Name: scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing
Uploaded: 2019-09-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing at JoVE.com

Vi takker Dr. Petra Weissgerber og transgene enhed af SPF Animal facilitet (projekt P2 af SFB 894) af det medicinske fakultet og dyret facilitet på Institut for klinisk og eksperimentel kirurgi på det medicinske fakultet ved Saarland Universitet, Homburg. Vi takker Dr. Andreas Beck for kritisk læsning af manuskriptet. Denne undersøgelse blev finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, projekt a3 til A.B. og V.F.).

Alle forsøgsprocedurer blev godkendt og udført i overensstemmelse med de etiske regler og dyrevelfærds udvalgene i Saarland og Saarland Universitet.
1 primær cellekultur og siRNA transfektering
Bemærk: i den beskrevne metode anvendes primære fibroblaster. Disse celler spiller en afgørende rolle i sårheling og vævs remodeling11. I dette eksperiment, den Cacnb3 genet, kodning af Cavβ3 underenhed af højspændings-gated calcium ...

<ol>
	<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li><li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing--aiming+for+perfect+skin+regeneration.">Wound healing--aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276, 75-81 (1997).</li><li>Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+actin+cytoskeleton+during+early+endothelial+regeneration+in+vitro.">Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro.</a> Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).</li><li>Belkacemi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP3+Receptor-Dependent+Cytoplasmic+Ca(2+)+Signals+Are+Tightly+Controlled+by+Cavbeta3.">IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3.</a> Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).</li><li>Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healing+of+partial+thickness+porcine+skin+wounds+in+a+liquid+environment.">Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment.</a> Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).</li><li>Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+wounds+in+the+MRL/MPJ+mouse+heal+with+scar.">Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar.</a> Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).</li><li>Vagesjo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+in+mice+by+on-site+production+and+delivery+of+CXCL12+by+transformed+lactic+acid+bacteria.">Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria.</a> Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).</li><li>Eming, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+closure+in+mice+deficient+for+interleukin-10.">Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10.</a> American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).</li><li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber.">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).</li><li>Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dorsal+skinfold+chamber:+window+into+the+dynamic+interaction+of+biomaterials+with+their+surrounding+host+tissue.">The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue.</a> European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).</li><li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration.">Cell migration.</a> Comprehensive Physiology. 2, 2369-2392 (2012).</li><li>Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Alternative+Functions+for+the+Auxiliary+Subunits+of+the+Voltage-Gated+Calcium+Channels.">Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels.</a> Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+4.1G+Regulates+Cell+Adhesion,+Spreading,+and+Migration+of+Mouse+Embryonic+Fibroblasts+through+the+beta1+Integrin+Pathway.">Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).</li><li>Dewor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+migration+inhibitory+factor+(MIF)+promotes+fibroblast+migration+in+scratch-wounded+monolayers+in+vitro.">Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro.</a> FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).</li><li>Handly, L. N., Wollman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound-induced+Ca(2+)+wave+propagates+through+a+simple+release+and+diffusion+mechanism.">Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism.</a> Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).</li><li>Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+In+Vitro+Wound+Healing+Assay+to+Evaluate+Cell+Migration.">A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), 56825 (2018).</li><li>Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular+and+Affordable+Time-Lapse+Imaging+and+Incubation+System+Based+on+3D-Printed+Parts,+a+Smartphone,+and+Off-The-Shelf+Electronics.">A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics.</a> PLoS One. 11, 0167583 (2016).</li><li>Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+adhesion+and+migration.">Endothelial cell adhesion and migration.</a> Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).</li><li>Treloar, K. K., Simpson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+of+edge+detection+methods+for+quantifying+cell+migration+assays.">Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays.</a> PLoS One. 8, 67389 (2013).</li><li>Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+starvation:+caveat+emptor.">Serum starvation: caveat emptor.</a> American Journal of Physiology-Cell Physioliology. 301, 272-279 (2011).</li><li>Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+access+chamber+for+the+rat+dorsal+skin+fold.">A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold.</a> Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).</li><li>Deoliveira, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ear+punch+model+for+studying+the+effect+of+radiation+on+wound+healing.">An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing.</a> International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).</li><li>Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+excisional+wound+model:+Contraction+revisited.">The murine excisional wound model: Contraction revisited.</a> Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).</li><li>Dunn, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+wound+healing.">Murine model of wound healing.</a> Journal of Visualized Experiment. (75), e50265 (2013).</li><li>Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juglone+ameliorates+skin+wound+healing+by+promoting+skin+cell+migration+through+Rac1/Cdc42/PAK+pathway.">Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway.</a> Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).</li></ol>

I dette manuskript beskriver vi en in vitro og in vivo sårhelings analyse og korrelerer de opnåede resultater. Til in vitro-analysen brugte vi primære mus fibroblaster4,14,15 , som spiller en vigtig rolle i sårheling og vævs remodeling11. Andre vedlige celletyper, der vokser som monolag (f. eks. epiteliale celler, endotelceller, keratinocytter), kan også anvendes. Plating det samme antal levedygtige...

Hudsårheling starter umiddelbart efter hudskaden for at genoprette hudens integritet og for at beskytte organismen mod infektioner. Sårhelingsprocessen går gennem fire overlappende faser; Koagulering, inflammation, ny vævs dannelse og vævs remodellering1. Celle migration er afgørende i disse faser. Inflammatoriske celler, immunceller, keratinocytter, endotelceller, og fibroblaster aktiveres på forskellige tidspunkter og invadere sårområdet2. Metoder til undersøgelse af sårheling in vitro og in vivo er af stor interesse ikke blot for at forstå de underliggende mekanismer, men også for at afprøve nye lægemidler og udvikle nye strategier, der har til formål at forbedre og accelerere sårheling i huden.
Hvis du vil overvåge og analysere celle migrering, kan du anvende analyse af scratch-migrering. Det er ofte omtales som in vitro sårheling assay. Denne metode kræver en cellekultur facilitet3. Det er en simpel procedure, der er ikke behov for high-end udstyr og analysen kan udføres i de fleste cellebiologi laboratorier. I denne analyse, et celle-frit område er skabt af den mekaniske afbrydelse af en flydende Cell monolayer, fortrinsvis epitelial-eller endotelekallignende celler eller fibroblaster. Celler på kanten af bunden vil migrere for at genbefolke den oprettede kløft. Kvantificering af det faldende celle frie område over tid minder om overførselshastigheden og angiver den tid, som cellerne har brug for til at lukke hullet. Til dette formål, efterforskere kan bruge enten akut isolerede celler fra WT mus eller mus mangler et gen af interesse4, eller udødeliggjort celler til rådighed fra pålidelige celle depoter. Scratch assay gør det muligt at studere indflydelsen af farmakologisk aktive forbindelser eller effekten af transficeret cdnas eller sirnas på celle migration.
In vivo, sårheling er en kompleks fysiologisk proces, der kræver forskellige celletyper, herunder keratinocytter, inflammatoriske celler, fibroblaster, immunceller og endotelceller for at genoprette hudens fysiske integritet så hurtigt som muligt1 . Forskellige metoder til at studere in vivo sårheling er blevet udviklet og anvendt i de sidste5,6,7,8. Den dorsale fold kammer beskrevet i denne artikel blev tidligere anvendt til sårheling assays9. Det bruges som en modificeret dorsale fold kammer forberedelse til mus. Den modificerede fold kammer model har flere fordele. 1) det minimerer hud sammentrækning, som forhindrer observere sårheling proces og kan påvirke sårreparation i mus. 2) dette kammer gør brug af dækker såret med en glas dækseddel, reducere vævs infektioner og udtørring, som kan forsinke helbredelsesprocessen. 3) blodgennemstrømning og vaskularisering kan overvåges direkte. 4) det giver mulighed for gentagne topikal anvendelse af farmakologisk aktive forbindelser og reagenser for at behandle såret og fremskynde healing9,10.
Vi identificerede β3 under enheden af højspændings-gated calcium kanaler (cavβ3) som et potentielt mål molekyle til at påvirke huden sårheling ved hjælp af to uafhængige protokoller, dvs in vitro scratch migration assay og in vivo dorsale fold kammer model. Til in vitro-analyse, vi brugte primære fibroblaster, disse celler udtrykker Cacnb3 genet kodning af Cavβ3 protein, men mangler depolarisering-induceret ca2 + tilstrømning eller spændings afhængige ca2 + strømme. Vi beskrev en roman funktion af cavβ3 i disse fibroblaster: cavβ3 binder sig til inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptor (IP3R) og begrænsninger calcium frigivelse fra endoplasmatiske reticulum. Sletning af Cacnb3 genet i mus fører til øget følsomhed af IP3R for IP3, forbedret celle migration og øget sårheling reparation4.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9 % NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Kai Industries</td>
			<td>48201</td>
			<td>2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297)</td>
			<td>Origene</td>
			<td>SR415626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilation cream</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any depilation cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>3400935940179.00</td>
			<td>(BEPANTHEN)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine)</td>
			<td>Bayer Health Care</td>
			<td></td>
			<td>Rompun 2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagon full nut</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>KETASET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Keyence, Osaka, Japan</td>
			<td>BZ-8000</td>
			<td>Similar microscopes might be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse restrainer</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>plan apo 10x/0.45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene sutures</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwdriver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin disinfectant (octeniderm)</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH</td>
			<td>118212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted cheese head screw</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap ring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap ring plier</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope with camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica M651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium frames for the skinfold chamber</td>
			<td>IROLA</td>
			<td>160001</td>
			<td>Halteblech M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire piler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing

Nedsat kutane sårheling er et stort problem for patienter, der lider af diabetes og for ældre mennesker, og det er nødvendigt med en effektiv behandling. Passende in vitro-og in vivo-tilgange er afgørende for identifikationen af nye målmolekyler til behandling af lægemidler for at forbedre hudens sårhelings proces. Vi identificerede β3 under enheden af spændings-gated calcium kanaler (cavβ3) som et potentielt mål molekyle til at påvirke sårheling i to uafhængige analyser, dvs in vitro scratch migration assay og in vivo dorsale fold kammer model. Primære mus embryonale fibroblaster (Mef'er), som er akut isoleret fra mus af vildtype (WT) og CAVβ3-mangelfuld (CAVβ3 ko) eller fibroblaster, som er akut isoleret fra WT-mus, som er behandlet med siRNA, til nedregulering af ekspression af Cacnb3 -genet , kodning CAVβ3, blev anvendt. En ridse blev anvendt på en flydende Cell enkeltlags og hullet lukning blev efterfulgt af at tage mikroskopiske billeder på definerede tidspunkter, indtil fuldstændig genbestand af hullet af de migrerende celler. Disse billeder blev analyseret, og celle migrerings hastigheden blev bestemt for hver betingelse. I en in vivo-analyse implanterede vi et dorsale fold kammer på WT og cavβ3 ko-mus, anvendte et defineret cirkulært sår med en diameter på 2 mm, dækkede såret med en glas dækseddel for at beskytte det mod infektioner og udtørring og overvågede den makroskopiske sårlukning over tid. Sårlukningen var signifikant hurtigere i mus med Cacnb3-gener. Da resultaterne af in vivo-og in vitro-assays korrelerer godt, kan in vitro-analysen være nyttig til screening af høj hastighed, før in vitro-hits valideres af in vivo-sårhelings modellen. Hvad vi har vist her for Wild-type og CAVβ3-mangelfulde mus eller celler kan også være gældende for specifikke molekyler bortset fra Cavβ3.

Ridse analysen blev udført på et konflydende celle-enkeltlags af vildt-type-og β3-mangelfulde mef'er (figur 1c). Efter at have udført "bunden" ved hjælp af en 200 μL pipettespids, migrerer cellerne fra begge genotyper ind i arbejdsområdet og lukker hullet. Billeder blev taget efter 6, 10 og 30 h (figur 1a). Celle migration blev kvantificeret som procentdelen (%) af arbejdsområde genbefolket ved at migrere celler 6 timer ...

Watch this Scientific Journal Video about Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing at JoVE.com

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Her præsenterer vi en protokol for en in vitro scratch assay ved hjælp af primære fibroblaster og for en in vivo hud sårheling analyse i mus. Begge assays er enkle metoder til at vurdere in vitro og in vivo sårheling.

Scratch migration assay og dorsale Skinfold kammer for in vitro og in vivo analyse af sårheling

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

Oprørernes behov for behandling af hudsår. For at identificere dine målmolekyler til lægemiddelbehandlinger kræves in vitro og in vivo-testsystemer. Passende systemer er in vitro scratch assay, og in vivo dorsal hud fold kammer.Begge er ligetil procedurer for overvågning celle migration og hud sårheling, i mangel og tilstedeværelse af farmakologisk aktive forbindelser. Selv om begge teknikker er ligetil, bør efterforskere praksis bunden ansøgning. Og den dorsale hud fold kammer implantation, og sårede for at opnå pålidelige og reproducerbare resultater.Demonstration af procedurerne vil blive udført af Dr.Matthias Laschke, en kirurg og professor fra institut for klinisk og eksperimentel kirurgi. Før du begynder proceduren, skal du bruge en ultra fin permanent markør for at markere en seks brøndplade pr. celletype, med en vandret linje i bunden af hver brønd for at afgrænse bunden for hver kultur. Næste plade primære fiber blaster isoleret fra vilde type og beta 3 mangelfuld mus, i en seks godt plade på en 5 gange 10 til den femte fiber blaster pr brønd koncentration.I 2 ml DMEM suppleret med 10% føtalt kvægserum. Mærsk pladerne med celletype, genotype og dato. Og læg pladerne i cellekulturskuvøsen i 24 timer.Den næste morgen tilføje 9 mikro liter af hver lipid baseret transfektion reagens af interesse, til de enkelte mikro centrifuge rør, der indeholder 150 mikro liter reduceret serum medium pr rør. Tilsæt 1,5 mikro liter siRNA til et andet mikrocentrifugerør pr. transfektionsreage, der indeholder 150 mikro liter reduceret serummedium pr. rør. Og bland hver siRNA-opløsning med et enkelt rør af transfektionsrekt reagensopløsning.Efter kort vortexing sted blandingerne ved 21 grader Celsius i 5 minutter. Under inkubationen forsigtigt erstatte superfødte i hver brønd. Med 2.25mL frisk kultur medium ned ad siden af brøndene.Ved udgangen af inkubationen tilsættes 250 mikro liter af den relevante siRNA transfektion reagens blanding, drop klogt i hver tilsvarende brønd af celler. Og returnere pladerne til cellekultur inkubatoren i 72 timer. Når cellerne har nået 100%sammenløbet, kasseres kultursupernatanten fra hver brønd.Og brug en 200 mikro liter pipettespids til at skabe bunden i sammenløbet celle monolayer. Lodret til den markerede vandrette linje i bunden af hver brønd. Skyl derefter omhyggeligt hver såret godt 2 gange med 2 ml PPS pr vask.For at fjerne eventuelle frigivne faktorer fra de beskadigede celler, løse celler eller snavs fra det ridsede område. Efter den anden vask tilføje 2 ml frisk cellekultur medium suppleret med 1 eller 10 procent serum til hver brønd. Og tag billeder af sårene i hver plade på scenen af et lysmikroskop.Umiddelbart efter ridse ved en 10X forstørrelse. Vend derefter pladen tilbage til cellekulturskuvøsen. Fortsætter med at tage billeder på de relevante eksperimentelle tidspunkter for de næste 30 timer.Ved afslutningen af forsøget kvantificere det oprindelige cellefrie område og resterende areal efter 6, 10 og 30 timers kultur. For at bestemme procentdelen af arbejdsområdet genbefolket af de migrerende celler i forhold til det oprindelige arbejdsområde. Efter at have bekræftet en manglende reaktion på tå knivspids, i den vilde type eller beta tre knockout C57 sort seks mus, barber dorsum.Og anvende salve til dyrets øjne. Påfør depilatory creme til at fjerne eventuelle resterende hår. Fjernelse af cremen efter 10 minutter.For at forberede titaniumkammeret fastgør du en del af den symmetriske titaniumkammerramme med tilslutningsskruerne med møtrikker. For at opretholde 400 til 500 mikrometer mellem de to symmetriske dele af kammeret. For at undgå kompression af blod vesicles i huden.Desinficere den eksponerede hud med 70% ethanol. Og tag fat i en hudfold foran en lyskilde. Placer den midterste linje af det dobbelte lag af huden, hvor titanium kammer vil blive implanteret.Og kranielt og caudally fastsætte huden fold med en polypropylen sutur. Stram den anden side af suturen på en metalstativ for at løfte den foldede hud. Og juster rackets højde, så musen kan sidde behageligt.Sutur den første ramme af titanium kammer ved polypropylen suturer på det overlegen kant til bagsiden af rygskind fold. Efter endnu en bekræftelse sedation bruge fine saks til at gøre små snit i huden. Og passere de to forbinder skruer knyttet til den første halvdel af titanium kammer gennem bunden af huden fold.Fjern musen fra reolen, og placer dyret i en lateral position. Placer den anden gratis halvdel af titanium kammer på toppen af de 3 tilslutningsskruer. Og manuelt anvende let tryk for at passere disse skruer gennem anden halvdel af titanium rammen.Det foldede hudlag er nu klemt inde mellem de to symmetriske halvdele af titaniumrammen. Derefter fastgør begge symmetriske dele med rustfrit stål nødder. Ved hjælp af en standardiseret 2 ml diameter biopsi punch, markere sårområdet i midten af huden, inden for observation vinduet i huden fold kammer.Og bruge fine kraftforbånd og saks til at fjerne hele epidermis og dermis i mærket. For at skabe et cirkulært sår. Rengør 3 og en halv til 4 og en halv milometer kvadreret sår med 0,5 ml sterilt saltvand.Og dæk såret med et glas coverslip. Brug snap ring tænger på titanium kammer til at fastsætte coverslip på plads. Og straks overføre musen til billeddannelse fase af et stereomikroskop.Derefter billede såret på en 40X forstørrelse. Før du placerer musen i et bur med overvågning, indtil fuld helbredelse. Efter at have oprettet en ridse ved hjælp af en 200 mikro liter pipette spids som vist, i dette repræsentative eksperiment, celler fra begge genotyper migreret ind i arbejdsområdet og lukkede hullet.Celleoverflytningen blev derefter kvantificeret som procentdelen af arbejdsområdet genbefolket ved at overføre celler 6 timer efter, at bunden blev udført. For eksempel i dette eksperiment migrere Cav beta 3 mangelfuld fiber blaster lukket bunden området betydeligt tidligere end fiber blaster fra vilde type mus. For at bekræfte Cav beta 3 afhængig effekt observeret i Cav beta 3 mangelfuld fiber blaster, vilde type fiber blaster blev transfected med siRNA at ned regulere Cav beta 3 protein.Fiber blaster behandlet med Cav beta 3 specifikke siRNAs opførte sig som beta 3 mangelfuld fiber blaster. For at sammenligne hudsårheling mellem begge genotyper blev sårområdet i hudfoldskammeret fotograferet direkte efter såret. Og såret blev afbildet i løbet af de næste 2 uger.Sårenes størrelse blev målt på billederne og sårområdet på en given dag udtrykt som procentdelen af det oprindelige sårområde. Som forventet blev sårlukningshastigheden øget i Cav beta 3 mangelfulde mus sammenlignet med kontrol af vildtype. Sørg for at trykke lige så meget på pipettenspidsen, for hver ridse og for at matche ridserne med de markerede linjer på pladebunden så tæt som muligt.Observationsvinduet i dorsal hudfold kammer kan åbnes når som helst under helingsprocessen. Giver mulighed for lokal anvendelse af forskellige farmakologisk aktive forbindelser. Det er også muligt at punktafgifter det sårede område på forskellige stadier af helingsprocessen.Til molekylær protein biokemisk eller histologisk analyse.

Research

JoVE Journal

Medicine

Murine Model of Wound Healing

Musemodel af Sårheling

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murin Endoskopi til<em&gt; In Vivo</em&gt; Multimodal Imaging af Carcinogenesis og vurdering af Intestinal sårheling og betændelse

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Ischemic Tissue Injury in the Dorsal Skinfold Chamber of the Mouse: A Skin Flap Model to Investigate Acute Persistent Ischemia

Iskæmisk væv skade i Dorsal hudfolden Afdeling Mus: En hudlap modellen til Akut Persistent Iskæmi

Despite profound expertise and advanced surgical techniques, ischemia-induced complications ranging from wound breakdown to extensive tissue necrosis are ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Halspulsåren infusioner farmakokinetisk og farmakodynamisk analyse af Taxaner i mus

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Udtømning af Mouse Celler fra Humane tumorxenoplantater Markant Forbedrer Downstream Analyse af Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

Udvikling af en Direct Pulp-capping Model for Vurdering af pulpa Sårheling og Reparative Dentin Formation i mus

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Optimeret Analyse af<em&gt; In vivo</em&gt; og<em&gt; In vitro</em&gt; Nedsat Steatose

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

Mikroskopi baseret metoder til vurdering af epitelcelle Migration under In Vitro sårheling

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Hornhindens epitel slid med okulær Burr som en Model for hornhinden sårheling

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...