Name: scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing
Uploaded: 2019-09-26T13:00:00
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Nous remercions la Dre Petra Weissgerber et l'Unité Transgène de l'établissement animalier SPF (projet P2 de la SFB 894) de la Faculté de médecine et l'établissement animalier de l'Institut de chirurgie clinique et expérimentale de la Faculté de médecine de l'Université de Sarre, à Hombourg. Nous remercions le Dr Andreas Beck pour la lecture critique du manuscrit. Cette étude a été financée par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, projet A3 à A.B. et V.F.).

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées et exécutées conformément aux règlements d'éthique et aux comités de protection des animaux de la Sarre et de l'Université de la Sarre.
1 Culture cellulaire primaire et transfection de siRNA
REMARQUE : Dans la méthode décrite, des fibroblastes primaires sont utilisés. Ces cellules jouent un rôle crucial dans la cicatrisation des plaies et le remodelage des tissus11. Dans ce...

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	<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li><li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing--aiming+for+perfect+skin+regeneration.">Wound healing--aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276, 75-81 (1997).</li><li>Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+actin+cytoskeleton+during+early+endothelial+regeneration+in+vitro.">Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro.</a> Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).</li><li>Belkacemi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP3+Receptor-Dependent+Cytoplasmic+Ca(2+)+Signals+Are+Tightly+Controlled+by+Cavbeta3.">IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3.</a> Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).</li><li>Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healing+of+partial+thickness+porcine+skin+wounds+in+a+liquid+environment.">Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment.</a> Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).</li><li>Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+wounds+in+the+MRL/MPJ+mouse+heal+with+scar.">Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar.</a> Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).</li><li>Vagesjo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+in+mice+by+on-site+production+and+delivery+of+CXCL12+by+transformed+lactic+acid+bacteria.">Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria.</a> Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).</li><li>Eming, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+closure+in+mice+deficient+for+interleukin-10.">Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10.</a> American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).</li><li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber.">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).</li><li>Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dorsal+skinfold+chamber:+window+into+the+dynamic+interaction+of+biomaterials+with+their+surrounding+host+tissue.">The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue.</a> European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).</li><li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration.">Cell migration.</a> Comprehensive Physiology. 2, 2369-2392 (2012).</li><li>Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Alternative+Functions+for+the+Auxiliary+Subunits+of+the+Voltage-Gated+Calcium+Channels.">Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels.</a> Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+4.1G+Regulates+Cell+Adhesion,+Spreading,+and+Migration+of+Mouse+Embryonic+Fibroblasts+through+the+beta1+Integrin+Pathway.">Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).</li><li>Dewor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+migration+inhibitory+factor+(MIF)+promotes+fibroblast+migration+in+scratch-wounded+monolayers+in+vitro.">Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro.</a> FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).</li><li>Handly, L. N., Wollman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound-induced+Ca(2+)+wave+propagates+through+a+simple+release+and+diffusion+mechanism.">Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism.</a> Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).</li><li>Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+In+Vitro+Wound+Healing+Assay+to+Evaluate+Cell+Migration.">A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), 56825 (2018).</li><li>Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular+and+Affordable+Time-Lapse+Imaging+and+Incubation+System+Based+on+3D-Printed+Parts,+a+Smartphone,+and+Off-The-Shelf+Electronics.">A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics.</a> PLoS One. 11, 0167583 (2016).</li><li>Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+adhesion+and+migration.">Endothelial cell adhesion and migration.</a> Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).</li><li>Treloar, K. K., Simpson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+of+edge+detection+methods+for+quantifying+cell+migration+assays.">Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays.</a> PLoS One. 8, 67389 (2013).</li><li>Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+starvation:+caveat+emptor.">Serum starvation: caveat emptor.</a> American Journal of Physiology-Cell Physioliology. 301, 272-279 (2011).</li><li>Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+access+chamber+for+the+rat+dorsal+skin+fold.">A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold.</a> Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).</li><li>Deoliveira, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ear+punch+model+for+studying+the+effect+of+radiation+on+wound+healing.">An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing.</a> International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).</li><li>Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+excisional+wound+model:+Contraction+revisited.">The murine excisional wound model: Contraction revisited.</a> Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).</li><li>Dunn, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+wound+healing.">Murine model of wound healing.</a> Journal of Visualized Experiment. (75), e50265 (2013).</li><li>Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juglone+ameliorates+skin+wound+healing+by+promoting+skin+cell+migration+through+Rac1/Cdc42/PAK+pathway.">Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway.</a> Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).</li></ol>

Dans ce manuscrit, nous décrivons un analyse de guérison in vitro et in vivo de blessure et corrélons les résultats obtenus. Pour l'analyse in vitro, nous avons utilisé les fibroblastes primaires de souris4,14,15 qui jouent un rôle important dans la cicatrisation des plaies et le remodelage des tissus11. D'autres types de cellules adhérentes qui poussent sous forme de monocouches (p. ex. cellules ?...

La cicatrisation des plaies cutanées commence immédiatement après la blessure cutanée afin de restaurer l'intégrité de la peau et de protéger l'organisme contre les infections. Le processus de cicatrisation des plaies passe par quatre phases qui se chevauchent; coagulation, inflammation, nouvelle formation de tissu, et tissu transformant1. La migration cellulaire est cruciale pendant ces phases. Les cellules inflammatoires, les cellules immunitaires, les kératinocytes, les cellules endothéliales et les fibroblastes sont activés à différents moments et envahissent la zone de la plaie2. Les méthodes d'enquête sur la cicatrisation des plaies in vitro et in vivo sont d'un grand intérêt non seulement pour comprendre les mécanismes sous-jacents, mais aussi pour tester de nouveaux médicaments et pour développer de nouvelles stratégies visant à améliorer et à accélérer la cicatrisation des plaies cutanées.
Pour surveiller et analyser la migration cellulaire, l'analyse de la migration des rayures peut être utilisée. On l'appelle souvent l'in vitro, l'invitro, comme l'exemple de guérison des plaies. Cette méthode nécessite une installation de culture cellulaire3. Il s'agit d'une procédure simple, il n'y a pas besoin d'équipement haut de gamme et l'analyse peut être effectuée dans la plupart des laboratoires de biologie cellulaire. Dans cet analyse, une zone sans cellules est créée par la perturbation mécanique d'une monocouche cellulaire confluente, de préférence des cellules ou des fibroblastes épithélials ou endothéliaux. Les cellules sur le bord de l'éraflure migreront afin de repeupler l'espace créé. La quantification de la diminution de la zone exempte de cellules au fil du temps ressemble au taux de migration et indique le temps dont les cellules ont besoin pour combler l'écart. À cette fin, les chercheurs peuvent utiliser soit des cellules très isolées de souris WT ou des souris dépourvues d'un gène d'intérêt4, ou des cellules immortalisées disponibles à partir de dépôts cellulaires fiables. L'exemple de rayure permet d'étudier l'influence des composés pharmacologiquement actifs ou l'effet des CDNA ou des siARN transfectés sur la migration cellulaire.
In vivo, la cicatrisation des plaies est un processus physiologique complexe, nécessitant différents types de cellules, y compris les kératinocytes, les cellules inflammatoires, les fibroblastes, les cellules immunitaires et les cellules endothéliales afin de restaurer l'intégrité physique de la peau aussi rapidement que possible1 . Différentes méthodes pour étudier la cicatrisation in vivo des plaies ont été développées et utilisées au cours des5,6,7,8. La chambre de skinfold dorsal décrite dans cet article a été précédemment employée pour des essais de guérison de blessure9. Il est utilisé comme une préparation de chambre de skinfold dorsal modifiée pour des souris. Le modèle de chambre peau replié modifié présente plusieurs avantages. 1) il minimise la contraction de peau, qui empêche d'observer le processus de guérison de blessure et pourrait influencer la réparation de blessure chez les souris. 2) Cette chambre fait usage de couvrir la plaie avec un couvercle en verre, réduisant des infections de tissu et dessiccation, qui pourrait retarder le processus de guérison. 3) Le flux sanguin et la vascularisation peuvent être directement surveillés. 4) Il permet l'application topique répétitive des composés pharmacologiquement actifs et des réactifs afin de traiter la blessure et d'accélérer la guérison9,10.
Nous avons identifié la sous-unité no 3 des canaux calciques à haute tension (Cav-3) comme une molécule cible potentielle pour influencer la cicatrisation des plaies cutanées à l'aide de deux protocoles indépendants, c'est-à-dire l'analyse de migration des rayures in vitro et le modèle de chambre de pli de peau dorsal in vivo. Pour l'évaluation in vitro, nous avons utilisé des fibroblastes primaires, ces cellules expriment le gène Cacnb3 codant la protéine Cav3, mais manquent d'afflux De Ca2 ou de courants Ca2 dépendants de la tension. Nous avons décrit une nouvelle fonction de Cav-3 dans ces fibroblastes : Cav-3 se lie au récepteur inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3R) et les contraintes de libération de calcium du réticulum endoplasmique. La suppression du gène Cacnb3 chez la souris conduit à une sensibilité accrue de l'IP3R pour IP3, la migration cellulaire améliorée et la réparation accrue des plaies cutanées4.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9 % NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Kai Industries</td>
			<td>48201</td>
			<td>2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297)</td>
			<td>Origene</td>
			<td>SR415626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilation cream</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any depilation cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>3400935940179.00</td>
			<td>(BEPANTHEN)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine)</td>
			<td>Bayer Health Care</td>
			<td></td>
			<td>Rompun 2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagon full nut</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>KETASET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Keyence, Osaka, Japan</td>
			<td>BZ-8000</td>
			<td>Similar microscopes might be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse restrainer</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>plan apo 10x/0.45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene sutures</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwdriver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin disinfectant (octeniderm)</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH</td>
			<td>118212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted cheese head screw</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap ring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap ring plier</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope with camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica M651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium frames for the skinfold chamber</td>
			<td>IROLA</td>
			<td>160001</td>
			<td>Halteblech M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire piler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing

La cicatrisation des plaies cutanées est une préoccupation majeure pour les patients souffrant de diabète et pour les personnes âgées, et il est nécessaire d'un traitement efficace. Des approches in vitro et in vivo appropriées sont essentielles pour l'identification de nouvelles molécules cibles pour les traitements médicamenteux afin d'améliorer le processus de guérison des plaies cutanées. Nous avons identifié la sous-unité no 3 des canaux calciques à rayons de tension (Cav-3) comme une molécule cible potentielle pour influencer la cicatrisation des plaies dans deux essais indépendants, c'est-à-dire l'analyse de migration des rayures in vitro et le modèle de chambre de pli de peau dorsal in vivo. Fibroblastes embryonnaires primaires de souris (MEFs) aiguement isolés des souris sauvages (WT) et Cav 3-déficientes (Cav3KO) ou fibroblastes aiguement isolés des souris de WT traitées avec siRNA pour réguler vers le bas l'expression du gène de Cacnb3 , l'encodage Cav3,ont été utilisés. Une égratignure a été appliquée sur une monocouche de cellules confluentes et la fermeture d'écart a été suivie en prenant des images microscopiques aux points de temps définis jusqu'à repeupler complètement l'écart par les cellules migrantes. Ces images ont été analysées, et le taux de migration cellulaire a été déterminé pour chaque condition. Dans un analyse in vivo, nous avons implanté une chambre de pli de peau dorsal sur des souris WT et Cav3 KO, appliqué une plaie circulaire définie de 2 mm de diamètre, couvert la plaie avec un couvercle en verre pour la protéger contre les infections et la dessiccation, et surveillé la fermeture macroscopique de la plaie au fil du temps. La fermeture des plaies était significativement plus rapide chez les souris cicnb3-gène-déficientes. Étant donné que les résultats des essais in vivo et in vitro sont bien corrélés, l'analyse in vitro peut être utile pour le dépistage à haut débit avant de valider les coups in vitro par le modèle de guérison des plaies in vivo. Ce que nous avons montré icipour les souris ou les cellules de type sauvage et cav3-déficients pourrait également être applicable pour des molécules spécifiques autres que Cav3.

L'égratignure a été réalisée sur un monocouche de cellules confluentes de type sauvage et de MEF déficients(figure 1c). Après avoir effectué le « scratch » à l'aide d'une pointe de pipette de 200 l, les cellules des deux génotypes migrent dans la zone de rayures et comblent l'écart. Les images ont été prises après 6, 10 et 30 h (Figure 1a). La migration cellulaire a été quantifiée en pourcentage (%) de la zone...

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Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Ici, nous présentons un protocole pour un test de rayure in vitro utilisant les fibroblastes primaires et pour un test de guérison in vivo de blessure de peau chez les souris. Les deux essais sont des méthodes simples pour évaluer la cicatrisation in vitro et in vivo des plaies.

Scratch Migration Assay et Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing Scratch Migration

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

Le besoin des insurgés pour le traitement des blessures de la peau. Pour identifier vos molécules cibles pour les traitements médicamenteux, des systèmes de test in vitro et in vivo sont nécessaires. Les systèmes appropriés sont l’essai in vitro d’éraflure, et la chambre dorsale in vivo de pli de peau.Les deux sont des procédures simples pour surveiller la migration cellulaire et la cicatrisation des plaies cutanées, en l’absence et la présence de composés pharmacologiquement actifs. Bien que les deux techniques soient simples, les chercheurs devraient pratiquer l’application de rayures. Et l’implantation dorsale de chambre pliante de peau, et blessante pour obtenir des résultats fiables et reproductibles.La démonstration des interventions sera effectuée par le Dr Matthias Laschke, chirurgien et professeur à l’Institut de chirurgie clinique et expérimentale. Avant de commencer la procédure, utilisez un marqueur permanent ultra fin pour marquer une plaque de six puits par type de cellule, avec une ligne horizontale au bas de chaque puits pour délimifier la région de rayures pour chaque culture. Les explosions primaires de fibres de plaque suivante isolées de type sauvage et bêta 3 souris déficientes, dans une plaque de six puits à 5 fois 10 à la cinquième fibre souffle par concentration de puits.Dans 2mL de DMEM complété avec le sérum bovin foetal de 10%. Étiquetez les plaques avec le type de cellule, le génotype et la date. Et placez les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures.Le lendemain matin, ajoutez 9 micro litres de chaque réaccélément de transfection à base de lipides d’intérêt, à des tubes individuels de micro centrifugeuse contenant 150 micro litres de sérum moyen réduit par tube. Ajouter 1,5 micro litres de siRNA à un deuxième tube de micro centrifugeuse par réaugnant transfection contenant 150 micro litres de sérum moyen réduit par tube. Et mélanger chaque solution siRNA avec un seul tube de solution de réaccente de transfection.Après avoir brièvement vortexing placer les mélanges à 21 degrés Celsius pendant 5 minutes. Pendant l’incubation, remplacer soigneusement le superné dans chaque puits. Avec 2,25 mL de culture fraîche sur le côté des puits.À la fin de l’incubation ajouter 250 micro litres du mélange approprié de réaccfection transfection siRNA, laisser tomber sage dans chaque puits correspondant de cellules. Et retourner les plaques à l’incubateur de culture cellulaire pendant 72 heures. Lorsque les cellules ont atteint 100% confluent, jeter la culture supernatant de chaque puits.Et utilisez une pointe pipette de 200 micro litres pour créer une égratignure dans le monocouche à cellules confluentes. Verticale à la ligne horizontale marquée au bas de chaque puits. Rincez ensuite soigneusement chaque puits blessé 2 fois avec 2mL de PPS par lavage.Pour éliminer tous les facteurs libérés des cellules endommagées, des cellules lâches ou des débris de la zone rayée. Après le deuxième lavage ajouter 2mL de culture cellulaire fraîche moyenne complétée par 1 ou 10 pour cent sérum à chaque puits. Et capturer des images des blessures dans chaque plaque sur la scène d’un microscope léger.Immédiatement après le grattage à un grossissement 10X. Retournez ensuite la plaque à l’incubateur de culture cellulaire. Continuer à capturer des images aux points de temps expérimentaux appropriés pour les prochaines 30 heures.À la fin de l’expérience quantifier la zone initiale libre de cellules et la zone restante après 6, 10 et 30 heures de culture. Déterminer le pourcentage de la zone d’éraflure repeuplée par les cellules migrées par rapport à la zone de éraflure initiale. Après avoir confirmé un manque de réponse à pincement d’orteil, dans le type sauvage ou bêta trois KO C57 noir six souris, raser soigneusement le dorsum.Et appliquez de l’onguent sur les yeux de l’animal. Appliquer de la crème depilatory pour éliminer les cheveux restants. Retirer la crème après 10 minutes.Pour préparer la chambre en titane, fixez une partie du cadre symétrique de chambre en titane, avec les vis de raccordement avec des écrous. Maintenir de 400 à 500 micromètres entre les deux parties symétriques de la chambre. Pour éviter la compression des vésicules sanguines dans la peau.Désinfecter la peau exposée avec 70% d’éthanol. Et saisir un pli de la peau en face d’une source de lumière. Placez la ligne médiane de la double couche de peau à l’endroit où la chambre de titane sera implantée.Et cranially et caudally fixer le pli de la peau avec une suture en polypropylène. Serrer l’autre côté de la suture sur une grille métallique pour soulever la peau pliée. Et ajustez la hauteur de la grille pour permettre à la souris de s’asseoir confortablement.Suture le premier cadre de la chambre de titane par sutures de polypropylène sur elle bord supérieur à l’arrière du pli de la peau dorsale. Après la reconfirmation de la sedation utiliser des ciseaux fins pour faire de petites incisions dans la peau. Et passer les deux vis de connexion attachées à la première moitié de la chambre de titane à travers la base du pli de la peau.Retirez la souris de la grille et placez l’animal dans une position latérale. Placez la deuxième moitié gratuite de la chambre en titane sur les 3 vis de raccordement. Et appliquez manuellement une légère pression pour passer ces vis à travers la seconde moitié du cadre en titane.La couche de peau pliée est maintenant prise en sandwich entre les deux moitiés symétriques du cadre en titane. Fixez ensuite les deux parties symétriques avec des écrous en acier inoxydable. À l’aide d’un poinçon normalisé de biopsie de 2 mL de diamètre, marquer la zone de la plaie au centre de la peau, dans la fenêtre d’observation de la chambre pliante de la peau.Et utilisez des forceps fins et des ciseaux pour enlever l’épiderme et le derme entiers dans la marque. Pour créer une plaie circulaire. Nettoyez la plaie carrée de 3 ans et demi à 4 milometer avec 0,5 mL de salin de stérilisation.Et couvrez la plaie d’un couvre-verre. Utilisez la pince à anneau snap sur la chambre en titane pour fixer le coverslip en place. Et transférez immédiatement la souris au stade d’imagerie d’un stéréomicroscope.Puis l’image de la plaie à un grossissement 40X. Avant de placer la souris dans une cage avec surveillance jusqu’à la récupération complète. Après avoir créé une égratignure à l’aide d’une pointe de pipette de 200 micro litres comme démontré, dans cette expérience représentative, les cellules des deux génotypes ont migré dans la zone d’égratignure et fermé l’écart.La migration cellulaire a ensuite été quantifiée en pourcentage de la zone d’éraflure repeuplée par les cellules migrables 6 heures après l’exécution de l’égratignure. Par exemple, dans cette expérience, la migration des souffles de fibres déficientes Cav beta 3 a fermé la zone d’éraflure beaucoup plus tôt que les explosions de fibres provenant de souris de type sauvage. Pour confirmer l’effet dépendant de la bêta 3 cav observé dans les explosions de fibres déficientes cav beta 3, des explosions de fibres de type sauvage ont été transfectées avec du siRNA pour réguler vers le bas la protéine Cav beta 3.Les explosions de fibres traitées avec les siARN spécifiques de la bêta cav 3 se sont comportées comme des explosions de fibres déficientes bêta 3. Pour comparer la cicatrisation des plaies cutanées entre les deux génotypes, la zone de la plaie dans la chambre pliante de la peau a été photographiée directement après avoir été blessée. Et la blessure a été photographiée au cours des 2 semaines suivantes.La taille des blessures a été mesurée sur les images et la zone de la plaie, un jour donné a été exprimée comme, le pourcentage de la zone de la plaie initiale. Comme prévu, le taux de fermeture des plaies a été augmenté chez les souris déficientes Cav beta 3 par rapport aux témoins de type sauvage. Assurez-vous d’appliquer une pression égale sur la pointe pipette, pour chaque égratignure et de faire correspondre les rayures aux lignes marquées sur le fond de la plaque aussi étroitement que possible.La fenêtre d’observation de la chambre dorsale pliante de la peau peut être ouverte à tout moment pendant le processus de guérison. Permettant l’application topique de différents composés pharmacologiques actifs. Il est également possible d’exciser la zone blessée à différents stades du processus de guérison.Pour l’analyse biochimique ou histologique des protéines moléculaires.

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