Name: isolation of myoepithelial cells from adult murine lacrimal and submandibular glands
Uploaded: 2019-06-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands at JoVE.com

Vi tackar Dr Ivo Kalajzic för att ge oss med SMACreErt2 mus stam, Takeshi umazume för mus tailing och genotypning, mark Shelley för att förvärva professionella bilder för figur 2. Vi tackar också Scripps råd för vetenskapliga redaktörer och mark Shelley för vetenskaplig engelska redigering. Vi är tacksamma för The Scripps Research Institute Flow Cytometry kärna för hjälp med cell sortering och Dr Robin Willenbring för flera diskussioner/råd om FACS data analys.

Detta arbete stöddes av nationella institut för hälsa, nationella ögon Institute Grants 5 r01 EY026202 och 1 r01 EY028983 till H.P.M.

Allt djur arbete utfördes enligt National Institute of Health (NIH) rikt linjer och godkändes av institutionell djur vård och användning kommittén av Scripps Research Institute. Alla ansträngningar gjordes för att minimera antalet möss och deras lidande. Alla försöks djur fick en standard diet med fri till gång till kran vatten.
Anmärkning: De viktigaste stegen för MEC och pericytbiologi isolering beskrivs schematiskt i figur 1a-F. Alla reagenser ...

<ol>
	<li>Makarenkova, H. P., Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoepithelial+Cells:+Their+Origin+and+Function+in+Lacrimal+Gland+Morphogenesis,+Homeostasis,+and+Repair.">Myoepithelial Cells: Their Origin and Function in Lacrimal Gland Morphogenesis, Homeostasis, and Repair.</a> Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 115-123 (2015).</li><li>Haaksma, C. J., Schwartz, R. J., Tomasek, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoepithelial+cell+contraction+and+milk+ejection+are+impaired+in+mammary+glands+of+mice+lacking+smooth+muscle+alpha-actin.">Myoepithelial cell contraction and milk ejection are impaired in mammary glands of mice lacking smooth muscle alpha-actin.</a> Biology Of Reproduction. 85 (1), 13-21 (2011).</li><li>Siedlecki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+VEGF/PDGF+inhibition+using+axitinib+induces+alphaSMA+expression+and+a+pro-fibrotic+phenotype+in+human+pericytes.">Combined VEGF/PDGF inhibition using axitinib induces alphaSMA expression and a pro-fibrotic phenotype in human pericytes.</a> Graefe&#8217;s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. , (2018).</li><li>Fritz, M. E., LaVeau, P., Nahmias, A. J., Weigel, R. J., Lee, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cultures+of+feline+acinar+cells:+dissociation,+culturing,+and+viral+infection.">Primary cultures of feline acinar cells: dissociation, culturing, and viral infection.</a> American Journal of Physiology. 239 (4), G288-G294 (1980).</li><li>Hann, L. E., Tatro, J. B., Sullivan, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+function+of+lacrimal+gland+acinar+cells+in+primary+culture.">Morphology and function of lacrimal gland acinar cells in primary culture.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 30 (1), 145-158 (1989).</li><li>Cripps, M. M., Bromberg, B. B., Bennett, D. J., Welch, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+non-enzymatically+dissociated+lacrimal+gland+acini.">Structure and function of non-enzymatically dissociated lacrimal gland acini.</a> Current Eye Research. 10 (11), 1075-1080 (1991).</li><li>Zoukhri, D., Hodges, R. R., Rawe, I. M., Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++signaling+by+cholinergic+and+alpha1-adrenergic+agonists+is+up-regulated+in+lacrimal+and+submandibular+glands+in+a+murine+model+of+Sjogren's+syndrome.">Ca2+ signaling by cholinergic and alpha1-adrenergic agonists is up-regulated in lacrimal and submandibular glands in a murine model of Sjogren's syndrome.</a> Clinical Immunology and Immunopathology. 89 (2), 134-140 (1998).</li><li>Pringle, S., Nanduri, L. S., van der Zwaag, M., van Os, R., Coppes, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+salivary+gland+stem+cells.">Isolation of mouse salivary gland stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li><li>Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+progenitor+cells+in+uninjured,+adult+rat+lacrimal+gland.">Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).</li><li>Ackermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Investigation+of+Presumptive+Murine+Lacrimal+Gland+Stem+Cells.">Isolation and Investigation of Presumptive Murine Lacrimal Gland Stem Cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).</li><li>Gromova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lacrimal+Gland+Repair+Using+Progenitor+Cells.">Lacrimal Gland Repair Using Progenitor Cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2017).</li><li>Hawley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoepithelial+cell-driven+acini+contraction+in+response+to+oxytocin+receptor+stimulation+is+impaired+in+lacrimal+glands+of+Sjogren's+syndrome+animal+models.">Myoepithelial cell-driven acini contraction in response to oxytocin receptor stimulation is impaired in lacrimal glands of Sjogren's syndrome animal models.</a> Scientific Reports. 8 (1), 9919 (2018).</li><li>Matic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quiescent+Bone+Lining+Cells+Are+a+Major+Source+of+Osteoblasts+During+Adulthood.">Quiescent Bone Lining Cells Are a Major Source of Osteoblasts During Adulthood.</a> Stem Cells. 34 (12), 2930-2942 (2016).</li><li>Bond, M. D., Van Wart, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+individual+collagenases+from+Clostridium+histolyticum.">Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum.</a> Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).</li><li>Eckhard, U., Schonauer, E., Brandstetter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+activity+regulation+and+substrate+preference+of+clostridial+collagenases.">Structural basis for activity regulation and substrate preference of clostridial collagenases.</a> G, H, and T. Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20184-20194 (2013).</li><li>Breggia, A. C., Himmelfarb, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+renal+tubular+epithelial+cells+have+variable+injury+tolerance+to+ischemic+and+chemical+mediators+of+oxidative+stress.">Primary mouse renal tubular epithelial cells have variable injury tolerance to ischemic and chemical mediators of oxidative stress.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 1 (1), 33-38 (2008).</li><li>Mueller, S. O., Clark, J. A., Myers, P. H., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+gland+development+in+adult+mice+requires+epithelial+and+stromal+estrogen+receptor+alpha.">Mammary gland development in adult mice requires epithelial and stromal estrogen receptor alpha.</a> Endocrinology. 143 (6), 2357-2365 (2002).</li><li>Guthmiller, J. J., Zander, R. A., Butler, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+T+Cell+Response+to+Preerythrocytic+Vaccination+in+Mice.">Measurement of the T Cell Response to Preerythrocytic Vaccination in Mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1325, 19-37 (2015).</li><li>Seime, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+cell+labeling+and+lineage+tracking+during+fracture+repair.">Inducible cell labeling and lineage tracking during fracture repair.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 57 (1), 10-23 (2015).</li><li>Hawley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+and+CyTOF+immuno-profiling+of+regenerating+lacrimal+glands+identifies+a+novel+subset+of+cells+expressing+muscle-related+proteins.">RNA-Seq and CyTOF immuno-profiling of regenerating lacrimal glands identifies a novel subset of cells expressing muscle-related proteins.</a> PLoS One. 12 (6), e0179385 (2017).</li><li>Tata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoepithelial+Cells+of+Submucosal+Glands+Can+Function+as+Reserve+Stem+Cells+to+Regenerate+Airways+after+Injury.">Myoepithelial Cells of Submucosal Glands Can Function as Reserve Stem Cells to Regenerate Airways after Injury.</a> Cell Stem Cell. 22 (5), 668-683 (2018).</li><li>Song, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+scRNA-seq+Analysis+Reveals+Distinct+Cell+Populations+that+Contribute+to+Salivary+Gland+Development+and+Maintenance.">Genetic and scRNA-seq Analysis Reveals Distinct Cell Populations that Contribute to Salivary Gland Development and Maintenance.</a> Scientific Reports. 8 (1), 14043 (2018).</li><li>Knight, A. n. d. r. e. w. W., B, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+GFP+from+cellular+autofluorescence.">Distinguishing GFP from cellular autofluorescence.</a> Biophotonics International. 8 (7), 7 (2001).</li><li>Januszyk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+Effect+of+Cell+Culture+on+Gene+Expression+in+Primary+Tissue+Samples+Using+Microfluidic-Based+Single+Cell+Transcriptional+Analysis.">Evaluating the Effect of Cell Culture on Gene Expression in Primary Tissue Samples Using Microfluidic-Based Single Cell Transcriptional Analysis.</a> Microarrays (Basel). 4 (4), 540-550 (2015).</li></ol>

Detta manuskript beskrev ett protokoll över MEC och pericytbiologi isolering från LG och SMG. Detta förfarande baserades på genetisk märkning av SMA, den enda pålitliga bio markör av mecs och pericyter.
Brådskan att utveckla detta protokoll motiverades av den nästan totala frånvaron av litteratur som belyser isoleringen av MECs från murina LGs och SMGs. Även genetisk märkning användes tidigare, med hjälp av SMA-GFP möss för att isolera SMA + celler från unga tre-veckors-gamla...

Myoepithelial celler (MECs) finns i många exokrin körtlar inklusive lacrimal, salivary, harderian, svett, prostata, och bröst. MECs är en unik cell typ som kombinerar en epitelial och en smidig muskel fenotyp. Mecs Express α-Smooth muskelaktin (SMA) och har en kontraktila funktion1,2. Förutom MECs, den lacrimal körtel (LG) och submandibular körtel (SMG) innehåller SMA + vaskulära celler som kallas pericyter, som är celler av endodermala ursprung som omger ytan av vaskulära rör3. Även om mecs och pericyter uttrycker många markörer, är SMA den enda markör som inte uttrycks i andra LG och SMG-celler1,3.
Inom de senaste 40 åren, flera laboratorier rapporterade analyser för dissociation av olika exokrin körtel vävnader, där icke-enzymatiska och enzymatiska metoder tillämpades. I en av de första rapporter som publicerades i 1980, Fritz och medförfattare beskrev ett protokoll för att isolera felint parotis vindruvor med sekventiell mat smältning i en kollagenas/trypsin lösning4. I 1989, hann och medförfattare justerade detta protokoll för vindruvor isolering från råtta LGs med en blandning av kollagenas, hyaluronidas och DNase5. I 1990, Cripps och kollegor publicerade metoden för icke-enzymatisk dissociation av lacrimal körtel vindruvor6. Senare, i 1998, zoukhri och medförfattare återvände till en enzymatisk dissociation protokoll för att följa upp ca2 +-Imaging på LG och SMG isolerade vindruvor7. Inom det senaste decenniet har forskarna vänt sitt fokus på isolering av stamceller från exokrin körtlar. Pringle och medförfattare beskrev ett protokoll i 2011 för isolering av mus SMG stamceller8. Denna metod baserades på isolering av stamcells-innehållande salispheres, som bibehölls i kultur. Författarna hävdade att prolifererande celler uttrycker stamcells-associerade markörer kan isoleras från dessa salispheres8. Shatos och medförfattare publicerade protokollet för stamcells isolering från oskadade vuxna råtta LGs med enzymatisk mat smältning och samla "befriade" celler9. Senare i 2015, Ackermann och medförfattare justerade detta förfarande för att isolera presumtiva "murina lacrimal körtel stamceller" ("mLGSCs") som kan spridas som en mono-Layer kultur över flera passager10. Emellertid, ingen av de tidigare nämnda förfaranden som tillåts för att särskilja cellulära subtyper och enskilda populationer av isolerade epitelceller. I 2016, Gromova och medförfattare publicerade ett förfarande för isolering av LG stam/stamceller från vuxna murina LGs använder FACS11. Detta protokoll var dock inte avsett att isolera MECs.
Nyligen har vi visat att vi kan isolera SMA + celler från 3 vecka gamla SMA-GFP möss12. Men vid denna tid har vi inte separerat olika populationer av SMA + celler. Här har vi etablerat ett nytt förfarande för direkt isolering av differentierade MECs och pericyter från vuxna LGs och SMGs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td>SterilCard Baker</td>
			<td>19669.1</td>
			<td>Class II type A/B3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Disposable serological pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-910</td>
			<td>Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Disposable serological pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-908</td>
			<td>Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL High-clarity polypropylene conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Disposable serological pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-900</td>
			<td>Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL FACS round-bottom tubes</td>
			<td>Fisher Scientific, Falcon</td>
			<td>14-959-11A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL High-clarity polypropylene conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Appropriate filter and non-filter tips</td>
			<td>Any available</td>
			<td>Any available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>328468</td>
			<td>with BD Ultra-Fine needle &#189; mL 8 mm 31G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Syringes 10 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309604</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>118225</td>
			<td>Monoclonal Antibody (G8.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 1M solution</td>
			<td>BioVision</td>
			<td>B1010</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes 35 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td>Non-pyrogenic, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>Wortington</td>
			<td>LS004194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Any avaliable</td>
			<td>Any avaliable</td>
			<td>From grocery store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning cell strainer size 70 &#956;m</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS431751-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Stirrer PC-410D</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Item# UX-84302-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4693-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors, curved blunt</td>
			<td>McKesson Argent</td>
			<td>487350</td>
			<td>Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Akron Biotech, catalog number</td>
			<td>AK37778-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium &#8211; low glucose (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5546-500ML</td>
			<td>with 1000mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/F12 (DMEM/F12)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>DF-042-B</td>
			<td>without HEPES, L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easypet 3 pipette controller</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4430000018</td>
			<td>with 2 membrane filters 0.45 &#181;m, 0.1 &#8211; 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo version 10</td>
			<td>Any available</td>
			<td>Any available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence binocular microscope Axioplan2</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>ID# 094207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ghost Red 780 Viability Dye</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>13-0865-T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand tally counter</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HEA6594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Sigma Millipore</td>
			<td>H6648-500ML</td>
			<td>Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td>With calcium, magnesium, no phenol red.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td>02-671-51B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>Dilute 1/10 in ddH20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3007002E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid (HCl), 5N Volumetric Solution</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>5618-03</td>
			<td>To adjust Tris buffer pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>SKU#:</td>
			<td>Shaker; 37 &#176;C, 5% CO2 in air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors</td>
			<td>Aurora Surgical</td>
			<td>AS12-021</td>
			<td>Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Inhalation Anesthetic</td>
			<td>Southern Anesthesia Surgical (SAS)</td>
			<td>PIR001325-EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 1M solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63069-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>3451</td>
			<td>Clear, graduated, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Power Point</td>
			<td>Any available</td>
			<td>Any available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene 25 mm Syringe Filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>724-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 510 series Benchtop Meter</td>
			<td>Oakton</td>
			<td>SKU: BZA630092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure Ethanol 200 Proof</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cell lysis buffer 10x</td>
			<td>BioVision</td>
			<td>5831-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roto-torque Heavy Duty Rotator</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>MPN: 7637-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL</td>
			<td>Eppendorf Biopur</td>
			<td>22600044</td>
			<td>PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>375667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td>With Summit 6.3 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002441</td>
			<td>All centrifugation performed at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ID# 21550</td>
			<td>RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi SV6 stereo dissecting microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>455054SV6</td>
			<td>With transmitted light base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two Dumont tweezers #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500342</td>
			<td>11 cm, Straight, 0.1 x 0.06 mm tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Any available</td>
			<td>Any available</td>
			<td>With transmitted light base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration systems, standard line</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable volume micropipettes</td>
			<td>Any available</td>
			<td>Any available</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of myoepithelial cells from adult murine lacrimal and submandibular glands

Den lacrimal körtel (LG) är en exokrin tubuloacinar körtel som utsöndrar ett vattenhaltigt skikt av tår film. Den LG epitelceller träd består av acinar, duktal epitelial, och myoepithelial celler (mecs). MECs Express alfa glatt muskelaktin (αSMA) och har en kontraktila funktion. De finns i flera körtel organ och är av ektodermal ursprung. Dessutom innehåller LG SMA + vaskulär glatt muskel celler av endodermala ursprung kallas pericyter: kontraktila celler som omger ytan av vaskulära rör. Ett nytt protokoll tillåter oss att isolera både MECs och pericyter från vuxna murina LGs och submandibular körtlar (SMGs). Protokollet är baserat på genetisk märkning av MECs och pericyter med hjälp av SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl mus stam, följt av beredning av LG Single-cell SUS pension för fluorescens AKTIVE rad cell sortering (FACS ). Protokollet tillåter separation av dessa två cell populationer av olika ursprung baserat på uttrycket av epitelial cell adhesionsmolekylen (EpCAM) av MECs, medan pericyter inte uttrycker EpCAM. Isolerade celler kan användas för cell odling eller gen uttrycks analys.

Mus modell för att isolera SMA + MECs och pericyter Det etablerade protokollet möjliggör isolering av två rena populationer: MECs och pericyter från LGs och SMGs (se tabell 1). Dessa två typer av celler har en annan storlek och utseende. Microvascular pericyter, utvecklas runt väggarna i kapillärer (figur 5a) och har en fyrkantig form (Figur 5b), medan mecs omger LG sekretoriska acini,...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands at JoVE.com

Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands

Isolering av Myoepithelial celler från Adult murine lacrimal och submandibular körtlar

Den lacrimal körtel (LG) har två cell typer som uttrycker α-Smooth muskelaktin (αSMA): myoepitelceller (MECs) och pericyter. MECs är av ektodermal ursprung, finns i många körtel vävnader, medan pericyter är vaskulär glatt muskel celler av endodermala ursprung. Detta protokoll isolerar MECs och pericyter från murina LGs.

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ...

Detta protokoll är betydande eftersom det gör att separation och isolering av två glatt muskulatur cellinjer, de myoepithelial celler och pericyter. Denna metod kombinerar genetisk märkning av glatta muskelceller via cellytan markörer för att rena populationer av myoepithelial celler och pericyter. Detta protokoll tillåter jämförelse funktionen och regenerativ förmågor av friska och sjuka myoepithelial celler och bearbetning av dessa celler för genuttryck studier.Myoepithelial celler finns i andra exokrina körtlar såsom bröst, salivary, och bukspottkörtel, som gör att detta protokoll som skall anpassas genom isolering av myoepithelial celler och pericyter från någon annan vävnad. För att märka alfa glatt muskulatur aktin eller SMA uttrycker celler, injicera tre till fyra veckor gamla tamoxifen-inducerbara alpha SMA driven reporter möss med 100 mikroliter av tamoxifen per 20 gram kroppsvikt intraperitoneally en gång om dagen i två dagar. För lacrymal körtel insamling, två till tre dagar efter den sista injektionen, använd pincett för att försiktigt dra en körtel samtidigt repa bindväv runt körteln med den skarpa spetsen av en par små saxar för att frigöra körteln.När lacrymal och parotid körtlar har separerats, använd sax för att skära lacrymal körtel ut och placera körtlar i en 35 millimeters skålen med två milliliter av kall PBS på is. Placera skålen under en dissekera mikroskop och trimma omgivande fett och bindväv. Ta sedan bort lacrymal körtel kapseln med två tlys.När alla körtlar har skördats, kontrollera en liten bit vävnad under ett fluorescerande mikroskop för att bekräfta cellmärkning. För att förbereda en encellig suspension, överför alla lacrymal körtlar till en 35 millimeter skål som innehåller 0,5 milliliter av rumstemperatur matsmältningen medium och använda små saxar för att färs körtlar i 0,2 till en mikrometer kvadrat bitar. Med hjälp av en bred bore pipett filter spets överföra den malda vävnaden i en två milliliter rund-botten rör och föra volymen i röret till två milliliter med matsmältningsmedium.Invertera röret för att blanda, och placera röret i en 37 graders celsius skakinkubator i 90 minuter vid 100 till 120 rotationer per minut. Varje 30 minuter triturate långsamt körteln bitar 20 till 30 gånger med 1000 microliter filter tips med en minskande bore storlek. I slutet av varje trituration, inspektera en 10 microliter alikvot under ett mikroskop för kluster.Efter 90 minuter passera provet två till tre gånger genom en insulinspruta nål för att ytterligare släppa cellerna i suspension och överföra celllösningen till en 15 milliliter tub. Lägg till Blocking Medium Type 1 till totalt fem milliliter och blanda röret två till tre gånger genom inversion. För cellerna genom en 70 mikrometercellsil i ett 50 milliliterrör och tvätta silen med en milliliter blocking medium type 1, innan cellerna silas genom filtret en gång till.Nästa samla cellerna genom centrifugeringen och resuspend pelleten i två milliliter av blockering Blockering Medium Typ 2. Överför cellerna till ett två milliliter mikrocentrifugrör och samla in cellerna genom centrifugering. Resuspend cellerna i en milliliter Accutase lösning för en två till tre minuters inkubation vid 37 grader celsius och 100 till 120 rotationer per minut.I slutet av inkubationen överför du cellerna till ett 50 milliliterrör och lägger till upp till 10 milliliter Blocking Medium Type 1. Efter centrifugering resuspend cellerna i sex milliliter av återhämtning medium för en 30 minuters inkubation vid rumstemperatur. Kontrollera i slutet av inkubationen ett 10 mikroliterprov under mikroskopet för att säkerställa fullständig cellsupplösning.Efter räkning, samla cellerna genom centrifugering. För att färga cellerna för Fluorescence-aktiverad Cell Sortering, eller FACS, lägga till upp till fem gånger 10 till de fem cellerna per två milliliter rör som innehåller 400 mikroliter av FACS buffert och lägga till fem mikroliter av Brilliant Violet 421 anti mus CD326 och 0,5 mikroliter av Ghost Red 780 Viability Dye. Efter grundlig blandning, linda rören med folie för en 45 minuters inkubation vid 4 grader celsius med rotation.Vid slutet av inkuberingen, samla cellerna genom centrifugering och resuspend pelletsen i en milliliter FACS buffert per prov. Överför cellproverna till enskilda fem milliliter FACS-rör på is och justera kompensationen med hjälp av enfärgskontroller. Sortera sedan cellerna på 20 pounds per kvadrattum genom en 100 mikrometer munstycke.Mikrovaskulära pericyter utvecklas runt väggarna i kapillärer och visar en fyrkantig form. Myoepithelial celler omger lacrymal sekretoriska acini, har långa processer, och upptar ett relativt stort område. Här visas celler som separeras från en lacrymal körtel inför Fluorescence-aktiverad cellsortering, som just visats.För flödescytometrisk sortering av myoepithelialceller och pericyter bör cellerna först gated av deras framåt och side-scatter områden innan utesluta eventuella dubbler. Efter gating att utesluta de döda cellerna, kontrollprover används för att bestämma bakgrundsljudet och för att fastställa en ordentlig ersättning för en optimal separation mellan signaler. Kom ihåg att hålla numret på körtlarna och rötningsmediet volym som beskrivs i protokollet, och att kontrollera effektiviteten i vävnads matsmältningen vid alla steg.De isolerade cellerna kan användas för flera nedströms ansökan inklusive in vivo/in vitro-experiment, till exempel cellodling, transplantation, metabolomik, proteomik och encellig analys.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

Isolering av tidiga hematopoetiska stamceller från Murine gulesäcken och årsstämma

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

Isolering och odling av vuxna Epithelial stamceller från mänskliga Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolering och odling av individuella Myofibers och deras satellit celler från vuxna skelettmuskulatur

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naiv Vuxna stamceller Isolering från primära humana fibroblastkulturer

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Isolering av livskraftig flercelliga körtlar från Tissue av köttätande växt, Nepenthes</i

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolering och kultur av Dental epitelceller stamceller från vuxen mus Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolering av murint Ventil Endotelceller

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

Manipulera Murin tårkörteln

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

Samtidig isolering av högkvalitativa kardiomyocyter, endotelceller och fibroblaster från ett vuxen råtthjärta

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

Isolering av enteriska gliaceller från Submucosa och Lamina Propria av vuxen musen

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...