Name: scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing
Uploaded: 2019-09-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing at JoVE.com

We danken Dr. Petra Weissgerber en de transgene Unit van de SPF dieren faciliteit (project P2 van SFB 894) van de medische faculteit en de dieren faciliteit aan het Instituut voor klinische en experimentele chirurgie aan de medische faculteit van de Universiteit van Saarland, Homburg. We danken Dr. Andreas Beck voor de kritische lezing van het manuscript. Deze studie werd gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, project a3 tot A.B. en V.F.).

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de ethische voorschriften en de dierenwelzijns comités van Saarland en de Universiteit van Saarland.
1 primaire celcultuur en siRNA-transfectie
Opmerking: in de beschreven methode worden primaire fibroblasten gebruikt. Deze cellen spelen een cruciale rol in de wondgenezing en weefsel remodellering11. In dit experiment, het Cacnb3 gen, het coderen van...

<ol>
	<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li><li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing--aiming+for+perfect+skin+regeneration.">Wound healing--aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276, 75-81 (1997).</li><li>Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+actin+cytoskeleton+during+early+endothelial+regeneration+in+vitro.">Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro.</a> Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).</li><li>Belkacemi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP3+Receptor-Dependent+Cytoplasmic+Ca(2+)+Signals+Are+Tightly+Controlled+by+Cavbeta3.">IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3.</a> Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).</li><li>Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healing+of+partial+thickness+porcine+skin+wounds+in+a+liquid+environment.">Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment.</a> Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).</li><li>Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+wounds+in+the+MRL/MPJ+mouse+heal+with+scar.">Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar.</a> Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).</li><li>Vagesjo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+in+mice+by+on-site+production+and+delivery+of+CXCL12+by+transformed+lactic+acid+bacteria.">Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria.</a> Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).</li><li>Eming, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+closure+in+mice+deficient+for+interleukin-10.">Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10.</a> American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).</li><li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber.">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).</li><li>Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dorsal+skinfold+chamber:+window+into+the+dynamic+interaction+of+biomaterials+with+their+surrounding+host+tissue.">The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue.</a> European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).</li><li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration.">Cell migration.</a> Comprehensive Physiology. 2, 2369-2392 (2012).</li><li>Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Alternative+Functions+for+the+Auxiliary+Subunits+of+the+Voltage-Gated+Calcium+Channels.">Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels.</a> Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+4.1G+Regulates+Cell+Adhesion,+Spreading,+and+Migration+of+Mouse+Embryonic+Fibroblasts+through+the+beta1+Integrin+Pathway.">Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).</li><li>Dewor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+migration+inhibitory+factor+(MIF)+promotes+fibroblast+migration+in+scratch-wounded+monolayers+in+vitro.">Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro.</a> FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).</li><li>Handly, L. N., Wollman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound-induced+Ca(2+)+wave+propagates+through+a+simple+release+and+diffusion+mechanism.">Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism.</a> Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).</li><li>Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+In+Vitro+Wound+Healing+Assay+to+Evaluate+Cell+Migration.">A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), 56825 (2018).</li><li>Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular+and+Affordable+Time-Lapse+Imaging+and+Incubation+System+Based+on+3D-Printed+Parts,+a+Smartphone,+and+Off-The-Shelf+Electronics.">A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics.</a> PLoS One. 11, 0167583 (2016).</li><li>Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+adhesion+and+migration.">Endothelial cell adhesion and migration.</a> Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).</li><li>Treloar, K. K., Simpson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+of+edge+detection+methods+for+quantifying+cell+migration+assays.">Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays.</a> PLoS One. 8, 67389 (2013).</li><li>Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+starvation:+caveat+emptor.">Serum starvation: caveat emptor.</a> American Journal of Physiology-Cell Physioliology. 301, 272-279 (2011).</li><li>Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+access+chamber+for+the+rat+dorsal+skin+fold.">A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold.</a> Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).</li><li>Deoliveira, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ear+punch+model+for+studying+the+effect+of+radiation+on+wound+healing.">An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing.</a> International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).</li><li>Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+excisional+wound+model:+Contraction+revisited.">The murine excisional wound model: Contraction revisited.</a> Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).</li><li>Dunn, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+wound+healing.">Murine model of wound healing.</a> Journal of Visualized Experiment. (75), e50265 (2013).</li><li>Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juglone+ameliorates+skin+wound+healing+by+promoting+skin+cell+migration+through+Rac1/Cdc42/PAK+pathway.">Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway.</a> Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).</li></ol>

In dit manuscript beschrijven we een in vitro en in vivo wond genezings test en correleren we de verkregen resultaten. Voor de in vitro assay gebruikten we primaire muizen fibroblasten4,14,15 die een belangrijke rol spelen in wondgenezing en weefsel remodellering11. Andere aanhangend celtypen die groeien als monolagen (bijv. epitheliale cellen, endotheel cellen, keratinocyten) kunnen ook worden gebruikt. ...

Huid wondgenezing begint onmiddellijk na de huidletsel om de integriteit van de huid te herstellen en het organisme te beschermen tegen infecties. Het wond genezingsproces doorloopt vier overlappende fasen; coagulatie, ontsteking, nieuwe weefselvorming en weefsel remodellering1. Celmigratie is cruciaal tijdens deze fasen. Ontstekingscellen, immuuncellen, keratinocyten, endotheel cellen en fibroblasten worden op verschillende tijdstippen geactiveerd en dringen het wondgebied2binnen. Methoden om de wondgenezing in vitro en in vivo te onderzoeken zijn niet alleen van groot belang om de onderliggende mechanismen te begrijpen, maar ook om nieuwe geneesmiddelen te testen en nieuwe strategieën te ontwikkelen om huid wondgenezing te verbeteren en te versnellen.
Voor het bewaken en analyseren van Celmigratie kan de Scratch Migration test worden gebruikt. Het wordt vaak aangeduid als in vitro wondgenezing assay. Deze methode vereist een cel cultuur faciliteit3. Het is een eenvoudige procedure, er is geen behoefte aan high-end apparatuur en de assay kan worden uitgevoerd in de meeste cel biologie laboratoria. In deze test wordt een cel vrij gebied gecreëerd door de mechanische verstoring van een confluente celmonolayer, bij voorkeur epitheel-of endotheel achtige cellen of fibroblasten. Cellen aan de rand van de Scratch worden gemigreerd om de gemaakte kloof opnieuw te vullen. Kwantificering van de afnemende cel-vrije gebied na verloop van tijd lijkt op de migratiesnelheid en geeft de tijd, die de cellen nodig hebben om de kloof te sluiten. Voor dit doel kunnen onderzoekers ofwel acuut geïsoleerde cellen gebruiken van WT muizen of muizen die geen gen van belang4hebben, of vereeuwigd cellen die beschikbaar zijn via betrouwbare celopslagplaatsen. De Scratch assay maakt het bestuderen van de invloed van farmacologisch actieve verbindingen of het effect van gegeneerde Cdna's of Sirna's op Celmigratie mogelijk.
In vivo is wondgenezing een complex fysiologisch proces, waarbij verschillende celtypen nodig zijn, waaronder keratinocyten, ontstekingscellen, fibroblasten, immuuncellen en endotheel cellen om de fysieke integriteit van de huid zo snel mogelijk te herstellen1 . Verschillende methoden om te studeren in vivo wondgenezing zijn ontwikkeld en gebruikt in de afgelopen5,6,7,8. De in dit artikel beschreven dorsale huidplooi kamer werd eerder gebruikt voor wondgenezing testen9. Het wordt gebruikt als een gemodificeerde dorsale huidplooi kamer preparaat voor muizen. Het model met de aangepaste huidplooi kamer heeft verschillende voordelen. 1) het minimaliseert de contractie van de huid, die het observeren van het wond genezingsproces verhindert en de wond reparatie bij muizen kan beïnvloeden. 2) deze kamer maakt gebruik van het bedekken van de wond met een glazen dekglaasje, het verminderen van weefsel infecties en uitdroging, waardoor het genezingsproces kan vertragen. 3) doorbloeding en vascularisatie kan direct worden bewaakt. 4) het maakt repetitieve actuele toepassing van farmacologisch actieve verbindingen en reagentia mogelijk om de wond te behandelen en de genezing te versnellen9,10.
We identificeerden de β3 subeenheid van hoogspannings-gated calcium kanalen (cavβ3) als een potentieel doelwit molecuul om huid wondgenezing te beïnvloeden met behulp van twee onafhankelijke protocollen, d.w.z. de in-vitro Scratch migratietest en het in vivo dorsale huidplooi Chamber model. Voor de in vitro assay gebruikten we primaire fibroblasten, deze cellen uiten het Cacnb3 gen dat het cavβ3-eiwit codeert, maar gebrek aan depolarisatie-geïnduceerde CA2 + toestroom of spanning-afhankelijke CA2 + stromingen. We beschrijven een nieuwe functie van Cavβ3 in deze fibroblasten: Cavβ3 bindt aan de inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptor (IP3R) en beperkingen calcium afgifte uit het endoplasmische reticulum. Deletie van het Cacnb3 gen in muizen leidt tot een verhoogde gevoeligheid van de IP3R voor IP3, verbeterde Celmigratie en verhoogde huid wond reparatie4.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9 % NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Kai Industries</td>
			<td>48201</td>
			<td>2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297)</td>
			<td>Origene</td>
			<td>SR415626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilation cream</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any depilation cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>3400935940179.00</td>
			<td>(BEPANTHEN)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine)</td>
			<td>Bayer Health Care</td>
			<td></td>
			<td>Rompun 2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagon full nut</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>KETASET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Keyence, Osaka, Japan</td>
			<td>BZ-8000</td>
			<td>Similar microscopes might be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse restrainer</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>plan apo 10x/0.45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene sutures</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwdriver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin disinfectant (octeniderm)</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH</td>
			<td>118212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted cheese head screw</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap ring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap ring plier</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope with camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica M651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium frames for the skinfold chamber</td>
			<td>IROLA</td>
			<td>160001</td>
			<td>Halteblech M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire piler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing

Verminderde cutane wondgenezing is een belangrijke zorg voor patiënten die lijden aan diabetes en ouderen, en er is behoefte aan een effectieve behandeling. Geschikte in vitro en in vivo benaderingen zijn essentieel voor de identificatie van nieuwe doel moleculen voor medicamenteuze behandelingen om het huid wond genezingsproces te verbeteren. We identificeerden de β3-subeenheid van voltage-gated calcium kanalen (cavβ3) als een potentieel doelwit molecuul om de wondgenezing te beïnvloeden in twee onafhankelijke testen, d.w.z. de in-vitro Scratch migratietest en het in vivo dorsale huidplooi Chamber model. Primaire muis embryonale fibroblasten (Mef's) acuut geïsoleerd van wild-type (WT) en CAVβ3-deficiënte muizen (CAVβ3 ko) of FIBROBLASTEN acuut geïsoleerd van WT muizen behandeld met siRNA naar beneden-reguleren de uitdrukking van het Cacnb3 gen , codering CAVβ3, werden gebruikt. Een kras werd aangebracht op een confluente celmonolayer en de spleet sluiting werd gevolgd door microscopische beelden op gedefinieerde tijdstippen te nemen tot volledige herbevolking van de kloof door de migrerende cellen. Deze beelden werden geanalyseerd en de Celmigratie snelheid werd voor elke aandoening bepaald. In een in vivo test hebben we een dorsale huidplooi kamer op WT-en Cavβ3 KO-muizen geïmplanteerd, een gedefinieerde cirkel wond van 2 mm diameter aangebracht, de wond bedekt met een glazen dekglaasje om het te beschermen tegen infecties en uitdroging, en de macroscopische wondsluiting bewaakt na verloop van tijd. Wondsluiting was significant sneller in Cacnb3-gen-deficiënte muizen. Omdat de resultaten van de in vivo en de in vitro assays goed correleren, kan de in vitro assay nuttig zijn voor de screening met hoge doorvoer voordat de in-vitro treffers worden valideerd door het in vivo wond genezings model. Wat we hier hebben laten zien voor wild-type en CAVβ3-deficiënte muizen of cellen kan ook toepasbaar zijn voor specifieke moleculen anders dan Cavβ3.

De kras test werd uitgevoerd op een confluente celmonolaag van wild-type en β3-deficiënte Mef's (Figuur 1c). Na het uitvoeren van de "Scratch" met een pipetpunt van 200 μL migreren cellen van beide genotypen naar het scratch gebied en sluiten de kloof. Beelden werden genomen na 6, 10 en 30 h (Figuur 1a). Celmigratie werd gekwantificeerd als het percentage (%) van het scratch gebied wordt opnieuw gevuld door de migratie van ce...

Watch this Scientific Journal Video about Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing at JoVE.com

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Hier presenteren we een protocol voor een in vitro Scratch assay met primaire fibroblasten en voor een in vivo huid wond genezings test bij muizen. Beide assays zijn eenvoudige methoden om te beoordelen in vitro en in vivo wondgenezing.

Scratch Migration assay en dorsale skinfold Chamber voor in vitro en in vivo analyse van wondgenezing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

De opstandige behoefte aan behandeling van huidwonden. Om uw doelmoleculen voor medicamenteuze behandelingen te identificeren, zijn in vitro- en in vivo testsystemen vereist. Geschikte systemen zijn de in vitro scratch test, en de in vivo dorsale huidplooikamer.Beide zijn rechttoe rechtaan procedures voor het monitoren van celmigratie en huidwondengenezing, bij afwezigheid en aanwezigheid van farmacologisch actieve verbindingen. Hoewel beide technieken zijn rechttoe rechtaan, onderzoekers moeten de praktijk van de kras applicatie. En de dorsale huidplooi kamer implantatie, en wond om betrouwbare en reproduceerbare resultaten te verkrijgen.Demonstratie van de procedures zal worden gedaan door Dr.Matthias Laschke, een chirurg en professor van het instituut voor klinische en experimentele chirurgie. Gebruik voor het begin van de procedure een ultra fijne permanente markering om één zes putplaat per celtype te markeren, met een horizontale lijn aan de onderkant van elke put om het krasgebied voor elke cultuur af te bakenen. Volgende plaat primaire vezel ontploffing geïsoleerd van wilde type en beta 3 gebrekkige muizen, in een zes put plaat op een 5 keer 10 tot de vijfde vezel ontploffing per put concentratie.In 2mL van DMEM aangevuld met 10%foetaal runderserum. Label de platen met het celtype, genotype en datum. En plaats de platen in de celcultuur incubator voor 24 uur.De volgende ochtend voeg 9 micro liter van elke lipide gebaseerde transfectie reagens van belang, aan individuele micro centrifuge buizen met 150 micro liter verminderd serum medium per buis. Voeg 1,5 liter siRNA toe aan een tweede microcentrifugebuis per transfectiereagensagemiddel met 150 microliter verlaagd serummedium per buis. En meng elke siRNA-oplossing met een enkele buis van transfectie reagens oplossing.Na kort vortexen plaats de mengsels op 21 graden Celsius gedurende 5 minuten. Vervang tijdens de incubatie zorgvuldig de supernate in elke put. Met 2.25mL vers cultuurmedium onderaan de kant van de putten.Voeg aan het einde van de incubatie 250 microliter van het juiste siRNA-transfectierefectagemengsel toe, laat wijs vallen in elke overeenkomstige put van cellen. En breng de platen 72 uur terug naar de celkweek incubator. Wanneer de cellen 100% samenvloeiing hebben bereikt, gooi de cultuur supernatant van elke put.En gebruik een 200 micro liter pipet tip om kras te maken in de confluent cel monolayer. Verticaal naar de gemarkeerde horizontale lijn aan de onderkant van elke put. Spoel vervolgens elke gewonde goed 2 keer zorgvuldig af met 2mL PPS per wasbeurt.Om eventuele vrijgekomen factoren uit de beschadigde cellen, losse cellen of puin uit het bekraste gebied te verwijderen. Na de tweede wasbeurt voeg 2mL van verse cel cultuur medium aangevuld met 1 of 10 procent serum aan elke put. En leg beelden vast van de wonden in elke plaat op het podium van een lichtmicroscoop.Onmiddellijk na het krabben bij een 10X vergroting. Breng de plaat vervolgens terug naar de couveuse van de celcultuur. Doorgaan met het vastleggen van beelden op de juiste experimentele tijdstippen voor de komende 30 uur.Aan het einde van het experiment kwantificeren de initiële cel vrije gebied en het resterende gebied na 6, 10 en 30 uur cultuur. Het percentage van het krasgebied bepalen dat opnieuw wordt bevolkt door de migrerende cellen ten opzichte van het oorspronkelijke krasgebied. Na het bevestigen van een gebrek aan reactie op teen knijpen, in het wilde type of bèta drie knock-out C57 zwarte zes muis, zorgvuldig scheren de dorsum.En breng zalf toe op de ogen van het dier. Breng ontharingscrème aan om het resterende haar te elimineren. Het verwijderen van de crème na 10 minuten.Om de titaniumkamer voor te bereiden, bevestigt u een deel van het symmetrische titaniumkamerframe, met de verbindingsschroeven met moeren. Om 400 tot 500 micrometer tussen de twee symmetrische delen van de kamer te behouden. Om compressie van de bloedveikels in de huid te voorkomen.Desinfecteer de blootgestelde huid met 70% ethanol. En pak een plooi van de huid in de voorkant van een lichtbron. Plaats de middelste lijn van de dubbele laag van de huid op de plaats waar de titaniumkamer zal worden geïmplanteerd.En cranially en caudally fix de huidplooi met een polypropyleen hechting. Draai de andere kant van de hechting aan een metalen rek om de gevouwen huid op te tillen. En stel de hoogte van het rek aan zodat de muis comfortabel kan zitten.Hecht het eerste frame van de titaniumkamer door polypropyleen hechtingen op het superieure rand aan de achterkant van de rughuidplooi. Na het herbevestigen gebruik fijne schaar om kleine insnijdingen in de huid te maken. En geef de twee aansluitende schroeven bevestigd aan de eerste helft van de titanium kamer door de basis van de huidplooi.Haal de muis uit het rek en plaats het dier in een zijdelingse positie. Plaats de tweede gratis helft van de titanium kamer bovenop de 3 aansluitende schroeven. En handmatig lichte druk uitoefenen om deze schroeven door de tweede helft van het titanium frame te laten gaan.De gevouwen huidlaag is nu ingeklemd tussen de twee symmetrische helften van het titanium frame. Bevestig vervolgens beide symmetrische onderdelen met roestvrijstalen moeren. Met behulp van een gestandaardiseerde biopsiepunch met een diameter van 2 mL markeert u het wondgebied in het midden van de huid, in het observatievenster van de huidplooikamer.En gebruik fijne tang en schaar om de hele opperhuid en dermis binnen het merk te verwijderen. Om een cirkelvormige wond te creëren. Reinig de 3 en een half tot 4 en een halve milometer vierkante wond met 0,5 mL steriele zoutoplossing.En bedek de wond met een glazen kaplip. Gebruik de snap ring plier op de titanium kamer om de coverslip vast te stellen op zijn plaats. En breng de muis onmiddellijk over naar de beeldvormingsfase van een stereomicroscoop.Beeld dan de wond bij een 40X vergroting. Voordat u de muis in een kooi plaatst met controle tot volledig herstel. Na het maken van een kras met behulp van een 200 micro liter pipet tip zoals aangetoond, in dit representatieve experiment, cellen van beide genotypen gemigreerd naar het krasgebied en sloot de kloof.De celmigratie werd vervolgens gekwantificeerd als het percentage krasgebied dat opnieuw werd bevolkt door cellen 6 uur na het uitvoeren van de kras te migreren. Bijvoorbeeld in dit experiment migreren Cav beta 3 gebrekkige vezel ontploffing sloot de scratch gebied aanzienlijk eerder dan vezel ontploffing van wilde type muizen. Om te bevestigen de Cav beta 3 afhankelijke effect waargenomen in Cav beta 3 gebrekkige vezel ontploffing, wild type vezel ontploffing werden doorgetalled met siRNA naar beneden reguleren van de Cav beta 3 eiwit.Fiber blasts behandeld met de Cav beta 3 specifieke siRNAs gedragen als bèta 3 gebrekkige fiber blasts. Om huidwondgenezing tussen beide genotypen te vergelijken, werd het wondgebied in de huidplooikamer direct na het verwonden gefotografeerd. En de wond werd afgebeeld in de komende 2 weken.De afmetingen van de wonden werden gemeten op de beelden en het wondgebied, op een bepaalde dag werd uitgedrukt als, het percentage van de eerste wond gebied. Zoals verwacht werd het percentage wondsluiting verhoogd in Cav beta 3 deficiënte muizen in vergelijking met wild type controles. Zorg ervoor dat u gelijke druk uitoefent op de pipetpunt, voor elke kras en om de krassen zo dicht mogelijk op de gemarkeerde lijnen op de bodem van de plaat te matchen.Het observatievenster van de rughuidplooikamer kan op elk moment tijdens het genezingsproces worden geopend. Rekening laten met de actuele toepassing van verschillende farmacologisch actieve verbindingen. Het is ook mogelijk om het gewonde gebied in verschillende stadia van het genezingsproces uit te roeien.Voor moleculaire eiwit biochemische of histologische analyse.

Research

JoVE Journal

Medicine

Murine Model of Wound Healing

Muizenmodel van wondgenezing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Muizen Endoscopie voor<em&gt; In Vivo</em&gt; Multimodal Imaging van Carcinogenese en Evaluatie van intestinale wondgenezing en ontsteking

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Ischemic Tissue Injury in the Dorsal Skinfold Chamber of the Mouse: A Skin Flap Model to Investigate Acute Persistent Ischemia

Ischemische Tissue Injury in de dorsale huidplooien kamer van de Muis: A Skin Flap Model naar Acute Persistent Ischemia Onderzoek

Despite profound expertise and advanced surgical techniques, ischemia-induced complications ranging from wound breakdown to extensive tissue necrosis are ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Halsslagader Infusions voor farmacokinetische en farmacodynamische analyse van Taxanen in Muizen

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Uitputting van de Muis Cellen van geënte, humane tumoren verbetert Downstream Analyse van Target Cellen

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

Ontwikkeling van een Direct-Pulp aftopping model voor de evaluatie van pulpal wondgenezing en Reparative Dentin Formation in Muizen

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Geoptimaliseerd Analyse van<em&gt; In Vivo</em&gt; en<em&gt; In Vitro</em&gt; Leversteatose

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

Methoden voor de beoordeling van epitheliale cel migratie tijdens het In Vitro wondgenezing op basis van microscopie

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Hoornvlies epitheliale schuren met oogbeschadigingen en/of Burr als een Model voor hoornvlies wondgenezing

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...