Name: scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing
Uploaded: 2019-09-26T13:00:00
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Wir danken Dr. Petra Weissgerber und der Transgene Unit der SPF Tieranlage (Projekt P2 des SFB 894) der Medizinischen Fakultät und der Tiereinrichtung am Institut für Klinische und Experimentelle Chirurgie der Medizinischen Fakultät der Universität des Saarlandes, Homburg. Wir danken Dr. Andreas Beck für die kritische Lektüre des Manuskripts. Gefördert wurde die Studie von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, Projekt A3 bis A.B. und V.F.).

Alle Versuchsverfahren wurden in Übereinstimmung mit den Ethik-Regeln und den Tierschutzausschüssen des Saarlandes und der Universität des Saarlandes genehmigt und durchgeführt.
1 Primäre Zellkultur und siRNA-Transfektion
HINWEIS: Bei der beschriebenen Methode werden primäre Fibroblasten verwendet. Diese Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Wundheilung und Der Umgestaltung des Gewebes11. In diesem Experiment wurde das Cacnb...

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	<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li><li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing--aiming+for+perfect+skin+regeneration.">Wound healing--aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276, 75-81 (1997).</li><li>Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+actin+cytoskeleton+during+early+endothelial+regeneration+in+vitro.">Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro.</a> Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).</li><li>Belkacemi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP3+Receptor-Dependent+Cytoplasmic+Ca(2+)+Signals+Are+Tightly+Controlled+by+Cavbeta3.">IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3.</a> Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).</li><li>Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healing+of+partial+thickness+porcine+skin+wounds+in+a+liquid+environment.">Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment.</a> Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).</li><li>Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+wounds+in+the+MRL/MPJ+mouse+heal+with+scar.">Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar.</a> Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).</li><li>Vagesjo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+in+mice+by+on-site+production+and+delivery+of+CXCL12+by+transformed+lactic+acid+bacteria.">Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria.</a> Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).</li><li>Eming, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+closure+in+mice+deficient+for+interleukin-10.">Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10.</a> American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).</li><li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber.">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).</li><li>Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dorsal+skinfold+chamber:+window+into+the+dynamic+interaction+of+biomaterials+with+their+surrounding+host+tissue.">The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue.</a> European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).</li><li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration.">Cell migration.</a> Comprehensive Physiology. 2, 2369-2392 (2012).</li><li>Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Alternative+Functions+for+the+Auxiliary+Subunits+of+the+Voltage-Gated+Calcium+Channels.">Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels.</a> Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+4.1G+Regulates+Cell+Adhesion,+Spreading,+and+Migration+of+Mouse+Embryonic+Fibroblasts+through+the+beta1+Integrin+Pathway.">Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).</li><li>Dewor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+migration+inhibitory+factor+(MIF)+promotes+fibroblast+migration+in+scratch-wounded+monolayers+in+vitro.">Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro.</a> FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).</li><li>Handly, L. N., Wollman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound-induced+Ca(2+)+wave+propagates+through+a+simple+release+and+diffusion+mechanism.">Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism.</a> Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).</li><li>Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+In+Vitro+Wound+Healing+Assay+to+Evaluate+Cell+Migration.">A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), 56825 (2018).</li><li>Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular+and+Affordable+Time-Lapse+Imaging+and+Incubation+System+Based+on+3D-Printed+Parts,+a+Smartphone,+and+Off-The-Shelf+Electronics.">A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics.</a> PLoS One. 11, 0167583 (2016).</li><li>Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+adhesion+and+migration.">Endothelial cell adhesion and migration.</a> Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).</li><li>Treloar, K. K., Simpson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+of+edge+detection+methods+for+quantifying+cell+migration+assays.">Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays.</a> PLoS One. 8, 67389 (2013).</li><li>Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+starvation:+caveat+emptor.">Serum starvation: caveat emptor.</a> American Journal of Physiology-Cell Physioliology. 301, 272-279 (2011).</li><li>Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+access+chamber+for+the+rat+dorsal+skin+fold.">A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold.</a> Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).</li><li>Deoliveira, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ear+punch+model+for+studying+the+effect+of+radiation+on+wound+healing.">An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing.</a> International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).</li><li>Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+excisional+wound+model:+Contraction+revisited.">The murine excisional wound model: Contraction revisited.</a> Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).</li><li>Dunn, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+wound+healing.">Murine model of wound healing.</a> Journal of Visualized Experiment. (75), e50265 (2013).</li><li>Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juglone+ameliorates+skin+wound+healing+by+promoting+skin+cell+migration+through+Rac1/Cdc42/PAK+pathway.">Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway.</a> Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).</li></ol>

In diesem Manuskript beschreiben wir einen in vitro und in vivo Wundheilungstest und korrelieren die erzielten Ergebnisse. Für den In-vitro-Test verwendeten wir primäre Maus-Fibroblasten4,14,15, die eine wichtige Rolle bei der Wundheilung und Gewebeumgestaltung11spielen. Andere anhängliche Zelltypen, die als Monolayer wachsen (z. B. Epithelzellen, Endothelzellen, Keratinozyten), können ebenfalls verwe...

Die Wundheilung der Haut beginnt unmittelbar nach der Hautverletzung, um die Integrität der Haut wiederherzustellen und den Organismus vor Infektionen zu schützen. Der Wundheilungsprozess durchläuft vier überlappende Phasen; Gerinnung, Entzündung, neue Gewebebildung und Gewebeumbau1. Die Zellmigration ist in diesen Phasen von entscheidender Bedeutung. Entzündliche Zellen, Immunzellen, Keratinozyten, Endothelzellen und Fibroblasten werden zu verschiedenen Zeitpunkten aktiviert und dringen in den Wundbereichein 2. Methoden zur Untersuchung der Wundheilung in vitro und in vivo sind von großem Interesse, nicht nur um die zugrunde liegenden Mechanismen zu verstehen, sondern auch um neue Medikamente zu testen und neue Strategien zu entwickeln, die darauf abzielen, die Wundheilung der Haut zu verbessern und zu beschleunigen.
Zum Überwachen und Analysieren der Zellmigration kann der Scratch-Migrationstest verwendet werden. Es wird oft als in vitro Wundheilung assay bezeichnet. Diese Methode erfordert eine Zellenkultureinrichtung3. Es ist ein einfaches Verfahren, es gibt keine Notwendigkeit für High-End-Ausrüstung und der Assay kann in den meisten zellbiologischen Laboratorien durchgeführt werden. Bei diesem Test entsteht ein zellfreier Bereich durch die mechanische Störung einer Konfluentzellmonoschicht, vorzugsweise epitheliale oder endotheliale Zellen oder Fibroblasten. Zellen am Rand des Kratzers werden migriert, um die erstellte Lücke wieder aufzufüllen. Die Quantifizierung des abnehmenden zellfreien Bereichs im Zeitverlauf ähnelt der Migrationsrate und gibt die Zeit an, die die Zellen benötigen, um die Lücke zu schließen. Zu diesem Zweck können die Forscher entweder akut isolierte Zellen von WT-Mäusen oder Mäusen ohne ein Gen von Interesse4oder verewigte Zellen aus zuverlässigen Zellrepositorien verwenden. Der Kratztest ermöglicht die Untersuchung des Einflusses pharmakologisch aktiver Verbindungen oder der Wirkung transfizierter cDNAs oder siRNAs auf die Zellmigration.
In vivo ist die Wundheilung ein komplexer physiologischer Prozess, der verschiedene Zelltypen wie Keratinozyten, Entzündungszellen, Fibroblasten, Immunzellen und Endothelzellen erfordert, um die körperliche Unversehrtheit der Haut so schnell wie möglich wiederherzustellen1 . Verschiedene Methoden zur Erforschung der In-vivo-Wundheilung wurden in denletzten5,6,7,8entwickelt und angewendet. Die in diesem Artikel beschriebene dorsale Hautfaltenkammer wurde zuvor für Die Wundheilungstests9verwendet. Es wird als modifiziertes dorsales Hautfaltenkammerpräparat für Mäuse verwendet. Das modifizierte Skinfold-Kammermodell hat mehrere Vorteile. 1) Es minimiert die Hautkontraktion, was die Beobachtung des Wundheilungsprozesses verhindert und die Wundreparatur bei Mäusen beeinflussen kann. 2) Diese Kammer nutzt die Abdeckung der Wunde mit einem Glasdeckel, Verringerung von Gewebeinfektionen und Austrocknung, die den Heilungsprozess verzögern könnte. 3) Blutfluss und Vaskularisation können direkt überwacht werden. 4) Es ermöglicht die repetitive topische Anwendung von pharmakologisch aktiven Verbindungen und Reagenzien, um die Wunde zu behandeln und die Heilung zu beschleunigen9,10.
Wir identifizierten die Untereinheit 3 von hochspannungsgeschlossenen Kalziumkanälen (Cav3) als potenzielles Zielmolekül, um die Wundheilung der Haut mit zwei unabhängigen Protokollen zu beeinflussen, d.h. dem In-vitro-Scratch-Migration-Assay und dem in vivo dorsalen Hautfaltenkammermodell. Für den In-vitro-Test verwendeten wir primäre Fibroblasten, diese Zellen exprimieren zwar das Cacnb3-Gen, das für das Cav3-Protein kodiert, aber es fehlt an Depolarisations-induzierten Ca2+-Zufluss- oder spannungsabhängigen Ca2+-Strömen. Wir beschrieben eine neuartige Funktion von Cav3 in diesen Fibroblasten: Cav3 bindet an den Inositol 1,4,5-Trisphosphat-Rezeptor (IP3R) und schränkt die Calciumfreisetzung aus dem endoplasmatischen Retikulum ein. Die Deletion des Cacnb3-Gens bei Mäusen führt zu einer erhöhten Empfindlichkeit des IP3R für IP3, einer verbesserten Zellmigration und einer erhöhten Hautwundreparatur4.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9 % NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Kai Industries</td>
			<td>48201</td>
			<td>2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297)</td>
			<td>Origene</td>
			<td>SR415626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilation cream</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any depilation cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>3400935940179.00</td>
			<td>(BEPANTHEN)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine)</td>
			<td>Bayer Health Care</td>
			<td></td>
			<td>Rompun 2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagon full nut</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>KETASET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Keyence, Osaka, Japan</td>
			<td>BZ-8000</td>
			<td>Similar microscopes might be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse restrainer</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>plan apo 10x/0.45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene sutures</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwdriver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin disinfectant (octeniderm)</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH</td>
			<td>118212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted cheese head screw</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap ring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap ring plier</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope with camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica M651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium frames for the skinfold chamber</td>
			<td>IROLA</td>
			<td>160001</td>
			<td>Halteblech M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire piler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing

Die zahngeschädigte Wundheilung ist ein großes Anliegen für Patienten mit Diabetes und für ältere Menschen, und es besteht bedarf einer wirksamen Behandlung. Geeignete In-vitro- und In-vivo-Ansätze sind für die Identifizierung neuer Zielmoleküle für medikamentöse Behandlungen unerlässlich, um den Wundheilungsprozess der Haut zu verbessern. Wir identifizierten die Untereinheit 3 von spannungsgebundenen Kalziumkanälen (Cav3) als potenzielles Zielmolekül, um die Wundheilung in zwei unabhängigen Assays zu beeinflussen, d.h. dem In-vitro-Scratch-Migration-Assay und dem in vivo dorsalen Hautfaltenkammermodell. Primäre mausembryonale Fibroblasten (MEFs) akut isoliert aus Wildtyp (WT) undCav3-defizienten Mäusen(Cav3 KO) oder Fibroblasten, die akut von mit siRNA behandelten WT-Mäusen isoliert wurden, um die Expression des Cacnb3-Gens zu regulieren , kodierte Cav3,wurden verwendet. Auf eine konfluente Zellmonoschicht wurde ein Kratzer aufgebracht, und auf den Lückenschluss folgten mikroskopische Bilder zu definierten Zeitpunkten bis zur vollständigen Wiederbesiedlung der Lücke durch die wandernden Zellen. Diese Bilder wurden analysiert, und die Zellmigrationsrate wurde für jede Bedingung bestimmt. In einem In-vivo-Test implantierten wir eine dorsale Hautfaltenkammer auf WT- und Cav3 KO-Mäuse, legten eine definierte kreisförmige Wunde von 2 mm Durchmesser auf, bedeckten die Wunde mit einem Glasdeckel, um sie vor Infektionen und Austrocknung zu schützen, und überwachten den makroskopischen Wundverschluss. im Laufe der Zeit. Bei Cacnb3-Gen-mangelhaftenMäusen war der Wundverschluss deutlich schneller. Da die Ergebnisse der in vivo und der In-vitro-Assays gut korrelieren, kann der In-vitro-Assay für das Hochdurchsatz-Screening nützlich sein, bevor die In-vitro-Treffer des in vivo Wundheilungsmodells validiert werden. Was wir hier für Wildtyp-und Cav-3-defizienten Mäusen oder Zellen gezeigt haben, könnte auch für andere Moleküle als Cav3 gelten.

Der Kratzer-Assay wurde an einer Konfluentzellmonoschicht von Wildtyp- und 3-mangelhaften MEFs durchgeführt (Abbildung 1c). Nach dem Ausführen des "Kratzers" mit einer 200-L-Pipettenspitze wandern Zellen beider Genotypen in den Kratzbereich und schließen die Lücke. Die Bilder wurden nach 6, 10 und 30 h aufgenommen (Abbildung 1a). Die Zellmigration wurde als Prozentsatz quantifiziert (%) der Kratzerfläche neu bevölkert durc...

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Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Hier stellen wir ein Protokoll für einen In-vitro-Scratch-Assay mit primären Fibroblasten und für einen in vivo Hautwundheilungstest bei Mäusen vor. Beide Assays sind einfache Methoden zur Beurteilung der In-vitro- und In-vivo-Wundheilung.

Scratch Migration Assay und Dorsal Skinfold Kammer für In Vitro und In Vivo Analyse der Wundheilung

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

Die Aufständischen brauchen die Behandlung von Hautwunden. Um Ihre Zielmoleküle für medikamentöse Behandlungen zu identifizieren, sind In-vitro- und In-vivo-Testsysteme erforderlich. Geeignete Systeme sind der In-vitro-Scratch-Assay und die in vivo dorsale Hautfaltkammer.Beides sind geradlinige Verfahren zur Überwachung der Zellmigration und der Wundheilung der Haut, in Abwesenheit und Vorhandensein von pharmakologisch aktiven Verbindungen. Obwohl beide Techniken geradlinig sind, sollten die Ermittler die Kratzeranwendung üben. Und die dorsale Hautfaltenkammerimplantation, und Wundung, um zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten.Die Demonstration der Verfahren wird von Dr. Matthias Laschke, Chirurg und Professor am Institut für klinische und experimentelle Chirurgie, durchgeführt. Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, verwenden Sie einen ultrafeinen permanenten Marker, um eine sechs Well-Platte pro Zelltyp zu markieren, mit einer horizontalen Linie an der Unterseite jedes Brunnens, um den Kratzbereich für jede Kultur zu markieren. Next Platte Primärfaser Explosionen isoliert von wilden Typ und Beta 3 mangelhafte Mäuse, in einer sechs Brunnenplatte bei einem 5 mal 10 bis die fünfte Faser Explosionen pro Brunnen Konzentration.In 2 ml DMEM ergänzt mit 10%fetalem Rinderserum. Beschriften Sie die Platten mit Zelltyp, Genotyp und Datum. Und legen Sie die Platten in den Zellkultur-Inkubator für 24 Stunden.Am nächsten Morgen fügen Sie 9 Mikroliter jedes lipidbasierten Transfektionsreagenz von Interesse, einzelne Mikrozentrifugenrohre mit 150 Mikroliter reduzierts Serummedium pro Tube. Fügen Sie 1,5 Mikroliter siRNA zu einem zweiten Mikrozentrifugenrohr pro Transfektionsreagenz hinzu, das 150 Mikroliter reduziertes Serummedium pro Tube enthält. Und mischen Sie jede siRNA-Lösung mit einer einzigen Röhre Transfektionsreagenzlösung.Nach kurzwirbeln der Mischungen bei 21 Grad Celsius für 5 Minuten. Während der Inkubation sorgfältig ersetzen Sie das Supernate in jedem Brunnen. Mit 2,25mL frisches Kulturmedium auf der Seite der Brunnen.Am Ende der Inkubation 250 Mikroliter der entsprechenden siRNA-Transfektionsreagenzmischung hinzufügen, weise in jeden entsprechenden Bohrkörper der Zellen fallen lassen. Und geben Sie die Platten für 72 Stunden an den Zellkultur-Inkubator zurück. Wenn die Zellen 100% Konfluenz erreicht haben, entsorgen Sie den Kulturüberstand aus jedem Brunnen.Und verwenden Sie eine 200 Mikroliter Pipettenspitze, um Kratzer in der konfluenten Zellmonolayer zu schaffen. Vertikal zur markierten horizontalen Linie am unteren Rand jedes Brunnens. Dann sorgfältig spülen sie jede verwundet e2 mal mit 2ml PPS pro Wäsche gut.Um freigesetzte Faktoren aus den beschädigten Zellen, losen Zellen oder Ablagerungen aus dem zerkratzten Bereich zu entfernen. Nach der zweiten Wäsche fügen Sie 2ml Frischzellenkultur Medium mit 1 oder 10 Prozent Serum zu jedem Brunnen ergänzt. Und nehmen Sie Bilder der Wunden in jeder Platte auf der Bühne eines Lichtmikroskops auf.Unmittelbar nach dem Kratzen bei einer 10-fachen Vergrößerung. Dann geben Sie die Platte an den Zellkultur-Inkubator zurück. Fortsetzung der Aufnahme von Bildern zu den entsprechenden experimentellen Zeitpunkten für die nächsten 30 Stunden.Am Ende des Experiments quantifizieren Sie den anfänglichen zellfreien Bereich und den verbleibenden Bereich nach 6, 10 und 30 Stunden Kultur. Bestimmen Sie den Prozentsatz des Scratch-Bereichs, der von den migrierenden Zellen relativ zum ursprünglichen Scratch-Bereich neu aufgefüllt wird. Nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Zehenkneifen, in der wilden Art oder Beta drei Knockout C57 schwarze sechs Maus, vorsichtig rasieren Sie das Dorsum.Und Salbe auf die Augen des Tieres auftragen. Tragen Sie Enthaarungscreme auf, um verbleibende Haare zu entfernen. Entfernen Sie die Creme nach 10 Minuten.Um die Titankammer vorzubereiten, befestigen Sie einen Teil des symmetrischen Titankammerrahmens mit den Verbindungsschrauben mit Muttern. Zur Aufrechterhaltung von 400 bis 500 Mikrometern zwischen den beiden symmetrischen Teilen der Kammer. Um eine Kompression der Blutbläschen in der Haut zu vermeiden.Desinfizieren Sie die exponierte Haut mit 70% Ethanol. Und greifen Sie eine Hautfalte vor einer Lichtquelle. Positionieren Sie die Mittellinie der doppelten Hautschicht an der Stelle, an der die Titankammer implantiert wird.Und kranially und kauarisch die Hautfalte mit einer Polypropylen-Nähte fixieren. Ziehen Sie die andere Seite der Naht auf einem Metallgestell an, um die gefaltete Haut zu heben. Und stellen Sie die Höhe des Racks ein, damit die Maus bequem sitzen kann.Bedecken Sie den ersten Rahmen der Titankammer durch Polypropylen-Nähte auf ihr überlegene Kante zur Rückseite der dorsalen Hautfalte. Nach der erneuten Sedierung verwenden Sie feine Schere, um kleine Schnitte in der Haut zu machen. Und passieren Sie die beiden Verbindungsschrauben, die an der ersten Hälfte der Titankammer befestigt sind, durch die Basis der Hautfalte.Entfernen Sie die Maus aus dem Rack, und legen Sie das Tier in eine seitliche Position. Legen Sie die zweite kostenlose Hälfte der Titankammer auf die 3 Verbindungsschrauben. Und manuell leichten Druck ausüben, um diese Schrauben durch die zweite Hälfte des Titanrahmens zu passieren.Die gefaltete Hautschicht ist nun zwischen den beiden symmetrischen Hälften des Titanrahmens eingeklemmt. Dann beide symmetrischen Teile mit Edelstahlmuttern fixieren. Markieren Sie mit einem standardisierten Biopsie-Punch mit 2 ml Durchmesser den Wundbereich in der Hautmitte innerhalb des Beobachtungsfensters der Hautfaltkammer.Und verwenden Sie feine Zangen und Scheren, um die gesamte Epidermis und Dermis innerhalb der Marke zu entfernen. Um eine kreisförmige Wunde zu erstellen. Reinigen Sie die 3einhalb bis viereinhalb Meter quadratische Wunde mit 0,5 ml steriler Saline.Und bedecken Sie die Wunde mit einem Glasdeckel. Verwenden Sie die Schnappringzange an der Titankammer, um den Deckelschlupf an Ort und Stelle zu fixieren. Und übertragen Sie die Maus sofort auf die Bildstufe eines Stereomikroskops.Dann stellen Sie die Wunde bei einer 40-fachen Vergrößerung ab. Bevor Sie die Maus in einen Käfig mit Überwachung bis zur vollständigen Wiederherstellung. Nachdem ein Kratzer mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze erstellt wurde, wie in diesem repräsentativen Experiment gezeigt wurde, wanderten Zellen beider Genotypen in den Kratzbereich und schlossen die Lücke.Die Zellmigration wurde dann als Prozentsatz der Scratch-Fläche quantifiziert, die 6 Stunden nach dem Durchführen des Scratchs durch migrierende Zellen neu aufgefüllt wurde. In diesem Experiment wurde z. B. cav beta 3-Mangelfaserstrahlen den Kratzbereich deutlich früher geschlossen als Faserstrahlen von Wildtypmäusen. Um den Cav beta 3 abhängigen Effekt zu bestätigen, der in Cav beta 3-Mangelfaserstrahlen beobachtet wurde, wurden Wild-Typ-Faserstrahlen mit siRNA transfiziert, um das Cav beta 3 Protein zu regulieren.Faserstrahlen, die mit den Cav beta 3 spezifischen siRNAs behandelt wurden, verhielten sich wie Beta-3-Mangelfaserstrahlen. Um die Wundheilung der Haut zwischen beiden Genotypen zu vergleichen, wurde der Wundbereich in der Hautfaltkammer direkt nach der Wunde fotografiert. Und die Wunde wurde in den nächsten 2 Wochen abgebildet.Die Größe der Wunden wurde auf den Bildern und der Wundfläche gemessen, an einem bestimmten Tag wurde als prozentsatz der ursprünglichen Wundfläche ausgedrückt. Wie erwartet wurde die Rate des Wundverschlusses bei Cav beta 3-Mäusen mit Mangelanmäusen im Vergleich zu Wildtypkontrollen erhöht. Achten Sie darauf, gleichen Druck auf die Pipette Spitze, für jeden Kratzer zu üben und die Kratzer an die markierten Linien auf dem Plattenboden so nah wie möglich zu entsprechen.Das Beobachtungsfenster der dorsalen Hautfaltkammer kann jederzeit während des Heilungsprozesses geöffnet werden. Die topische Anwendung verschiedener pharmakologisch aktiver Verbindungen ermöglicht. Es ist auch möglich, den verwundeten Bereich in verschiedenen Stadien des Heilungsprozesses zu verbrauchen.Für molekulare Proteinbiochemische oder histologische Analysen.

Research

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