skada kan syre rensnings system (oss) användas3,7,8. Glukos oxidas/catalase (GODCAT) systemet är effektivt på att ta bort syre8, men det producerar potentiellt skadliga peroxider som intermediärer. Dessa kan vara skadliga för biomolekyler av intresse för SM-studier.
Alternativt, protocatechuate 3, 4 dioxygenas (PCD) kommer effektivt att ta bort O2 från en vattenlösning med hjälp av dess substrat protocatechuic syra (PCA)7,9. PCD är ett metalloenzym som använder höjare järn för att samordna PCA och katalysera katekol ring öppnings reaktionen med hjälp av upplöst O210. Detta ett steg reaktion visar sig vara en övergripande bättre OSS för att förbättra fluorophore stabilitet i SM experiment7. Tyvärr innehåller många kommersiellt tillgängliga OSS-enzymer, inklusive PCD, kontaminerande nukleaser11. Dessa föroreningar kan leda till skador av nukleinsyra-baserade substrat som används i SM experiment. Detta arbete kommer att belysa ett kromatografibaserat renings protokoll för användning av rekombinant PCD i SM-system. PCD kan tillämpas i stor utsträckning på alla experiment där ROS är skadliga substrat som behövs för datainsamling.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>&#946;ME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, Glacial Certified ACS</td>
			<td>Fisherl Chemical</td>
			<td>A38C-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Granulated</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>DF0145-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA FPLC System</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC201024</td>
			<td>10 kDa MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F-2262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS) Tablets</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>K833-100TABS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0339-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>DF0123173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90004-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIS-TRIS propane,&#62;=99.0% (titration)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6755-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0472-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96&#8211;Well Flat&#8211;Bottom EIA Plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2240096EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>P212121</td>
			<td>SV-DTT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 500ML</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G37-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granulated LB Broth Miller</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>1.10285.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Res Standard Agarose</td>
			<td>AGTC Bioproducts</td>
			<td>AG500D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0250-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11017128001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from Chicken Egg White</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0288-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>P212121</td>
			<td>RP-S23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow (100 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novagen BL21 Competent Cells</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>69-449-3</td>
			<td>SOC media included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0-267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>P-020-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0754-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN15642110</td>
			<td>PCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>P212121</td>
			<td>CI-00270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M2 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devises</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane &#62; 250mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-741-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane &#62; 500mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-741-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 12 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17517301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0761-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Ultra Pure</td>
			<td>Gojira Fine Chemicals</td>
			<td>UTS1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure EDTA</td>
			<td>Invitrogen/Gibco</td>
			<td>15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208086</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression and purification of nuclease-free oxygen scavenger protocatechuate 3,4-dioxygenase

Single molekyl (SM) mikroskopi används i studiet av dynamiska molekylära interaktioner av fluorophore märkta biomolekyler i realtid. Fluoroforer är dock utsatta för förlust av signal via foto blekning genom upplöst syre (O2). För att förhindra foto blekning och förlänga fluorofores livstid används syre rensnings system (OSS) för att minska O2. Kommersiellt tillgängliga OSS kan vara förorenade av nukleaser som skadar eller försämrar nukleinsyror, confounding tolkning av experimentella resultat. Här specificerar vi ett protokoll för uttryck och rening av mycket aktiva Pseudomonas putida protocatechuate-3, 4-dioxygenase (PCD) utan påvisbara nukleasförorening. PCD kan effektivt avlägsna reaktiva O2 arter genom omvandling av substratet protocatechuic Acid (PCA) till 3-karboxy-CIS, CIS-mukonsyra. Denna metod kan användas i alla vattensystem där O2 spelar en skadlig roll i datainsamling. Denna metod är effektiv i att producera mycket aktiva, Nuclease gratis PCD i jämförelse med kommersiellt tillgänglig PCD.

Kommersiellt tillgängliga syre Scavenger PCD är ofta förorenat med en DNA-nukleas. Kontaminerande nukleasaktivitet kan leda till falska resultat i fluorescerande studier, särskilt studier som analyserar DNA eller DNA-samverkande proteiner. Vi har funnit att rekombinant PCD, en heterodimer av hexahistidine märkta pcaH och pcaG, kan uttryckas i E. coli (figur 1). Den heterodimer renas först genom nickel affinitetskromatografi (figur 2...

Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase at JoVE.com

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Protocatechuat 3, 4-dioxygenase (PCD) kan enzymatiskt avlägsna fritt diatomärt syre från ett vattensystem med hjälp av dess substrat protocatechuic Acid (PCA). Detta protokoll beskriver uttrycket, renings-och aktivitets analysen av detta enzym för syre rensning.

Uttryck och rening av Nukleasfri syre avskiljare Protocatechuat 3, 4-dioxygenas

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Vårt protokoll ger mycket aktiv PCD fri från detekterbar nukleas, som kan användas i alla lösningar där vattenhaltigt syre är en förorening. De tekniker vi använder är lätta att replikera och säkerställer att inga nukleasföroreningar finns i produkten. Till att börja, kombinera en mikroliter av pVP91A-pcaHG PCD uttryck plasmid och 20 mikroliter av kommersiellt tillgängliga E.coli BL21 i ett rör.Snärta röret för att blanda, och placera röret på is i fem minuter. För att fortsätta omvandlingsreaktionen placerar du röret i ett vattenbad vid 42 grader Celsius i 30 sekunder, sedan på is i två minuter. Tillsätt 80 mikroliter SOC-media och skaka vid 225 rpm och 37 grader Celsius i en timme.Därefter häll omvandlingen reaktionsblandningen på en LB-ampicillin agar, och använda en tallrik spridare för att sprida blandningen. Täck plattan med lock, och inkubera plattan i 37 grader Celsius i 16 till 18 timmar. Efter det, plocka en koloni från plattan, och vaccinera i 50 mikroliter lb-ampicillin i en 250-milliliter Erlenmeyer kolv.Placera kolven på en skakmaskin vid 225 rpm för att inkubera vid 37 grader Celsius i 16 till 18 timmar. Överför sedan 20 milliliter av den ruvade kulturen till en fyra-liters kolv fylld med en liter LB-ampicillin. Skaka vid 225 rpm vid 37 grader Celsius.Varje timme, dra en milliliter av kulturen i en cuvette för att mäta den optiska densiteten vid 600 nanometer på en fotometer. När kulturens optiska densitet ökar nära 0,5, öka frekvensen av mätningar till var 15 minuter, tills OD600 når 0,5. Sedan överför du fyra-literskolven till en behållare med is.Snurra kolven i isbadet för att minska odlingstemperaturen. Överför fyraliterskolven till en inkubator vid 17 grader Celsius och 180 rpm. Fortsätt att övervaka OD600 var 20:e minut.Vid 0,7 OD600, tillsätt IPTG och ammoniumjärnsulfat hexahydrat lager lösningar för att nå en slutlig koncentration av 0,5 millimolar och 10 milligram per liter, respektive. Skaka kulturen vid 180 rpm och 17 grader Celsius i 18 timmar. Efter inkubationen placerar du odlingskolven i is i två minuter.Skörda en milliliter av de inducerade cellerna i ett 1,5 milliliter polypropylenmikrocentrifugrör för SDS-PAGE-analys. Därefter häller du bakteriekulturen i flaskor, 500 milliliter varje flaska, för centrifugering. Pellet kulturen vid fyra grader Celsius och 3, 000 gånger g i 20 minuter.Dekantera supernatanterna. Pipett för att återanvända pellets, var och en i 12,5 milliliter kall PBS, och kombinera varannan resuspensions i en 50-milliliter koniska rör. Pellet cellerna igen som tidigare.Sedan, kasta supernatanter, och använda en pipett för att lägga till 10 milliliter av lysbuffert i varje rör för att återanvända cellerna. Efter sonicating rören med inducerad celler, häll bakteriell lysate i en pre-kyld polykarbonat flaska. Centrifugera i 60 minuter vid 120, 000 gånger g och fyra grader Celsius, och häll supernatanten till ett kallt 50-milliliter koniskt rör.När du har förberett FPLC-instrumentet med den nickelladdade hartskolonnen, lasta provet till kolonnen i 0,15 milliliter per minut. Tvätta kolonnen med 20 milliliter nickelbuffert vid 20-millimolar imidazol. Behålla tvätten i ett 50-milliliter rör för analys.Därefter tvätta kolumnen med 15 milliliter nickelbuffert på 125-millimolar imidazol. Samla elueringen i 19 fraktioner på vardera 0,8 milliliter. Tvätta kolonnen igen med 15 milliliter på 100%nickelbuffert B, och samla in ytterligare 75 fraktioner på 0,2 milliliter vardera.Fortsätt med analysen av de insamlade fraktionerna på 12%SDS-PAGE geler för att bekräfta förekomst av PCD. Lägg först till 35 mikroliter reaktionsbuffert till ett 1,5 milliliter polypropylenmikrocentrifugrör. I röret, kombinera fem mikroliter av toppkromatografi fraktioner och 500 nanogram av tre kilobase par superskylda plasmid pXba.Placera röret i ett vattenbad på 37 grader Celsius i en timme. Efter att ha förberett agarosgel enligt manuskriptet, tillsätt 30 mikroliter av varje reaktion i brunnar i gelen. Elektrofors vid 10 volt per centimeter vid omgivningstemperatur i ungefär en timme.Nu har det orangefärgade G-färgämnet nått änden av gelen. Omedelbart, använd en fluorescensscanner för att avbilda gelens ethidiumbromidsignal. Med funktionen av intensiteten och bildpunktsstorleken, bestämma pixelvolymen för de olika DNA-arterna, till exempel superspolade, linjära och nickade cirklar.För att bestämma procentandelen av varje DNA-art, dividera pixelvolymen för en enda DNA-art med den totala pixelvolymen för alla enskilda arter. SDS-PAGE-analysen visar att den andra elueringstoppen innehåller minimal proteinkontaminering, vilket representerar nästan ren PCD-heterodimer och minimal till omätbar nukleasaktivitet. Kombinera således dessa 10 fraktioner från den andra PCD-elueringen i ett koniskt rör på fem milliliter för vidare analys.Efter storlek-uteslutning kromatografi rening av PCD, i en fyra-graders Celsius kylrum, kombinera i en mikrocentrifug rör lämplig volym av natriumklorid, Tris hydroklorid, magnesiumklorid, dithiothreitol, PCA, och superskylt plasmid pXba att göra en 5X lager. Placera en 96-väl platt-bottenplatta på is, och överför 10 mikroliter av den kombinerade 5X-lösningen till brunnarna. Omedelbart före analys, lägg till varje brunn 10 mikroliter av de enskilda PCD SEC fraktioner.Ställ plattan läsaren till en inre temperatur på 37 grader Celsius, och överföra 96-väl plattan till plattan innehavaren. Dra tillbaka platthållaren i instrumentet, och mät absorbans med 290 nanometer med 20-sekunders intervall i en timme. Ställ in instrumentet så att plattan skakas fem sekunder före varje avläsning.Efter en timme, tillsätt 10 mikroliter stopplösning till varje brunn för att avsluta reaktionerna. Utför gelelektrofores för PCD SEC-fraktionerna. Välj bråk med mest PCA-oxidationsaktivitet, indikerade av minskad absorbans och ingen observerad nukleaskontaminering.Mät absorbansen vid 280 nanometer, och beräkna den totala PCD-koncentrationen baserat på absorbansen och utrotningskoefficienten. Lagra de valda fraktionerna för långtidsförvaring vid minus 80 grader Celsius. I detta experiment konstaterades att rekombinanta PCD, en heterodimer av hexahistidine taggade pcaH och PCAG, uttrycktes i E.coli.Heterodimer först renas av nickel affinitet kromatografi. Absorbansen visas i blått, och centkoncentrationen av nickelbuffert B visas i rött. Genomströmningen visar de lösliga bakterieproteiner som inte binder till nickelhartsen.Vissa PCD eluted i närvaro av 125-millimolar imidazol, men majoriteten av proteinet eluted i 250-millimolar imidazol. Representativ SDS-PAGE-analys visar att bråken från elueringssteget var fria från föroreningar. Agarose gel av nukleas assay avslöjar kontaminering genom att jämföra med den negativa kontrollen utan tillsatt protein och en positiv kontroll förorenad med en DNA-nukleas.Kvantifiering av de olika DNA-arter som observerats i agaros gel nuclease analysen visar fraktioner 29 genom 38 hade lite nukleas aktivitet, som valdes för att kombineras, koncentrerade, och ytterligare renas av SEC. Data från tre representativa SEC fraktioner visade att renat PCD minskade absorbansen vid 290 nanometer, vilket indikerar oxidation av PCA. Efter detta förfarande kan den renade PCD användas och optimeras i önskat syre rensningssystem.Detta kommer att avgöra den exakta mängden PCD som krävs för systemet. Denna teknik har använts för att förlänga fluorophore livstider i enmolekylmikroskopi experiment, vilket har gjort det möjligt för längre perioder av datainsamling. Den ultracentrifug som används är farlig.Var noga med att centrifuger är korrekt balanserade före spinning. Ethidiumbromid är ett farligt reagens. Undvik kontakt genom att bära personlig skyddsutrustning, och kassera den på lämpligt sätt.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, rening och kristallisation av den mänskliga Serotonin Transporter Bound till<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Expression, rening och antimikrobiell aktivitet av S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rening och beredning av TRPV1 för spektroskopisk analys

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Uttryck och rening av däggdjur Bestrophin jonkanaler

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Provtagning och förbehandling av tandemaljen karbonat för stabil kol och syre isotoper analys

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerob Protein rening och kinetiska analys via syre elektrod för att studera DesB dioxygenas aktivitet och hämning

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Mäta och tolka syre förbrukning helt flyga Head segment

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Uttryck och rening av den mänskliga Lipid-känsliga ering kanal TRPC3 för strukturella bestämning genom Single-particle kryo-elektronmikroskopi

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Uttryck, lösbarhet och rening av eukaryota Borat transportörer

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...