Name: expression and purification of nuclease-free oxygen scavenger protocatechuate 3,4-dioxygenase
Uploaded: 2019-11-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase at JoVE.com

Bu çalışma NIH GM121284 ve AI126742 tarafından KEY'e desteklenmiştir.

1. E. coli PCD ifade neden
<ol><li>Bir tüpte 1 μL pVP91A-pcaHG PCD ekspresyonu plazmid (20 ng/μL, Şekil 1A)ve 20 μL E.coli BL21 (20 μL ticari olarak kullanılabilen hücreler, > 2 x 106 cfu/μg plazmid) birleştirin. Karıştırmak için tüpü hafifçe çırpın. Tüpü buza 5 dk yerleştirin.</li>
	<li>Dönüşümü 30 s için 42 °C'ye yerleştirin. Sonra buz 2 dk.</li>
	<li>80 μL SOC media ekleyin (katabolit baskılı süper optimal ...

<ol>
	<li>Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+single+fluorescent+molecules.">Detection of single fluorescent molecules.</a> Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).</li><li>Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+reactive+oxygen+species+to+the+photobleaching+of+organic+fluorophores.">The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores.</a> Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).</li><li>Ha, T., Tinnefeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photophysics+of+fluorescent+probes+for+single-molecule+biophysics+and+super-resolution+imaging.">Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).</li><li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy:+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy.">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).</li><li>Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+species+formed+on+proteins+exposed+to+singlet+oxygen.">Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen.</a> Photochemical &#38; Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).</li><li>Sies, H., Menck, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Singlet+oxygen+induced+DNA+damage.">Singlet oxygen induced DNA damage.</a> Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).</li><li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments.">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li><li>Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+coupling+in+actomyosin+energy+transduction+studied+by+in+vitro+movement+assay.">Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay.</a> Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).</li><li>Shi, X., Lim, J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidification+of+the+oxygen+scavenging+system+in+single-molecule+fluorescence+studies:+in+situ+sensing+with+a+ratiometric+dual-emission+probe.">Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe.</a> Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).</li><li>Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+analyses+of+designed+and+selected+mutants+of+protocatechuate+3,4-dioxygenase1.">Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1.</a> Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).</li><li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems.">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li><li>Senavirathne, G., Lopez, M. A., Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+nuclease-free+protocatechuate+3,4-dioxygenase+for+prolonged+single-molecule+fluorescence+imaging.">Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging.</a> Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nature Communications. 7, 11409 (2016).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cascading+MutS+and+MutL+sliding+clamps+control+DNA+diffusion+to+activate+mismatch+repair.">Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair.</a> Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).</li></ol>

Oksijen atma sistemleri genellikle tek moleküllü floresan mikroskobu nda fotobeyaztma azaltmak için3,7,8dahildir. Bu mikroskopteknikleri genellikle nükleik asitler veya nükleik asitler 1 ,13,14ile protein etkileşimleri gözlemlemek için kullanılır. OSS'lerin nükleazlarla kirlenmesi sahte sonuçlara yol açabilir.
<p class=...

Tek moleküllü (SM) biyofizik, biyolojik fenomenlere bakış ını değiştiren hızla büyüyen bir alandır. Bu alan, fiziğin ve kimyanın temel kanunlarını biyolojiye bağlama yeteneğine sahiptir. Floresan mikroskopi SM duyarlılığı elde edebilirsiniz bir biyofiziksel yöntemdir. Floresan küçük organik floropores veya kuantum nokta 1 onları bağlayarak biyomolekülleri tespit etmek içinkullanılır. Bu moleküller geri dönüşümsüz2fotobeyazlatma önce lazerler tarafından heyecanlı fotonlar yontabilir. Fotobeyazrlama floresan etiketler istenilen dalga boyu2,3de heyecanlandırmak için yeteneklerini yok kimyasal hasar geçmesi oluşur. Sulu tampon reaktif oksijen türlerinin varlığı (ROS) fotobeyazrlama birincilnedeni 2,4. Ayrıca, ROS biyomoleküllere zarar verebilir ve SM deneylerinde hatalı gözlemlere yol açabilir5,6. Oksidatif hasarı önlemek için oksijen atma sistemleri (OSS)3,7,8kullanılabilir. Glikoz oksidaz/ katalaz (GODCAT) sistemi oksijen kaldırma da etkilidir8, ama ara olarak potansiyel olarak zararlı peroksitler üretir. Bunlar SM çalışmalarında ilgi biyomoleküllere zarar verebilir.
Alternatif olarak, protocatechuate 3,4 dioksijenaz (PCD) verimli bir substrat protocatechuic asit kullanarak sulu bir çözelti O2 kaldıracak (PCA)7,9. PCD, PCA'yı koordine etmek ve çözünmüş O210kullanarak kateşol halka açma reaksiyonunu katalize etmek için hemesiz demir kullanan bir metalloenzimdir. Bu bir adım reaksiyonS deneyleri florofor stabilitesini artırmak için genel olarak daha iyi bir OSS olduğu gösterilmiştir7. Ne yazık ki, PCD de dahil olmak üzere birçok ticari OSS enzimleri, kontamine nükleaz lar içerir11. Bu kirleticiler, SM deneylerinde kullanılan nükleik asit bazlı yüzeylerin zarar görmesine yol açabilir. Bu çalışma, SM sistemlerinde rekombinant PCD kullanımı için kromatografi tabanlı bir arıtma protokolü açıklayacaktır. PCD, ROS'un veri toplama için gereken yüzeylere zarar kaynağı olduğu tüm denemelere genel olarak uygulanabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>&#946;ME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, Glacial Certified ACS</td>
			<td>Fisherl Chemical</td>
			<td>A38C-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Granulated</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>DF0145-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA FPLC System</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC201024</td>
			<td>10 kDa MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F-2262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS) Tablets</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>K833-100TABS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0339-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>DF0123173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90004-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIS-TRIS propane,&#62;=99.0% (titration)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6755-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0472-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96&#8211;Well Flat&#8211;Bottom EIA Plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2240096EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>P212121</td>
			<td>SV-DTT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 500ML</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G37-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granulated LB Broth Miller</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>1.10285.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Res Standard Agarose</td>
			<td>AGTC Bioproducts</td>
			<td>AG500D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0250-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11017128001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from Chicken Egg White</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0288-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>P212121</td>
			<td>RP-S23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow (100 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novagen BL21 Competent Cells</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>69-449-3</td>
			<td>SOC media included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0-267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>P-020-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0754-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN15642110</td>
			<td>PCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>P212121</td>
			<td>CI-00270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M2 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devises</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane &#62; 250mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-741-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane &#62; 500mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-741-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 12 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17517301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0761-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Ultra Pure</td>
			<td>Gojira Fine Chemicals</td>
			<td>UTS1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure EDTA</td>
			<td>Invitrogen/Gibco</td>
			<td>15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208086</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression and purification of nuclease-free oxygen scavenger protocatechuate 3,4-dioxygenase

Tek moleküllü (SM) mikroskopi florofor etiketli biyomoleküllerin dinamik moleküler etkileşimlerinin gerçek zamanlı olarak incelenmesinde kullanılır. Ancak, floroforlar çözünmüş oksijen (O2)ile fotobeyazrlama yoluyla sinyal kaybına yatkındır. Fotobeyaztma önlemek ve florofor ömrünü uzatmak için, oksijen atma sistemleri (OSS) O2azaltmak için istihdam edilmektedir. Ticari olarak kullanılabilen OSS, nükleik asitlere zarar veren veya bozan nükleazlar tarafından kontamine olabilir, deneysel sonuçların şaşırtıcı yorumu. Burada, saptanabilir nükleaz kontaminasyonu olmayan son derece aktif Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioksijenaz (PCD) ifadesi ve saflaştırılması için bir protokol ayrıntılı. PCD verimli substrat protocatechuic asit dönüşüm tarafından reaktif O2 türler kaldırabilirsiniz (PCA) 3-karboksi-cis, cis-muconic asit. Bu yöntem, O2'nin veri toplamada zararlı bir rol oynadığı herhangi bir sulu sistemde kullanılabilir. Bu yöntem, ticari olarak mevcut PCD ile karşılaştırıldığında son derece aktif, çekirdeksiz PCD üretiminde etkilidir.

Ticari olarak mevcut oksijen çöpçü PCD sık sık bir DNA nükleaz ile kontamine olduğunu. Nükleaz aktivitesinin kontamine floresan çalışmalarda sahte sonuçlara yol açabilir, özellikle DNA veya DNA etkileşimproteinleri analiz çalışmalar. Biz rekombinant PCD bulduk, heksahistid etiketli pcaH ve pcaG heterodimer, E. coli ifade edilebilir (Şekil 1). Heterodimer ilk olarak nikel afinite kromatografisi ile saflaştırılır (Ş...

Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase at JoVE.com

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) enzimatik substrat protokatechuic asit kullanarak sulu bir sistemden serbest diatomik oksijen kaldırabilirsiniz (PCA). Bu protokol, bu oksijen atma enziminin ekspresyonu, saflaştırılması ve aktivite analizini açıklar.

Nükleazsız Oksijen Çöpçü Protocatechuate 3,4-Dioksijenaz İfadesi ve Saflaştırma

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Protokolümüz, sulu oksijenin kirletici olduğu herhangi bir çözeltide kullanılabilen saptanabilir nükleaziçermeyen son derece aktif PCD verir. Kullandığımız teknikleri çoğaltmak kolaydır ve üründe nükleaz kirletici maddelerin bulunmamasını sağlar. Başlamak için, pVP91A-pcaHG IFADE plazmid bir mikrolitre ve bir tüp ticari olarak kullanılabilir E.coli BL21 20 mikrolitre birleştirir.Karıştırmak için tüpü hafifçe çırpın ve tüpü beş dakika buza yerleştirin. Dönüşüm reaksiyonuna devam etmek için tüpü 42 derecede 30 saniye su banyosuna koyun, sonra iki dakika buza koyun. 80 mikrolitre SOC medya ekleyin ve bir saat boyunca 225 rpm ve 37 santigrat derecede sallayın.Daha sonra, bir LB-ampicillin agar üzerine dönüşüm reaksiyon karışımı dökün ve karışımı yaymak için bir tabak yayıcı kullanın. Bir kapak ile plaka kapağı ve 16 ila 18 saat boyunca 37 santigrat derece plaka kuluçka. Bundan sonra, plaka bir koloni seçin ve 250 mililitrelik Erlenmeyer şişesinde LB-ampisilin 50 mikrolitre aşılamak.16 ila 18 saat boyunca 37 santigrat derece kuluçka için 225 rpm bir shaker üzerinde şişe yerleştirin. Sonra, bir litre LB-ampisilin ile dolu dört litrelik bir şişeye kuluçka kültürünün 20 mililitresini aktarın. 37 santigrat derecede 225 rpm'de salla.Her saat, bir fotometre üzerinde 600 nanometre optik yoğunluğunu ölçmek için bir cuvette içine kültür bir mililitre çizin. Kültür optik yoğunluğu 0,5'e yaklaştıkça, OD600 0,5'e ulaşana kadar ölçüm sıklığını her 15 dakikada bir artırın. Sonra, dört litrelik şişeyi bir buz kutusuna aktarın.Kültür sıcaklığını azaltmak için şişeyi buz banyosunda döndürün. Dört litrelik şişeyi 17 santigrat derece ve 180 rpm'de bir kuvöze aktarın. OD600'ü her 20 dakikada bir izlemeye devam edin.0.7 OD600 anda, iptg ve amonyum demir sülfat heksahidrat stok çözeltileri litre başına 0,5 milimolar ve 10 miligram son konsantrasyonulaşmak için ekleyin, sırasıyla. 18 saat boyunca 180 rpm ve 17 santigrat derece de kültür shake. Kuluçkadan sonra, kültür şişesini iki dakika buza koyun.SDS-PAGE analizi için 1.5 mililitrelik polipropilen mikrosantrifüj tüp içinde indüklenen hücrelerin bir mililitre hasat. Sonra, santrifüj için şişeler, 500 mililitre her şişe içine bakteri kültürü dökün. Pelet kültürü 4 santigrat derece ve 3, 000 kez 20 dakika g.Süpernatantları decant. Pipet, her biri 12,5 mililitre soğuk PBS'de bulunan peletleri yeniden askıya almak ve her iki süspansiyonu 50 mililitrelik konik bir tüpte birleştirmek için. Daha önce olduğu gibi hücreleri tekrar pelet.Daha sonra, supernatants atın ve hücreleri yeniden askıya almak için her tüp içinde lysis tampon 10 mililitre eklemek için bir pipet kullanın. Tüpleri indüklenen hücrelerle sonicating sonra, önceden soğutulmuş polikarbonat şişe içine bakteriyel lizat dökün. 120, 000 kez g ve dört santigrat derece 60 dakika santrifüj ve soğuk bir 50 mililitrekonik tüp için supernatant dökün.FPLC cihazıni nikel yüklü reçine sütunu ile hazırladıktan sonra, numuneyi dakikada 0,15 mililitre lik kolona yükleyin. 20-milimolar imidazol de nikel tampon 20 mililitre ile sütun yıkayın. Analiz için 50 mililitrelik bir tüp içinde yıkama tutun.Daha sonra, 125 milimolar imidazol de nikel tampon 15 mililitre ile sütun yıkayın. Her biri 0,8 mililitre 19 kesirlerde elüsyonu toplayın. Sütunu %100 nikel tampon B'nin 15 mililitresiyle tekrar yıkayın ve her biri 0,2 mililitrelik ek 75 kesir toplayın.PCD varlığını doğrulamak için% 12 SDS-PAGE jelleri üzerinde toplanan kesirlerin analizi ile devam edin. İlk olarak, 1.5 mililitrelik polipropilen mikrosantrifüj tüpüne 35 mikrolitre reaksiyon tamponu ekleyin. Tüpte, pik kromatografi fraksiyonları beş mikrolitre ve üç kilobase çifti 500 nanogram supercoiled plazmid pXba birleştirir.Bir saat için 37 santigrat derece bir su banyosu tüp yerleştirin. El yazmasına göre agarose jel hazırladıktan sonra, jel kuyular içine her reaksiyon 30 mikrolitre ekleyin. Yaklaşık bir saat boyunca ortam sıcaklığında 10 volt santimetre de elektrofore.Turuncu G boyası jelin ucuna ulaştı. Hemen, jel ethidyum bromür sinyali görüntü için bir floresan tarayıcı kullanın. Yoğunluk ve görüntü piksel boyutu işlevi ile, çeşitli DNA türlerinin piksel hacmini belirleyin, örneğin süper kıvrılmış, doğrusal ve çentikli daireler.Her DNA türünün yüzdesini belirlemek için, tek bir DNA türünün piksel hacmini tüm tek tek türlerin toplam piksel hacmine bölün. SDS-PAGE analizi, ikinci elüsyon zirvesinin neredeyse saf PCD heterodimer ve tespit edilemeyen nükleaz aktivitesini en az temsil eden minimal protein kontaminasyonu içerdiğini göstermektedir. Böylece, daha fazla analiz için beş mililitrelik konik tüp ikinci PCD elution bu 10 fraksiyonları birleştirin.PCD boyut dışlama kromatografi saflaştırma sonra, dört derece santigrat soğuk odada, sodyum klorür, Tris hidroklorür, magnezyum klorür, dithiothreitol, PCA ve supercoiled plazmid pXba bir mikrosantrifüj tüp uygun hacimde bir araya 5X stok yapmak. Buz üzerine 96 kuyuluk düz taban plakası yerleştirin ve kombine 5X çözeltisinin 10 mikrolitresini kuyulara aktarın. Analizden hemen önce, her bir pcd SEC fraksiyonları her iyi 10 mikrolitre ekleyin.Plaka okuyucuyu 37 santigrat derecelik bir iç sıcaklığa ayarlayın ve 96 kuyulu plakayı plaka tutucuya aktarın. Plaka tutucuyu aletin içine geri alın ve 20 saniyelik aralıklarla 290 nanometrede bir saat boyunca emiciliği ölçün. Aleti her okumadan beş saniye önce plakayı sallamaya ayarlayın.Bir saat sonra, reaksiyonları sonlandırmak için her kuyuya 10 mikrolitre dur çözeltisi ekleyin. PCD SEC fraksiyonları için jel elektroforez gerçekleştirin. En fazla PCA oksidasyon aktivitesine sahip kesirleri seçin, azalmış absorbans ve gözlenen nükleaz kontaminasyonu ile gösterilir.Emiciliği 280 nanometre olarak ölçün ve emicilik ve yok olma katsayısına göre toplam PCD konsantrasyonu hesaplayın. Uzun süreli depolama için seçili kesirleri eksi 80 santigrat derecede saklayın. Bu deneyde, heksahistidin etiketli pcaH ve pcaG heterodimer rekombinant PCD, E.coli ifade bulunmuştur.Heterodimer ilk nikel afinite kromatografi silerek saflaştırılmıştı. Emicilik mavi ile gösterilir ve nikel tampon U'nun yüzde konsantrasyonu kırmızı renkte gösterilir. Akış, nikel rezorine bağlanmayan çözünür bakteriproteinlerini gösterir.Bazı PCD 125-milimolar imidazol varlığında eluted, ancak proteinçoğunluğu 250-milimolar imidazol eluted. Temsilci SDS-PAGE analizi, elüsyon adımındaki kesirlerin kirletici madde içermez. Nükleaz testinin Agarose jeli, ilave protein ve DNA nükleazı ile kontamine olmuş pozitif kontrol olmadan negatif kontrol ile karşılaştırılarak kontaminasyonu ortaya çıkarır.Agarose jel nükleaz testinde gözlenen çeşitli DNA türlerinin nicelliği, 29 ile 38 arasında kesirlerin, birleştirilmesi, konsantre edilmesi ve SEC tarafından daha da saflaştırılması için seçilen küçük nükleaz aktivitesine sahip olduğunu göstermektedir. Bu prosedürü takiben, saflaştırılmış PCD kullanılabilir ve istenilen oksijen atma sisteminde optimize.Bu, sistem için gereken TAM PCD miktarını belirler. Bu teknik, tek moleküllü mikroskopi deneylerinde florofor ömrünü uzatmak için kullanılmıştır, bu da daha uzun süre veri toplamasına olanak sağlamıştır. Kullanılan ultracentrifuge tehlikelidir.Dönmeden önce santrifüjlerin düzgün bir şekilde dengelendiğinden emin olun. Ethidium bromür tehlikeli bir reaktiftir. Kişisel koruyucu ekipman giyerek temastan kaçının ve uygun şekilde atın.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Termo, İfade, saflaştırılması, ve İnsan serotonin Transporter Kristalizasyon Bound<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

S100A12&#39;nin Ekspresyon, Saflaştırma ve Antimikrobiyal Aktivitesi

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

İfade ve arıtma memeli Bestrophin iyon kanalları

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Örnekleme ve diş minesini Önarıtma kararlı karbon ve oksijen izotop analizi için karbonat

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerobik Protein Saflaştırma ve DesB Dioxygenase etkinliği ve inhibisyon çalışmak için oksijen elektrodu ile kinetik Analizi

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Ölçme ve oksijen Tüketim oranları tamamen yorumlama kafa kesimleri sinek

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

İfade, Solubilization ve ökaryotik Bor taşıyıcılar arıtma

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...