Name: isolation of myoepithelial cells from adult murine lacrimal and submandibular glands
Uploaded: 2019-06-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands at JoVE.com

우리는 SMACreErt2 마우스 스트레인을 우리에 게 제공 하는 Dr. Ivo kalajzic 감사 합니다, 마우스 꼬리와 유전형에 대 한 마 누 즈 메,도 2에 대 한 전문적인 사진을 얻기 위한 마크 셸리. 우리는 또한 과학적인 영어 편집을 위한 과학 편집자와 마크 셸리의 스 크립 스 위원회 감사 합니다. 우리는 셀 선별 및 FACS 데이터 분석에 대 한 여러 토론/조언에 대 한 닥터 로빈 윌 렌에 도움을 위한 스 크립 스 연구 기관 유 세포 분석 코어에 감사 드립니다.

이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다, 국가 안과 연구소 보조금 5 R01 EY026202 및 1 R01 EY028983 H.P.M.

모든 동물 작업은 국립 건강 연구소 (NIH) 지침에 따라 진행 되었으며 스 크립 스 연구소의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었습니다. 생쥐의 수와 고통을 최소화 하기 위해 노력 했습니다. 모든 실험 동물은 수돗물에 대 한 무료 액세스와 표준 다이어트를 받았다.
참고: MEC 및 심 막 분리를 위한 주요 단계는 도 1A-1f에 개략적으로 설명 되?...

<ol>
	<li>Makarenkova, H. P., Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoepithelial+Cells:+Their+Origin+and+Function+in+Lacrimal+Gland+Morphogenesis,+Homeostasis,+and+Repair.">Myoepithelial Cells: Their Origin and Function in Lacrimal Gland Morphogenesis, Homeostasis, and Repair.</a> Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 115-123 (2015).</li><li>Haaksma, C. J., Schwartz, R. J., Tomasek, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoepithelial+cell+contraction+and+milk+ejection+are+impaired+in+mammary+glands+of+mice+lacking+smooth+muscle+alpha-actin.">Myoepithelial cell contraction and milk ejection are impaired in mammary glands of mice lacking smooth muscle alpha-actin.</a> Biology Of Reproduction. 85 (1), 13-21 (2011).</li><li>Siedlecki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+VEGF/PDGF+inhibition+using+axitinib+induces+alphaSMA+expression+and+a+pro-fibrotic+phenotype+in+human+pericytes.">Combined VEGF/PDGF inhibition using axitinib induces alphaSMA expression and a pro-fibrotic phenotype in human pericytes.</a> Graefe&#8217;s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. , (2018).</li><li>Fritz, M. E., LaVeau, P., Nahmias, A. J., Weigel, R. J., Lee, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cultures+of+feline+acinar+cells:+dissociation,+culturing,+and+viral+infection.">Primary cultures of feline acinar cells: dissociation, culturing, and viral infection.</a> American Journal of Physiology. 239 (4), G288-G294 (1980).</li><li>Hann, L. E., Tatro, J. B., Sullivan, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+function+of+lacrimal+gland+acinar+cells+in+primary+culture.">Morphology and function of lacrimal gland acinar cells in primary culture.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 30 (1), 145-158 (1989).</li><li>Cripps, M. M., Bromberg, B. B., Bennett, D. J., Welch, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+non-enzymatically+dissociated+lacrimal+gland+acini.">Structure and function of non-enzymatically dissociated lacrimal gland acini.</a> Current Eye Research. 10 (11), 1075-1080 (1991).</li><li>Zoukhri, D., Hodges, R. R., Rawe, I. M., Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++signaling+by+cholinergic+and+alpha1-adrenergic+agonists+is+up-regulated+in+lacrimal+and+submandibular+glands+in+a+murine+model+of+Sjogren's+syndrome.">Ca2+ signaling by cholinergic and alpha1-adrenergic agonists is up-regulated in lacrimal and submandibular glands in a murine model of Sjogren's syndrome.</a> Clinical Immunology and Immunopathology. 89 (2), 134-140 (1998).</li><li>Pringle, S., Nanduri, L. S., van der Zwaag, M., van Os, R., Coppes, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+salivary+gland+stem+cells.">Isolation of mouse salivary gland stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li><li>Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. 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D., Van Wart, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+individual+collagenases+from+Clostridium+histolyticum.">Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum.</a> Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).</li><li>Eckhard, U., Schonauer, E., Brandstetter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+activity+regulation+and+substrate+preference+of+clostridial+collagenases.">Structural basis for activity regulation and substrate preference of clostridial collagenases.</a> G, H, and T. Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20184-20194 (2013).</li><li>Breggia, A. C., Himmelfarb, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+renal+tubular+epithelial+cells+have+variable+injury+tolerance+to+ischemic+and+chemical+mediators+of+oxidative+stress.">Primary mouse renal tubular epithelial cells have variable injury tolerance to ischemic and chemical mediators of oxidative stress.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 1 (1), 33-38 (2008).</li><li>Mueller, S. O., Clark, J. A., Myers, P. H., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+gland+development+in+adult+mice+requires+epithelial+and+stromal+estrogen+receptor+alpha.">Mammary gland development in adult mice requires epithelial and stromal estrogen receptor alpha.</a> Endocrinology. 143 (6), 2357-2365 (2002).</li><li>Guthmiller, J. J., Zander, R. A., Butler, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+T+Cell+Response+to+Preerythrocytic+Vaccination+in+Mice.">Measurement of the T Cell Response to Preerythrocytic Vaccination in Mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1325, 19-37 (2015).</li><li>Seime, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+cell+labeling+and+lineage+tracking+during+fracture+repair.">Inducible cell labeling and lineage tracking during fracture repair.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 57 (1), 10-23 (2015).</li><li>Hawley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+and+CyTOF+immuno-profiling+of+regenerating+lacrimal+glands+identifies+a+novel+subset+of+cells+expressing+muscle-related+proteins.">RNA-Seq and CyTOF immuno-profiling of regenerating lacrimal glands identifies a novel subset of cells expressing muscle-related proteins.</a> PLoS One. 12 (6), e0179385 (2017).</li><li>Tata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoepithelial+Cells+of+Submucosal+Glands+Can+Function+as+Reserve+Stem+Cells+to+Regenerate+Airways+after+Injury.">Myoepithelial Cells of Submucosal Glands Can Function as Reserve Stem Cells to Regenerate Airways after Injury.</a> Cell Stem Cell. 22 (5), 668-683 (2018).</li><li>Song, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+scRNA-seq+Analysis+Reveals+Distinct+Cell+Populations+that+Contribute+to+Salivary+Gland+Development+and+Maintenance.">Genetic and scRNA-seq Analysis Reveals Distinct Cell Populations that Contribute to Salivary Gland Development and Maintenance.</a> Scientific Reports. 8 (1), 14043 (2018).</li><li>Knight, A. n. d. r. e. w. W., B, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+GFP+from+cellular+autofluorescence.">Distinguishing GFP from cellular autofluorescence.</a> Biophotonics International. 8 (7), 7 (2001).</li><li>Januszyk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+Effect+of+Cell+Culture+on+Gene+Expression+in+Primary+Tissue+Samples+Using+Microfluidic-Based+Single+Cell+Transcriptional+Analysis.">Evaluating the Effect of Cell Culture on Gene Expression in Primary Tissue Samples Using Microfluidic-Based Single Cell Transcriptional Analysis.</a> Microarrays (Basel). 4 (4), 540-550 (2015).</li></ol>

이 원고는 LG와 기관단총의 MEC 및 심 낭 분리의 프로토콜을 설명 했습니다. 이 절차는 SMA의 유전 라벨링, MECs 및 심 낭의 유일한 신뢰할 수 있는 바이오 마커를 기반으로 했습니다.
이 프로토콜을 개발 하는 긴급 한 뮤 린 LGs 및 SMGs에서 MECs의 고립을 강조 하는 문학의 거의 총 부재에 의해 동기 부여 했다. 유전 라벨링을 이전에 사용 했지만, SMA-GFP 쥐를 사용 하 여 젊은 3 주 된 LGs...

근 상피 세포 (MECs)는 눈물, 타 액, harderian, 땀, 전립선 및 유선을 포함 한 많은 외 분 비 동맥에 존재 합니다. MECs는 상피와 평활 근 표현 형을 결합 하는 독특한 세포 유형입니다. Mecs 익스프레스 α-평활 근 액 틴 (SMA) 및 수축 기능1,2를 갖는다. MECs 외에도 눈물 동맥 (LG)과 턱 밑 동맥 (기관단총)은 혈관 관의 표면을 감싸는 내 진 피 기원의 세포 인 심 낭 이라는 SMA + 혈관 세포를 포함 합니다. Mecs와 심 낭은 많은 마커를 표현 하지만, SMA는 다른 LG 및 기관단총 세포1,3에서 표현 되지 않는 유일한 마커 이다.
지난 40 년 이내에, 몇몇 실험실은 다른 외 분 비 동맥 조직의 해리에 대 한 분석을 보고,이는 비효소 및 효소 적 접근법을 적용 하였다. 1980에 발표 된 첫 번째 보고서 중 하나에서, 프리츠와 코 저자는 콜라 게 나아 제/트립 신 솔루션4에서 순차 소화를 사용 하 여 고양이를 분리 하는 프로토콜을 설명 했다. 1989에서, hann 및 공동 저자는 콜라 게 나 제, 히 알루로 니다 제 및 dnase5의 혼합물을 사용 하 여 LGs에서의 느리게만 격리를 위해이 프로토콜을 조정 하였다. 1990에서, cripps 및 동료는 눈물 샘의 느리게만6의 비 효소 적 해리의 방법을 간행 했습니다. 나중에 1998에서 주크 리와 공동 저자는 LG 및 서울시 고립 된 느리게만7에서의 Ca2 +이미징에 대 한 효소 해리 프로토콜을 반환 했습니다. 지난 10 년 내에 연구원 들은 외 분 비 땀 샘의 줄기/전구 세포의 분리에 초점을 돌렸다. Pringle 및 공동 저자는 마우스 기관단총 줄기 세포의 분리를 위한 2011의 프로토콜을 설명 했다8. 이 방법은 배양에서 유지 되었던 줄기 세포 함유 돌출 구의 분리를 기초로 하였다. 저자는 줄기 세포 관련 마커를 발현 하는 세포 증식이 살 리 구체8에서 분리 될 수 있다고 주장 했다. 샤 로스와 공동 저자는 손상 되지 않은 성인 쥐 LGs에서 효소 소화를 사용 하 고 "해방 된" 세포9를 수집 하는 전구 세포 분리에 대 한 프로토콜을 발표 했습니다. 나중에, 2015에서, Ackermann과 공동 저자는 추정 "뮤 린 눈물 동맥 줄기 세포" ("mLGSCs")를 여러 통로에 걸쳐 모노 층 문화로 전파할 수 있는 분리 하기 위해이 절차를 조정 했습니다. 그러나, 이전에 언급 한 절차의 아무도 분리 된 상피 세포의 세포질 특수형과 개별 인구를 구별 하기 위하여 허용 했습니다. 2016에서 그로 모 바와 코 저자는 FACS11을 사용 하 여 성인 뮤 린 LGS에서 LG 줄기/전구 세포를 분리 하는 절차를 발표 했습니다. 그러나이 프로토콜은 MECs를 격리 하기 위한 것이 아닙니다.
최근에, 우리는 3 주 된 SMA GFP 쥐12에서 sma + 세포를 분리할 수 있다는 것을 보여주었습니다. 그러나,이 시간에 우리는 SMA + 세포의 다른 인구를 분리 하지 않았습니다. 여기에서 우리는 성인 LGs와 SMGs에서 차별화 된 MECs와 심 낭을 직접 분리 하기 위한 새로운 절차를 수립 했습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td>SterilCard Baker</td>
			<td>19669.1</td>
			<td>Class II type A/B3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Disposable serological pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-910</td>
			<td>Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Disposable serological pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-908</td>
			<td>Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL High-clarity polypropylene conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Disposable serological pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-900</td>
			<td>Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL FACS round-bottom tubes</td>
			<td>Fisher Scientific, Falcon</td>
			<td>14-959-11A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL High-clarity polypropylene conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Appropriate filter and non-filter tips</td>
			<td>Any available</td>
			<td>Any available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>328468</td>
			<td>with BD Ultra-Fine needle &#189; mL 8 mm 31G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Syringes 10 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309604</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>118225</td>
			<td>Monoclonal Antibody (G8.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 1M solution</td>
			<td>BioVision</td>
			<td>B1010</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes 35 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td>Non-pyrogenic, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>Wortington</td>
			<td>LS004194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Any avaliable</td>
			<td>Any avaliable</td>
			<td>From grocery store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning cell strainer size 70 &#956;m</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS431751-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Stirrer PC-410D</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Item# UX-84302-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4693-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors, curved blunt</td>
			<td>McKesson Argent</td>
			<td>487350</td>
			<td>Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Akron Biotech, catalog number</td>
			<td>AK37778-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium &#8211; low glucose (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5546-500ML</td>
			<td>with 1000mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/F12 (DMEM/F12)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>DF-042-B</td>
			<td>without HEPES, L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easypet 3 pipette controller</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4430000018</td>
			<td>with 2 membrane filters 0.45 &#181;m, 0.1 &#8211; 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo version 10</td>
			<td>Any available</td>
			<td>Any available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence binocular microscope Axioplan2</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>ID# 094207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ghost Red 780 Viability Dye</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>13-0865-T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand tally counter</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HEA6594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Sigma Millipore</td>
			<td>H6648-500ML</td>
			<td>Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td>With calcium, magnesium, no phenol red.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td>02-671-51B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>Dilute 1/10 in ddH20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3007002E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid (HCl), 5N Volumetric Solution</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>5618-03</td>
			<td>To adjust Tris buffer pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>SKU#:</td>
			<td>Shaker; 37 &#176;C, 5% CO2 in air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors</td>
			<td>Aurora Surgical</td>
			<td>AS12-021</td>
			<td>Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Inhalation Anesthetic</td>
			<td>Southern Anesthesia Surgical (SAS)</td>
			<td>PIR001325-EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 1M solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63069-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>3451</td>
			<td>Clear, graduated, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Power Point</td>
			<td>Any available</td>
			<td>Any available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene 25 mm Syringe Filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>724-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 510 series Benchtop Meter</td>
			<td>Oakton</td>
			<td>SKU: BZA630092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure Ethanol 200 Proof</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cell lysis buffer 10x</td>
			<td>BioVision</td>
			<td>5831-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roto-torque Heavy Duty Rotator</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>MPN: 7637-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL</td>
			<td>Eppendorf Biopur</td>
			<td>22600044</td>
			<td>PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>375667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td>With Summit 6.3 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002441</td>
			<td>All centrifugation performed at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ID# 21550</td>
			<td>RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi SV6 stereo dissecting microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>455054SV6</td>
			<td>With transmitted light base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two Dumont tweezers #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500342</td>
			<td>11 cm, Straight, 0.1 x 0.06 mm tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Any available</td>
			<td>Any available</td>
			<td>With transmitted light base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration systems, standard line</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable volume micropipettes</td>
			<td>Any available</td>
			<td>Any available</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of myoepithelial cells from adult murine lacrimal and submandibular glands

눈물 샘 (LG)은 인 열 막의 수성 층을 은닉 하는 외 각 성 tubuloacinar 동맥입니다. LG 상피 나무는 포상, ductal 상피 및 근 상피 세포 (MECs)로 구성 됩니다. MECs 익스프레스 알파 평활 근 액 틴 (α Sma)와 수축 기능을가지고 있습니다. 그들은 여러 선상 기관에서 발견 되 고 외 배 엽 기원입니다. 또한, LG에는 혈관 관의 표면을 감싸는 수축 세포 인 내 진 피 기원의 SMA + 혈관 평활 근 세포가 포함 되어 있습니다. 새로운 프로토콜을 통해 우리는 성인 뮤 린 LGs 및 턱 밑 샘 (SMGs)에서 MECs와 심 낭을 모두 분리할 수 있습니다. 이 프로토콜은 SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl 마우스 스트레인을 사용 하 여 mecs 및 심 낭의 유전 적 라벨링을 기반으로 하며, 형광 활성 세포 선별을 위한 LG 단일 세포 현 탁 액의 준비를 따른다 (FACS ). 이 프로토콜은 흉 막이 EpCAM을 표현 하지 않는 반면에, MECs에의 한 상피 세포 부착 분자 (EpCAM)의 발현에 기초한 상이한 기원의 이들 두 세포 집단의 분리를 허용 한다. 고립 된 세포는 세포 배양 또는 유전자 발현 분석에 사용 될 수 있었다.

SMA + MECs 및 연골을 분리 하는 마우스 모델 확립 된 프로토콜은 LGs와 SMGs에서 MECs와 심 낭의 두 가지 순수한 인구를 분리 하는 것을 허용 합니다 ( 표 1참조). 이 두 종류의 세포는 다른 크기와 모양을가지고 있습니다. 미세 혈관은 모세 혈관의 벽 주위에 개발 (도 5a) 및 MECS LG 분 비 acini 둘러싸고 있는 동안 제곱 모양 (그림<stro...

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Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands

성인 뮤 린 눈물과 턱 밑 동맥에서 Myoepithelial 세포의 고립

눈물 샘 (LG)에는 α-평활 근 액 틴를 발현 하는 두 가지 세포 유형 (α Sma)이 있습니다. MECs는 많은 선 조직에서 발견 되는 외 배 엽 기원 이며, 심 낭은 내 배 엽 기원의 혈관 평활 근 세포입니다. 이 프로토콜 뮤 린 LGs에서 MECs 및 심 낭을 분리 합니다.

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ...

이 프로토콜은 두 개의 부드러운 근육 세포주, 근피세포 및 구막세포의 분리 및 분리를 허용하기 때문에 중요합니다. 이 방법은 세포 표면 마커를 통해 매끄러운 근육 세포의 유전 라벨링을 결합하여 심근 세포 및 복막세포의 인구를 정화합니다. 이 프로토콜은 건강하고 병이 있는 심근 세포의 기능 및 재생 능력을 비교하고 유전자 발현 연구를 위해 이러한 세포를 처리할 수 있게 합니다.근피성 세포는 유방, 타액 및 췌장과 같은 다른 외신 동맥에 존재하며, 이 프로토콜은 다른 조직에서 심근피성 세포 및 pericytes의 격리에 의해 적응될 수 있습니다. 알파 부드러운 근육 액틴 또는 SMA 발현 세포를 레이블을 지정하려면, 2일 동안 하루에 한 번 체중20그램당 100마이크로리터의 타목시펜을 가진 3~4주 된 타목시펜 유도 알파 SMA 구동 기자 마우스를 주입하십시오. 마지막 주사 후 2~3일 후에 는 핀셋을 사용하여 한 글선을 부드럽게 당기는 동시에 작은 가위 한 쌍의 날카로운 끝으로 선 주위의 결합 조직을 긁어 내어 선통을 풀어주세요.라크라이말과 파로티드 땀샘이 분리되었을 때, 가위를 사용하여 라크라이피선을 자르고 땀샘을 얼음 위에 차가운 PBS 2 밀리리터가 있는 35mm 접시에 넣습니다. 해부 현미경 아래에 접시를 놓고 주변 지방 및 결합 조직을 다듬습니다. 그런 다음 두 개의 집게로 라크라이피 선 캡슐을 제거합니다.모든 땀샘이 수확되었을 때, 형광 현미경의 밑에 조직의 작은 조각을 확인하여 세포 라벨링을 확인하십시오. 단일 셀 서스펜션을 준비하려면 모든 라크라이피 땀샘을 0.5 밀리리터의 실온 소화 매체를 포함하는 35mm 접시로 옮기고 작은 가위를 사용하여 땀샘을 0.2 내지 1 마이크로미터 평방 조각으로 다진다. 넓은 보어 파이펫 필터 팁을 사용하여 다진 조직을 2밀리리터 라운드 하단 튜브로 옮기고 튜브의 부피를 소화 배지로 두 밀리리터로 가져옵니다.튜브를 혼합하여 반전시키고 튜브를 분당 100~120회전에서 90분 동안 37도 의 섭씨 흔들림 인큐베이터에 넣습니다. 30분마다 1000 마이크로리터 필터 팁을 사용하여 20~30회 글리드 조각을 천천히 세배로 세려줍니다. 각 트리튜션의 끝에서, 클러스터에 대한 현미경으로 10 마이크로 리터 알리쿼트검사.90분 후 인슐린 주사기 바늘을 통해 샘플을 2~3회 전달하여 세포를 현탁액으로 방출하고 세포 용액을 15 밀리리터 튜브로 이송한다. 블로킹 미디엄 타입 1을 총 5밀리리터에 추가하고 반전으로 튜브를 2~3회 혼합합니다. 70 마이크로미터 세포 여과기를 통해 50 밀리리터 튜브로 세포를 통과하고, 필터를 통해 세포를 한 번 더 긴장하기 전에 차단 중간 유형 1의 1 밀리리터로 여과기를 세척합니다.다음으로 원심분리에 의해 세포를 수집하고 차단 중간 유형 2의 두 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 세포를 2밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮기고 원심분리에 의해 세포를 수집한다. Accutase 용액의 1 밀리리터에서 세포를 섭씨 37도에서 2~3분 동안, 분당 100~120회 회전으로 세포를 재연합니다.인큐베이션이 끝나면 세포를 50 밀리리터 튜브로 옮기고 차단 중간 유형 1의 최대 10 밀리리터를 추가합니다. 원심분리 후 실온에서 30분 동안 회복 배지의 6밀리리터에서 세포를 재연한다. 인큐베이션이 끝나면 현미경으로 10개의 미세리터 샘플을 확인하여 완전한 세포 해리를 보장합니다.계산 후 원심 분리로 세포를 수집합니다. 형광 활성화 셀 선별, 또는 FACS에 대한 세포를 염색하려면, FACS 버퍼의 400 마이크로 리터를 포함하는 2 밀리리터 튜브 당 5 개의 세포에 최대 5 배 10을 추가하고 화려한 바이올렛 421 안티 마우스 CD326 및 유령 레드 780 생존 성 염료의 마이크로 리터 5 개를 추가합니다. 철저한 혼합 후 튜브를 45분간 호일로 감싸고 섭씨 4도에서 회전시 사용하세요.인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 세포를 수집하고 샘플 당 FACS 버퍼의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단. 세포 샘플을 얼음에 있는 개별 5밀리리터 FACS 튜브로 옮기고 단일 색상 컨트롤을 사용하여 보상을 조정합니다. 그런 다음 100 마이크로 미터 노즐을 통해 평방 인치 당 20 파운드에서 세포를 정렬합니다.미세 혈관 회분은 모세 혈관의 벽 주위에 개발하고 사각형 모양을 보여줍니다. 근피성 세포는 라크라이피 분비 아시니를 둘러싸고, 긴 과정을 가지고, 상대적으로 넓은 영역을 차지한다. 여기서, 형광 활성화 세포 분류를 준비하기 위해 라크라이피선으로부터 해리된 세포가 방금 입증된 바와 같이, 나타난다.심근 세포및 회신세포의 유동 세포학적 분류를 위해 세포는 먼저 어떤 이중을 제외하기 전에 그들의 전진 및 측면 분산 영역에 의해 게이트되어야 한다. 죽은 세포를 배제하기 위해 게이팅 후, 제어 샘플은 배경 노이즈를 결정하고 신호 사이의 최적의 분리에 대한 적절한 보상을 설정하는 데 사용됩니다. 프로토콜에 설명된 바와 같이 땀샘과 소화 중간 부피의 수를 유지하고 모든 단계에서 조직 소화의 효율을 확인하는 것을 기억하십시오.상기 분리된 세포는 생체내/체외 실험을 포함하는 다중 다운스트림 적용, 예를 들어 세포 배양, 이식, 메타볼로믹스, 프로테오믹스 및 단세포 분석에 사용될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

Murine 난황과 AGM에서 조기 조혈 줄기 세포의 분리

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These ...

연구

생물학

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

사람의 피부에서 성인 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

성인 골격근의 개인 Myofibers 및 위성 세포의 분리와 문화

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

인간의 기본 섬유 아세포 배양에서 순진 성인 줄기 세포 분리

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

성인 마우스 앞니의 치아 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

쥐과 밸브 내피 세포의 분리

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

쥐의 눈물샘을 조작

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

성인 쥐 심장에서 고품질 Cardiomyocytes, 내피 세포 및 섬유 아세포의 동시 격리

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

Submucosa 및 성인 마우스의 Lamina Propria 장의 Glial 세포의 고립

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...