Name: scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing
Uploaded: 2019-09-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing at JoVE.com

نشكر الدكتورة بيترا فايسجربر ووحدة ترانسجين التابعة للمنشأة الحيوانية لمنتدى جنوب المحيط الهادئ (المشروع P2 من SFB 894) التابعة لكلية الطب والمنشأة الحيوانية في معهد الجراحة السريرية والتجريبية في كلية الطب في جامعة سارلاند، هومبورغ. نشكر الدكتور أندرياس بيك على قراءته النقدية للمخطوطة. تم تمويل هذه الدراسة من قبل وزارة المالية الألمانية Sonderforschungsbereich (SFB) 894، المشروع A3 إلى A.B. و V.F.).

وتمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية وتنفيذها وفقا للوائح الأخلاقيات ولجان رعاية الحيوان في جامعة سارلاند وسارلاند.
1 [سلّ] أوّليّة ثقافة و [سرنا] [ترنسّكأيشن]
ملاحظة: في الأسلوب الموضح، يتم استخدام الخلايا الليفية الأساسية. هذه الخلايا تلعب دورا حاسما ف...

<ol>
	<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li><li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing--aiming+for+perfect+skin+regeneration.">Wound healing--aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276, 75-81 (1997).</li><li>Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+actin+cytoskeleton+during+early+endothelial+regeneration+in+vitro.">Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro.</a> Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).</li><li>Belkacemi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP3+Receptor-Dependent+Cytoplasmic+Ca(2+)+Signals+Are+Tightly+Controlled+by+Cavbeta3.">IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3.</a> Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).</li><li>Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healing+of+partial+thickness+porcine+skin+wounds+in+a+liquid+environment.">Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment.</a> Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).</li><li>Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+wounds+in+the+MRL/MPJ+mouse+heal+with+scar.">Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar.</a> Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).</li><li>Vagesjo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+in+mice+by+on-site+production+and+delivery+of+CXCL12+by+transformed+lactic+acid+bacteria.">Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria.</a> Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).</li><li>Eming, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+closure+in+mice+deficient+for+interleukin-10.">Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10.</a> American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).</li><li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber.">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).</li><li>Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dorsal+skinfold+chamber:+window+into+the+dynamic+interaction+of+biomaterials+with+their+surrounding+host+tissue.">The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue.</a> European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).</li><li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration.">Cell migration.</a> Comprehensive Physiology. 2, 2369-2392 (2012).</li><li>Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Alternative+Functions+for+the+Auxiliary+Subunits+of+the+Voltage-Gated+Calcium+Channels.">Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels.</a> Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+4.1G+Regulates+Cell+Adhesion,+Spreading,+and+Migration+of+Mouse+Embryonic+Fibroblasts+through+the+beta1+Integrin+Pathway.">Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).</li><li>Dewor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+migration+inhibitory+factor+(MIF)+promotes+fibroblast+migration+in+scratch-wounded+monolayers+in+vitro.">Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro.</a> FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).</li><li>Handly, L. N., Wollman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound-induced+Ca(2+)+wave+propagates+through+a+simple+release+and+diffusion+mechanism.">Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism.</a> Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).</li><li>Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+In+Vitro+Wound+Healing+Assay+to+Evaluate+Cell+Migration.">A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), 56825 (2018).</li><li>Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular+and+Affordable+Time-Lapse+Imaging+and+Incubation+System+Based+on+3D-Printed+Parts,+a+Smartphone,+and+Off-The-Shelf+Electronics.">A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics.</a> PLoS One. 11, 0167583 (2016).</li><li>Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+adhesion+and+migration.">Endothelial cell adhesion and migration.</a> Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).</li><li>Treloar, K. K., Simpson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+of+edge+detection+methods+for+quantifying+cell+migration+assays.">Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays.</a> PLoS One. 8, 67389 (2013).</li><li>Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+starvation:+caveat+emptor.">Serum starvation: caveat emptor.</a> American Journal of Physiology-Cell Physioliology. 301, 272-279 (2011).</li><li>Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+access+chamber+for+the+rat+dorsal+skin+fold.">A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold.</a> Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).</li><li>Deoliveira, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ear+punch+model+for+studying+the+effect+of+radiation+on+wound+healing.">An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing.</a> International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).</li><li>Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+excisional+wound+model:+Contraction+revisited.">The murine excisional wound model: Contraction revisited.</a> Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).</li><li>Dunn, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+wound+healing.">Murine model of wound healing.</a> Journal of Visualized Experiment. (75), e50265 (2013).</li><li>Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juglone+ameliorates+skin+wound+healing+by+promoting+skin+cell+migration+through+Rac1/Cdc42/PAK+pathway.">Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway.</a> Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).</li></ol>

في هذه المخطوطة، نصف دراسة في المختبر وفي الجسم الحي للشفاء من الجروح وربط النتائج التي تم الحصول عليها. للفحص في المختبر، استخدمنا الخلايا الليفية الماوس الأولية4،14،15 التي تلعب دورا هاما في التئام الجروح وإعادة عرض الأنسجة11.</s...

يبدأ التئام الجروح الجلدية مباشرة بعد إصابة الجلد من أجل استعادة سلامة الجلد وحماية الكائن الحي من العدوى. عملية التئام الجروح تمر بأربع مراحل متداخلة. التخثر، التهاب، تشكيل الأنسجة الجديدة، وإعادة عرض الأنسجة1. وهجرة الخلايا أمر بالغ الأهمية خلال هذه المراحل. يتم تنشيط الخلايا الالتهابية والخلايا المناعية والخلايا الكيراتينية والخلايا البطانية والخلايا الليفية في نقاط زمنية مختلفة وغزو منطقة الجرح2. طرق التحقيق في التئام الجروح في المختبر وفي الجسم الحي هي ذات أهمية كبيرة ليس فقط لفهم الآليات الكامنة ولكن أيضا لاختبار أدوية جديدة ووضع استراتيجيات جديدة تهدف إلى تحسين وتسريع التئام الجروح الجلد.
لمراقبة وتحليل ترحيل الخلايا، يمكن استخدام فحص ترحيل الخدش. وغالبا ما يشار إليها باسم في المختبر التئام الجروح الاختبار. يتطلب هذا الأسلوب مرفق ثقافة الخلية3. وهو إجراء بسيط، ليست هناك حاجة للمعدات الراقية ويمكن إجراء الفحص في معظم مختبرات بيولوجيا الخلايا. في هذا الفحص، يتم إنشاء منطقة خالية من الخلايا عن طريق التعطيل الميكانيكي لخلية أحادية اللمعة، ويفضل أن تكون خلايا أو ليفية تشبه الظهارية أو البطانية. سيتم ترحيل الخلايا الموجودة على حافة الخدش من أجل إعادة ملء الفجوة التي تم إنشاؤها. والقياس الكمي للمنطقة الخالية من الخلايا المتناقصة مع مرور الوقت يشبه معدل الهجرة ويشير إلى الوقت الذي تحتاج إليه الخلايا لسد الفجوة. لهذا الغرض، يمكن للمحققين استخدام إما خلايا معزولة بشكل حاد من الفئران WT أو الفئران تفتقر إلى جين من الفائدة4، أو الخلايا الخالدة المتاحة من مستودعات الخلايا موثوق بها. يسمح تحليل الصفر بدراسة تأثير المركبات النشطة الدوائية أو تأثير cDNAs أو siRNAs على هجرة الخلايا.
في الجسم الحي، التئام الجروح هو عملية فسيولوجية معقدة، تتطلب أنواع مختلفة من الخلايا بما في ذلك الخلايا الكيراتينية، الخلايا الالتهابية، الخلايا الليفية، الخلايا المناعية والخلايا البطانية من أجل استعادة السلامة البدنية للبشرة في أسرع وقت ممكن1 . وقد وضعت طرق مختلفة للدراسة في التئام الجروح في الجسم الحي واستخدامها في الماضي5و6و7و8. غرفة الجلد الظهرية الموصوفة في هذه المقالة كانت تستخدم سابقا لالتئام الجروح الاختبارات9. يتم استخدامه كإعداد غرفة الجلد الظهرية المعدلة للفئران. نموذج غرفة skinfold المعدلة لديها العديد من المزايا. 1) أنه يقلل من تقلص الجلد، مما يمنع مراقبة عملية التئام الجروح، ويمكن أن تؤثر على إصلاح الجروح في الفئران. 2) هذه الغرفة يجعل من استخدام تغطية الجرح مع غطاء زجاجي، والحد من التهابات الأنسجة والجفاف، والتي يمكن أن تؤخر عملية الشفاء. 3) يمكن رصد تدفق الدم والأوعية الدموية مباشرة. 4) فإنه يسمح التطبيق الموضعي المتكرر للمركبات النشطة الدوائية والكواشف من أجل علاج الجرح وتسريع الشفاء9،10.
حددنا الوحدة الفرعية β3 من قنوات الكالسيوم عالية الجهد المسورة (Cavβ3) كجزيء الهدف المحتمل للتأثير على التئام الجروح الجلد باستخدام بروتوكولين مستقلين، أي، في المختبر فحص الهجرة الصفر ونموذج غرفة الجلد في الجسم الحي الظهري. للاختبار في المختبر، استخدمنا الخلايا الليفية الأولية، وهذه الخلايا لا تعبر عن الجين Cacnb3 ترميز البروتين Cavβ3 ولكن تفتقر إلى إلغاء الاستقطاب الناجمعن Ca2+ تدفق أو التيارات Ca2 + تعتمد على الجهد. وصفنا وظيفة جديدة من Cavβ3 في هذه الخلايا الليفية: Cavβ3 يربط إلى مستقبلات الإينوزيتول 1,4,5-تريسفوسفات (IP3R) والقيود الإفراج عن الكالسيوم من الشبكية endoplasmic. حذف الجين Cacnb3 في الفئران يؤدي إلى زيادة حساسية IP3R لIP3، وتعزيز هجرة الخلايا وزيادة إصلاح الجرح الجلد4.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9 % NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Kai Industries</td>
			<td>48201</td>
			<td>2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297)</td>
			<td>Origene</td>
			<td>SR415626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilation cream</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any depilation cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>3400935940179.00</td>
			<td>(BEPANTHEN)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine)</td>
			<td>Bayer Health Care</td>
			<td></td>
			<td>Rompun 2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagon full nut</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>KETASET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Keyence, Osaka, Japan</td>
			<td>BZ-8000</td>
			<td>Similar microscopes might be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse restrainer</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>plan apo 10x/0.45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene sutures</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwdriver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin disinfectant (octeniderm)</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH</td>
			<td>118212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted cheese head screw</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap ring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap ring plier</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope with camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica M651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium frames for the skinfold chamber</td>
			<td>IROLA</td>
			<td>160001</td>
			<td>Halteblech M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire piler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing

يعد ضعف التئام الجروح الجلدية مصدر قلق كبير للمرضى الذين يعانون من مرض السكري والمسنين، وهناك حاجة إلى علاج فعال. الملائمة في المختبر وفي الجسم الحي هي ضرورية لتحديد جزيئات الهدف الجديد لعلاج المخدرات لتحسين عملية التئام الجروح الجلدية. حددنا الوحدة الفرعية β3 من قنوات الكالسيوم المسورة بالجهد (Cavβ3) كجزيء هدف محتمل للتأثير على التئام الجروح في اختبارين مستقلين، أي فحص الهجرة الصفر في المختبر ونموذج غرفة الجلد في الجسم الحي الظهري. الخلايا الليفية الجنينية الأولية (MEFs) معزولة بشكل حاد عن الفئران البرية من النوع (WT) وCavβ3 نقص الفئران (Cavβ3 KO) أو الخلايا الليفية المعزولة بشكل حاد من الفئران WT المعالجة مع siRNA إلى أسفل تنظيم التعبير عن الجين Cacnb3 ، ترميز Cavβ3، تم استخدامها. تم تطبيق خدش على خلية أحادية اللون confluent وأعقب إغلاق الفجوة من قبل التقاط الصور المجهرية في نقاط زمنية محددة حتى إعادة السكان كاملة من الفجوة من قبل الخلايا المهاجرة. تم تحليل هذه الصور، وتم تحديد معدل ترحيل الخلايا لكل حالة. في فحص في الجسم الحي، زرعنا غرفة الجلد الظهرية على الفئران WT وCavβ3 KO، وتطبيق جرح دائري محدد من قطر 2 ملم، وغطت الجرح مع غطاء زجاجي لحمايته من العدوى والجفاف، ورصد إغلاق الجرح العيانية مع مرور الوقت. وكان إغلاق الجرح أسرع بكثير في Cacnb3-الفئران نقص الجينات. لأن نتائج الاختبارات في الجسم الحي والمختبر ترتبط بشكل جيد، قد يكون الفحص في المختبر مفيدة للفحص عالي الإنتاجية قبل التحقق من صحة الضربات في المختبر من قبل نموذج التئام الجروح في الجسم الحي. ما أظهرناه هنا للفئران أو الخلايا التي تعاني من نقص في البراري وCavβ3 قد ينطبق أيضًا على جزيئات محددة غير Cavβ3.

وقد أجري هذا التخدش على طبقة أحادية من الخلايا المتجانسة من نوع البرية وناقصة β3(الشكل 1ج). بعد إجراء "الصفر" باستخدام طرف ماصة 200 μL، تنتقل الخلايا من كلا النمطين الجيني إلى منطقة الصفر وتسد الفجوة. وقد التقطت الصور بعد 6 و 10 و 30 ح(الشكل 1أ). تم ...

Watch this Scientific Journal Video about Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing at JoVE.com

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

هنا، نقدم بروتوكول احتساء الصفر في المختبر باستخدام الخلايا الليفية الأولية ولإجراء اختبار التئام الجروح في الجلد في الجسم الحي في الفئران. كلا الاختبارين هما طريقتان مباشرتان لتقييم الجروح في المختبر وفي الجسم الحي.

فحص الهجرة الصفر وغرفة الجلد السمرة لتحليل في المختبر وفي الجسم الحي للشفاء الجروح

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

يحتاج المتمردون إلى علاج الجروح الجلدية. لتحديد الجزيئات المستهدفة لعلاج الأدوية، يلزم إجراء اختبارات في المختبر وفي الجسم الحي. النظم المناسبة هي في المختبر خدش المقايسة، وفي الجسم الحي الظهري الجلد أضعاف الغرفة.كلاهما إجراءات مباشرة إلى الأمام لرصد الهجرة الخلية والجلد التئام الجروح, في غياب ووجود المركبات النشطة دوائيا. على الرغم من أن كلا التقنيات هي مباشرة إلى الأمام، ينبغي للمحققين ممارسة تطبيق الصفر. والجلد الظهري أضعاف زرع غرفة، والجرح للحصول على نتائج موثوقة وقابلة للتكرار.سيتم عرض الإجراءات من قبل الدكتور ماتياس لاشكي، وهو جراح وأستاذ من معهد الجراحة السريرية والتجريبية. قبل البدء في الإجراء، استخدم علامة دائمة فائقة الدقة لوضع علامة على لوحة واحدة من ستة أطباق جيدة لكل نوع خلية، مع خط أفقي في أسفل كل بئر لتحديد منطقة الصفر لكل ثقافة. المقبل لوحة الألياف الأولية الانفجارات معزولة عن نوع البرية وبيتا 3 الفئران ناقص، في لوحة ستة بئر في 5 مرات 10 إلى انفجارات الألياف الخامسة لكل تركيز جيد.في 2mL من DMEM تكملها مع 10٪ مصل الأبقار الجنين. تسمية لوحات مع نوع الخلية، واكتب وراثي وتاريخ. ووضع لوحات في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 24 ساعة.في صباح اليوم التالي إضافة 9 ميكرو لتر من كل مبيد الدهون على أساس transfection الفائدة، إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة الفردية التي تحتوي على 150 ميكرو لتر من متوسطة المصل مخفضة لكل أنبوب. إضافة 1.5 لتر صغير من سيرنا إلى أنبوب جهاز طرد مركزي صغير ثاني لكل كاشف طارد يحتوي على 150 لتراً ميكروً من متوسط المصل المخفض لكل أنبوب. وخلط كل حل سيرنا مع أنبوب واحد من محلول كاشف transfection.بعد دوامة لفترة وجيزة مكان المخاليط في 21 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أثناء الحضانة استبدال بعناية supernate في كل بئر. مع 2.25mL من الثقافة الطازجة المتوسطة أسفل الجانب من الآبار.في نهاية الحضانة إضافة 250 لتراً من المزيج كاشف الترانف siRNA المناسبة، إسقاط الحكمة في كل بئر المقابلة من الخلايا. وإرجاع اللوحات إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة 72 ساعة. عندما وصلت الخلايا إلى 100٪التقاء، تجاهل ثقافة مفوج من كل بئر.واستخدام 200 ميكرو لتر ماصة تلميح لخلق الصفر في أحادية الخلية التقاء. عمودي إلى خط أفقي ملحوظ في الجزء السفلي من كل بئر. ثم شطف بعناية كل الجرحى جيدا 2 مرات مع 2mL من PPS لكل غسل.لإزالة أي عوامل مفرج عنها من الخلايا التالفة، وخلايا فضفاضة أو الحطام من المنطقة خدش. بعد غسل الثانية إضافة 2mL من ثقافة الخلية الطازجة المتوسطة تكملها المصل 1 أو 10 في المئة إلى كل بئر. والتقاط صور الجروح في كل لوحة على خشبة المسرح من المجهر الخفيف.مباشرة بعد الخدش في التكبير 10X. ثم العودة لوحة إلى حاضنة ثقافة الخلية. الاستمرار في التقاط الصور في نقاط الوقت التجريبية المناسبة لل30 ساعة القادمة.في نهاية التجربة كميّة الأولى خلية منطقة حرّة و متبقّي منطقة بعد 6, 10 و30 ساعات من ثقافة. لتحديد النسبة المئوية لمنطقة التسويد التي تمت إعادة اكتظاظها بواسطة الخلايا المُهاجرة نسبة إلى منطقة التسويد الأولية. بعد التأكد من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع القارص، في النوع البرية أو بيتا ثلاثة خروج المغلوب C57 الأسود ستة الماوس، حلق بعناية dorsum.و تطبيق مرهم على عيون الحيوان تطبيق كريم إزالة الشعر للقضاء على أي الشعر المتبقية. إزالة كريم بعد 10 دقائق.لتحضير غرفة التيتانيوم، قم بإصلاح جزء واحد من إطار غرفة التيتانيوم المتناظرة، مع مسامير متصلة بالمكسرات. للحفاظ على 400 إلى 500 ميكرومتر بين جزأين متماثلين من الغرفة. لتجنب ضغط من فَيَصل الدم في الجلد.تطهير الجلد المكشوف مع 70٪ الإيثانول. وفهم أضعاف من الجلد أمام مصدر الضوء. ضع الخط الأوسط للطبقة المزدوجة من الجلد إلى حيث سيتم زرع غرفة التيتانيوم.و cranially وcaudally إصلاح أضعاف الجلد مع خياطة البولي بروبلين. شدّ على الجانب الآخر من الغرزة على رف معدني لرفع الجلد المطوي. وضبط ارتفاع الرف للسماح للماوس للجلوس بشكل مريح.خياطة الإطار الأول من غرفة التيتانيوم من قبل خياطة البولي بروبلين على حافة متفوقة على الجزء الخلفي من أضعاف الجلد الظهرية. بعد إعادة تأكيد التخدرية استخدام مقص غرامة لجعل شقوق صغيرة في الجلد. وتمرير اثنين من مسامير ربط تعلق على النصف الأول من غرفة التيتانيوم من خلال قاعدة أضعاف الجلد.إزالة الماوس من الرف، ووضع الحيوان في موقف الجانبي. ضع النصف الثاني من غرفة التيتانيوم على قمة 3 مسامير متصلة. و تطبيق ضغط طفيف يدويا لتمرير هذه المسامير من خلال النصف الثاني من الإطار التيتانيوم.تقع طبقة الجلد المطوية الآن بين نصفي نصفي إطار التيتانيوم. ثم إصلاح كل من أجزاء متناظرة مع المكسرات الفولاذ المقاوم للصدأ. باستخدام 2mL قياس 2 مل خزعة قطرها، علامة على منطقة الجرح في وسط الجلد، داخل نافذة المراقبة من غرفة الجلد أضعاف.واستخدام ملقط غرامة ومقص لإزالة البشرة بأكملها والأدمة داخل العلامة. لخلق جرح دائري. تنظيف 3 ونصف إلى 4 ونصف ميلمتر مربع الجرح مع 0.5mL من المالحة العقيمة.وغطّي الجرح بغطاء زجاجي استخدام كماشة خاتم المفاجئة على غرفة التيتانيوم لإصلاح غطاء في مكان. ونقل الماوس على الفور إلى مرحلة التصوير من منظار مجسم.ثم صورة الجرح في التكبير 40X. قبل وضع الماوس في قفص مع مراقبة حتى الشفاء الكامل. بعد إنشاء خدش باستخدام 200 ميكرو لتر ماصة تلميح كما هو موضح, في هذه التجربة التمثيلية, هاجرت الخلايا من كلا النمطين الجيني في منطقة الصفر وأغلقت الفجوة.ثم تم تحديد كمي ترحيل الخلية كنسبة مئوية من منطقة نقطة الصفر التي أعيد إسكانها بواسطة الخلايا المهاجرة 6 ساعات بعد إجراء نقطة الصفر. على سبيل المثال في هذه التجربة ترحيل Cav beta 3 النفثالين الألياف الانفجارات أغلقت منطقة الخدش بشكل ملحوظ في وقت سابق من الألياف الانفجارات من الفئران نوع البرية. لتأكيد تأثير Cav beta 3 المعتمدة التي لوحظت في كاف بيتا 3 نقص الألياف الانفجارات, تم نقل أنواع البرية الألياف الانفجارات مع سيرنا إلى أسفل تنظيم كاف بيتا 3 البروتين.الألياف الانفجارات تعامل مع كاف بيتا 3 siRNAs محددة تصرفت مثل بيتا 3 الانفجارات الألياف ناقص. لمقارنة التئام الجروح بين كلا النمطين الجينيين، تم تصوير منطقة الجرح في غرفة طي الجلد مباشرة بعد الإصابة. و تم تصوير الجرح خلال الأسبوعين القادمينتم قياس أحجام الجروح على الصور ومنطقة الجرح ، في يوم معين تم التعبير عنه كنسبة مئوية من منطقة الجرح الأولي. كما هو متوقع تم زيادة معدل إغلاق الجرح في كاف بيتا 3 الفئران ناقصة بالمقارنة مع الضوابط نوع البرية. تأكد من تطبيق ضغط متساو على طرف الماصات، لكل خدش وتطابق الخدوش إلى خطوط ملحوظ على لوحة أسفل أقرب ما يمكن.يمكن فتح نافذة المراقبة لغرفة الجلد الظهرية أضعاف في أي وقت خلال عملية الشفاء. السماح للتطبيق الموضعي للمركبات النشطة الدوائية المختلفة. ومن الممكن أيضاً أن تُخَفَّر المنطقة المصابة في مراحل مختلفة من عملية الشفاء.للبروتين الجزيئي البيوكيميائي أو التحليل النسيجي.

Research

JoVE Journal

Medicine

Murine Model of Wound Healing

نموذج الفئران من التئام الجروح

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

الفئران التنظير ل<em&gt; في فيفو</em&gt; شفاء المتعدد الوسائط التصوير من التسرطن وتقييم المعوية والتهاب الجرح

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Ischemic Tissue Injury in the Dorsal Skinfold Chamber of the Mouse: A Skin Flap Model to Investigate Acute Persistent Ischemia

إصابة الأنسجة الدماغية في دائرة ثنية الجلد الظهري للماوس: A الجلد رفرف نموذج المعنية بالتحقيق في نقص التروية الحاد الثابتة

Despite profound expertise and advanced surgical techniques, ischemia-induced complications ranging from wound breakdown to extensive tissue necrosis are ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

الحقن الشريان السباتي لوأضافا الدوائية وتحليل Taxanes في الفئران

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

نضوب خلايا الفأر من Xenografts ورم الإنسان يحسن بشكل ملحوظ تحليل المصب من الخلايا المستهدفة

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

تطوير نموذج متوجا اللب مباشرة لتقييم اللب الجروح وتشكيل إصلاحي العاج في الفئران

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

تحليل الأمثل ل<em&gt; في فيفو</em&gt; و<em&gt; في المختبر</em&gt; كبدي تشحم

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

مجهرية على أساس أساليب التقييم للهجرة الخلية الظهارية أثناء التئام الجرح في المختبر

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

سحجه الظهارة القرنية مع لدغ العين كنموذج للقرنية التئام الجروح

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...