Name: scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing
Uploaded: 2019-09-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing at JoVE.com

אנו מודים לד ר פטרה וייסגרבר ויחידת הטרנסגנים של מתקן בעל חיים SPF (פרויקט P2 של SFB 894) של הפקולטה לרפואה ומתקן בעלי חיים במכון לכירורגיה קלינית וניסויית בפקולטה לרפואה של אוניברסיטת זארלנד, באד ומבורג. אנחנו מודים לד ר אנדראס בק. על קריאה קריטית בכתב היד מחקר זה מומן על ידי הגרמני הפורשיגומיייסמייססביםבבריזאג (DFG) Sonderforschsברםץ (SFB) 894, פרויקט A3 כדי א יהושע ו V.F.).

כל ההליכים הניסיוניים אושרו והוצעו בהתאם לתקנות האתיקה ולוועדות הרווחה של בעלי החיים באוניברסיטת זארלנד.
1 תרבות התא הראשי ומעבר הסינא
הערה: בשיטה המתוארת, נעשה שימוש בפיברותקיעות ראשיים. תאים אלה לשחק תפקיד מכריע בריפוי פצע ושיפוץ רקמות11. בניסו?...

<ol>
	<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li><li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing--aiming+for+perfect+skin+regeneration.">Wound healing--aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276, 75-81 (1997).</li><li>Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+actin+cytoskeleton+during+early+endothelial+regeneration+in+vitro.">Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro.</a> Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).</li><li>Belkacemi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP3+Receptor-Dependent+Cytoplasmic+Ca(2+)+Signals+Are+Tightly+Controlled+by+Cavbeta3.">IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3.</a> Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).</li><li>Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healing+of+partial+thickness+porcine+skin+wounds+in+a+liquid+environment.">Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment.</a> Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).</li><li>Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+wounds+in+the+MRL/MPJ+mouse+heal+with+scar.">Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar.</a> Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).</li><li>Vagesjo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+in+mice+by+on-site+production+and+delivery+of+CXCL12+by+transformed+lactic+acid+bacteria.">Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria.</a> Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).</li><li>Eming, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+closure+in+mice+deficient+for+interleukin-10.">Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10.</a> American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).</li><li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber.">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).</li><li>Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dorsal+skinfold+chamber:+window+into+the+dynamic+interaction+of+biomaterials+with+their+surrounding+host+tissue.">The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue.</a> European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).</li><li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration.">Cell migration.</a> Comprehensive Physiology. 2, 2369-2392 (2012).</li><li>Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Alternative+Functions+for+the+Auxiliary+Subunits+of+the+Voltage-Gated+Calcium+Channels.">Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels.</a> Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+4.1G+Regulates+Cell+Adhesion,+Spreading,+and+Migration+of+Mouse+Embryonic+Fibroblasts+through+the+beta1+Integrin+Pathway.">Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).</li><li>Dewor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+migration+inhibitory+factor+(MIF)+promotes+fibroblast+migration+in+scratch-wounded+monolayers+in+vitro.">Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro.</a> FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).</li><li>Handly, L. N., Wollman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound-induced+Ca(2+)+wave+propagates+through+a+simple+release+and+diffusion+mechanism.">Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism.</a> Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).</li><li>Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+In+Vitro+Wound+Healing+Assay+to+Evaluate+Cell+Migration.">A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), 56825 (2018).</li><li>Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular+and+Affordable+Time-Lapse+Imaging+and+Incubation+System+Based+on+3D-Printed+Parts,+a+Smartphone,+and+Off-The-Shelf+Electronics.">A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics.</a> PLoS One. 11, 0167583 (2016).</li><li>Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+adhesion+and+migration.">Endothelial cell adhesion and migration.</a> Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).</li><li>Treloar, K. K., Simpson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+of+edge+detection+methods+for+quantifying+cell+migration+assays.">Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays.</a> PLoS One. 8, 67389 (2013).</li><li>Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+starvation:+caveat+emptor.">Serum starvation: caveat emptor.</a> American Journal of Physiology-Cell Physioliology. 301, 272-279 (2011).</li><li>Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+access+chamber+for+the+rat+dorsal+skin+fold.">A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold.</a> Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).</li><li>Deoliveira, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ear+punch+model+for+studying+the+effect+of+radiation+on+wound+healing.">An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing.</a> International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).</li><li>Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+excisional+wound+model:+Contraction+revisited.">The murine excisional wound model: Contraction revisited.</a> Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).</li><li>Dunn, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+wound+healing.">Murine model of wound healing.</a> Journal of Visualized Experiment. (75), e50265 (2013).</li><li>Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juglone+ameliorates+skin+wound+healing+by+promoting+skin+cell+migration+through+Rac1/Cdc42/PAK+pathway.">Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway.</a> Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).</li></ol>

בכתב יד זה, אנו מתארים בתוך מבחנה ובvivo הריפוי הפצע ולתאם את התוצאות שהתקבלו. עבור שיטת מחוץ גופית, השתמשנו בעכבר הראשי פיברופיצוצים4,14,15 אשר לשחק תפקיד חשוב בריפוי פצע ושיפוץ רקמה11. סוגים אחרים של תאים החסיד גדל כמו monolayers (למשל...

ריפוי בעור הפצע מתחיל מיד לאחר פגיעת העור כדי לשחזר את שלמות העור כדי להגן על האורגניזם מפני זיהומים. תהליך הריפוי בפצע עובר ארבעה שלבים חופפים; קרישה, דלקת, מבנה רקמות חדש ושיפוץ רקמות1. העברת תאים היא קריטית במהלך שלבים אלה. תאים דלקתיים, תאים חיסוניים, keratinocytes, תאים אנדותל, ופיברופיצוצים מופעלים בנקודות זמן שונות לפלוש לאזור הפצע2. שיטות לחקור ריפוי הפצע בתוך מבחנה ובvivo הם עניין גדול לא רק להבין את המנגנונים הבסיסיים אלא גם כדי לבדוק תרופות חדשות לפתח אסטרטגיות חדשות במטרה שפר ולהאיץ ריפוי פצע העור.
כדי לנטר ולנתח העברת תאים, ניתן להשתמש ביכולות העברת הטיוטה. הוא מכונה לעתים קרובות שיטת הריפוי של הפצע מתורבת. שיטה זו מחייבת מתקן תרבית תאים3. זהו הליך פשוט, אין צורך של ציוד high-end ואת הטיפול ניתן לבצע ברוב מעבדות ביולוגיה התא. בצורה זו, שטח נטול תאים נוצר על-ידי הפרעה מכנית של מונאולייר תא מאגד, רצוי לתאים אפיתל או לתאי האנדותל. תאים בשולי השריטה יועברו כדי לאכלס מחדש את הפער שנוצר. הקוונפיקציה של האזור היורד ללא תא לאורך זמן דומה לקצב ההעברה ומציין את הזמן, אשר התאים צריכים לסגור את הפער. למטרה זו, החוקרים יכולים להשתמש בתאים מבודדים בחריפות מעכברים WT או עכברים חסר גן של ריבית4, או תאים מונצח זמין ממאגרי תאים אמינים. שיטת הגירוד מאפשרת ללמוד את ההשפעה של תרכובות פעילות פרמקולוגית או השפעה של cDNAs או siRNAs בהעברת תאים.
ב vivo, ריפוי הפצע הוא תהליך פיזיולוגי מורכב, המחייב סוגי תאים שונים כולל keratinocytes, תאים דלקתיים, פיברותקיעות, תאים חיסוניים ותאי האנדותל כדי לשחזר את היושרה הפיזית של העור מהר ככל האפשר1 . שיטות שונות ללמוד בריפוי vivo פצעים פותחו ובשימוש בעבר5,6,7,8. תא העור המתקפל שמתואר במאמר זה שימש בעבר לריפוי הפצע בחני9. הוא משמש כהכנה לחדר השינה שהשתנה לעכברים. המודל הקאמרי המתוקן של העור יש מספר יתרונות. 1) זה ממזער את התכווצות העור, אשר מונע התבוננות בתהליך הריפוי הפצע עלול להשפיע על תיקון הפצע בעכברים. 2) החדר הזה עושה שימוש בכיסוי הפצע בעזרת שמיכות זכוכית, הפחתת דלקות רקמות והתייבשות, דבר שעלול לעכב את תהליך ההחלמה. 3) זרימת הדם והvascularization יכולים להיות מנוטרים ישירות. 4) זה מאפשר יישום מקומי חוזרות של תרכובות פעילים פרמקוולוגית וריאגנטים כדי לטפל בפצע ולהאיץ את הריפוי9,10.
זיהינו את β3 יחידת של ערוצי סידן מגודרת מתח גבוה (Cavβ3) כמולקולה היעד הפוטנציאלי כדי להשפיע על ריפוי הפצע בעור באמצעות שני פרוטוקולים עצמאיים, כלומר, הגירה בלתי מתורבת ההגירה והוא במודל הקאמרית הvivo. עבור שיטת מחוץ גופית, השתמשנו בגידולים הראשוניים, תאים אלה מבטאים את Cacnb3 Gene קידוד Cavβ3 חלבון אבל חסר depolarization המושרה ca2 + זרם או תלוי מתח ca2 + זרמים. תיארנו פונקציה הרומן של Cavβ3 בפיברופיצוצים אלה: Cavβ3 נקשר ל-אינוזיטול 1, 4, 5-trisp, שנאת קולטן (IP3R) ואילוצים שחרור סידן מתוך רשתית רשתית פלזמית. מחיקת הגן Cacnb3 בעכברים מוביל רגישות מוגברת של IP3R עבור IP3, הגירה תא משופר ומוגברת תיקון פצע העור4.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9 % NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Kai Industries</td>
			<td>48201</td>
			<td>2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297)</td>
			<td>Origene</td>
			<td>SR415626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilation cream</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any depilation cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>3400935940179.00</td>
			<td>(BEPANTHEN)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine)</td>
			<td>Bayer Health Care</td>
			<td></td>
			<td>Rompun 2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagon full nut</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>KETASET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Keyence, Osaka, Japan</td>
			<td>BZ-8000</td>
			<td>Similar microscopes might be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse restrainer</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>plan apo 10x/0.45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene sutures</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwdriver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin disinfectant (octeniderm)</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH</td>
			<td>118212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted cheese head screw</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap ring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap ring plier</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope with camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica M651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium frames for the skinfold chamber</td>
			<td>IROLA</td>
			<td>160001</td>
			<td>Halteblech M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire piler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing

ריפוי בפצע העור לקוי הוא דאגה משמעותית למטופלים הסובלים מסוכרת ולקשישים, ויש צורך בטיפול אפקטיבי. מתאים מחוץ לגוף ובגישות vivo חיוניים לזיהוי מולקולות היעד החדש לטיפול תרופתי כדי לשפר את תהליך הריפוי של הפצע בעור. זיהינו את β3 יחידת של ערוצי סידן מגודרת מתח (Cavβ3) כמולקולה היעד הפוטנציאלי להשפיע על ריפוי הפצע בשני assays עצמאית, כלומר, בשנת הגירה הפריה חוץ גופית ואת המודל הקאמרית vivo העור מתקפל. העכבר העיקרי פיברותקיעות (MEFs) מבודדים בחריפות מן פראי סוג (WT) ו קוβ3-עכברים לקוי (קוβ3 KO) או פיברותקיעות בודד בבידוד מן העכברים WT שטופלו עם sirna למטה-לווסת את הביטוי של הגן Cacnb3 , קידוד קוβ3, שימשו. שריטה הוחלה על מונאולייר תא שוטף וסגירת הפער החלה בעקבות התמונות המיקרוסקופית בנקודות הזמן המוגדרות עד להשלמת האוכלוסיה המלאה של הפער על ידי התאים הנודדים. תמונות אלה נותחו, ושיעור העברת התא נקבע עבור כל תנאי. In in בvivo, השתלנו חדר מתקפל העור על WT ו Cavβ3 KO, להחיל פצע עגול מוגדר של קוטר 2 מ"מ, כיסו את הפצע עם שמיכות זכוכית כדי להגן עליו מפני זיהומים והתייבשות, ופיקוח על סגירת הפצע מאקרוסקופי עם הזמן סגירת הפצע הייתה מהירה באופן משמעותי בעכברים Cacnb3-gene. מכיוון שהתוצאות של הvivo ומחוץ למבחנה מספר מתאם היטב, הטיפול במבחנה עשוי להיות שימושי עבור הקרנת תפוקה גבוהה לפני אימות הפגיעות מחוץ גופית על ידי במודל ריפוי vivo פצע. מה שאנחנו הראו כאן לסוג פראי ו-קוβ3-לקוי עכברים או תאים עשוי להיות גם ישים עבור מולקולות ספציפיות מלבד Cavβ3.

שיטת השריטה בוצעה על מונאולייר של תאים מסוג פראי ובעלי מβ3 לקוי (איור 1ג). לאחר ביצוע "שריטה" באמצעות טיפ 200 μL הצינורות, תאים משני הגנוטיפים להגר לאזור הטיוטה ולסגור את הפער. תמונות צולמו לאחר 6, 10 ו 30 h (איור 1א). העברת תאים כמותית כאחוז (%) של אזו...

Watch this Scientific Journal Video about Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing at JoVE.com

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור התיקון שריטות מבחנה באמצעות הפיברוכדורים העיקריים עבור vivo העור הפצע הריפוי הטיפול בעכברים. שניהם מספר שיטות ברורות כדי להעריך בתוך מבחנה וריפוי פצעים vivo.

שיטת העברת שריטות וחדר מתקפל לחלל מתורבת בניתוח Vivo של ריפוי פצעים

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

הצורך המורדים לטיפול בפצעי עור. כדי לזהות את מולקולות היעד שלך לטיפולים תרופתיים, מערכות בדיקה במבחנה ו- in vivo נדרשות. המערכות המתאימות הן מוצ"ש השריטה במבחנה, ותא קיפול העור הגבי in vivo.שניהם הליכים ישר קדימה לניטור נדידת תאים וריפוי פצעי עור, בהיעדר נוכחות של תרכובות פעילות פרמקולוגית. למרות ששתי הטכניקות הן ישר קדימה, החוקרים צריכים לתרגל את יישום השריטה. ואת העור הגבי לקפל את התא השתלה, ופצע כדי להשיג תוצאות אמינות לשחזור.הדגמת ההליכים תב נעשה על ידי ד"ר מתיאס לאשקה, מנתח ופרופסור מהמכון לכירורגיה קלינית וניסיונית. לפני תחילת ההליך, השתמש בסמן קבוע דק במיוחד כדי לסמן לוח אחד של שש היטב לכל סוג תא, עם קו אופקי בתחתית כל באר כדי לסמן את אזור השריטה עבור כל תרבות. תקיעות הסיבים הראשיות של הצלחת הבאה מבודדות מסוג פראי ובטא 3 עכברים לקויים, בצלחת שש בארות ב 5 פעמים 10 כדי תקיעות סיבים החמישי לכל ריכוז היטב.ב 2mL של DMEM בתוספת 10% סרום חזיר עוברי. סמן את הלוחות עם סוג התא, הסוג והתאריך. ולמקום את הצלחות באינקובטור תרבות התא במשך 24 שעות.למחרת בבוקר להוסיף 9 ליטרים של כל דם מבוסס transfection reagent של עניין, לצינורות מיקרו צנטריפוגה בודדים המכילים 150 מיקרו ליטר של מדיום סרום מופחת לכל צינור. הוסף 1.5 ליטרים של siRNA לצינור מיקרו צנטריפוגה שני לכל ריאגנט transfection המכיל 150 מיקרו ליטר של מדיום סרום מופחת לכל צינור. ומערבבים כל פתרון siRNA עם צינור יחיד של פתרון ריאגנט transfection.לאחר מערבולת קצרה מניחים את תערובות ב 21 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. במהלך הדגירה בזהירות להחליף את supernate בכל באר. עם 2.25 מ"ל של תרבות טרייה בינונית בצד של בארות.בסוף הדגירה להוסיף 250 מיקרו ליטר של תערובת reagent transfection siRNA המתאים, טיפה חכמה לתוך כל באר תואמת של תאים. ולהחזיר את הצלחות לאינקובטור תרבות התא במשך 72 שעות. כאשר התאים הגיעו ל- 100%confluency, השלך את התרבות על-טבעית מכל באר.ולהשתמש טיפ פיפטה 200 מיקרו ליטר כדי ליצור שריטה במונוליאר התא confluent. אנכי לקו האופקי המסומן בתחתית כל באר. לאחר מכן לשטוף בזהירות כל פצוע גם 2 פעמים עם 2mL של PPS לכל לשטוף.כדי להסיר את כל הגורמים ששוחררו מהתאים הפגועים, תאים רופפים או פסולת מהאזור שרוט. לאחר לשטוף השני להוסיף 2mL של תאים טריים תרבות בינוני בתוספת 1 או 10 אחוז סרום לכל באר. וללכוד תמונות של הפצעים בכל צלחת על הבמה של מיקרוסקופ אור.מיד לאחר גירוד בהגדלה של פי 10. ואז להחזיר את הצלחת לאנקובטור תרבות התא. ממשיך ללכוד תמונות בנקודות הזמן הניסיוניות המתאימות במשך 30 השעות הבאות.בסוף הניסוי לכמת את האזור הראשוני ללא תאים ואת האזור הנותר לאחר 6, 10 ו 30 שעות של תרבות. כדי לקבוע את אחוז אזור האחסון מחדש של האחסון מחדש על-ידי התאים הנודדים ביחס לאזור האחסון ההתחלתי של האחסון. לאחר אישור חוסר תגובה לצביטת בוהן, בסוג הפראי או בטא שלוש נוקאאוט C57 שחור שישה עכבר, בזהירות לגלח את הגב.ולהחיל משחה על עיניו של החיה. החל קרם depilatory כדי לחסל את כל השיער שנותר. הסרת השמנת לאחר 10 דקות.כדי להכין את תא טיטניום, לתקן חלק אחד של מסגרת תא טיטניום סימטרי, עם ברגים חיבור עם אגוזים. כדי לשמור על 400 עד 500 מיקרומטר בין שני החלקים הסימטריים של התא. כדי למנוע דחיסה של וריתי הדם בעור.לחטא את העור החשוף עם 70% אתנול. ולתפוס קפל עור מול מקור אור. מקם את הקו האמצעי של השכבה הכפולה של העור למקום שבו יושתל תא הטיטניום.ולתקן בקרניות וב סיבתיות את קפל העור בתפר פוליפרופילן. הדק את הצד השני של התפר על מתלה מתכת כדי להרים את העור המקופל. ולהתאים את גובה המדף כדי לאפשר לעכבר לשבת בנוחות.תפר את המסגרת הראשונה של תא טיטניום על ידי תפרים פוליפרופילן על קצה מעולה על החלק האחורי של קפל העור הגבי. לאחר אישור מחדש של סם דם השתמש במספריים עדין כדי לבצע חתכים קטנים בעור. ולהעביר את שני הברגים המחברים המחוברים למחצית הראשונה של תא הטיטניום דרך בסיס קפל העור.מוציאים את העכבר מהמדף וממקם את החיה במצב משני. מניחים את החצי השני של תא טיטניום על גבי 3 ברגים מחברים. וגם ידנית להפעיל לחץ קל להעביר ברגים אלה דרך המחצית השנייה של מסגרת טיטניום.שכבת העור המקופלת דחוקה כעת בין שני החצאים הסימטריים של מסגרת הטיטניום. ואז לתקן את שני החלקים הסימטריים עם אגוזי נירוסטה. באמצעות אגרוף ביופסיה בקוטר 2 מ"ל, סמן את אזור הפצע במרכז העור, בתוך חלון התצפית של תא קפל העור.ולהשתמש מטסות ומספריים עדין כדי להסיר את האפידרמיס כולו ודרמיס בתוך הסימן. כדי ליצור פצע עגול. נקה את 3 וחצי ל 4 וחצי מילומטר מרובע פצע עם 0.5mL של תמיסת מלח סטרילית.ולכסות את הפצע עם כיסוי זכוכית. השתמש צבת טבעת הצמד על תא טיטניום כדי לתקן את כיסוי במקום. ומיד להעביר את העכבר לשלב ההדמיה של סטריאומיקרוסקופ.ואז תדמיין את הפצע בהגדלה של פי 40. לפני הנחת העכבר לתוך כלוב עם ניטור עד החלמה מלאה. לאחר יצירת שריטה באמצעות קצה פיפטה 200 מיקרו ליטר כפי שהודגם, בניסוי מייצג זה, תאים משני genotypes היגרו לאזור השריטה וסגר את הפער.לאחר מכן, העברת התאים כומתה כאחוז אזור האחסון מחדש על-ידי העברת תאים 6 שעות לאחר ביצוע הטיוטה. לדוגמה בניסוי זה העברת Cav beta 3 פיצוצי סיבים לקויים סגרה את אזור השריטה באופן משמעותי מוקדם יותר מאשר תקיעות סיבים מעכברים מסוג בר. כדי לאשר את האפקט התלוי Cav beta 3 נצפתה Cav beta 3 תקיעות סיבים לקוי, תקיעות סיבים מסוג בר נותבו עם siRNA למטה לווסת את בטא Cav 3 חלבון.תקיעות סיבים שטופלו בבטא Cav 3 siRNAs ספציפיים התנהגו כמו תקיעות סיבים לקויות של בטא 3. כדי להשוות את ריפוי פצעי העור בין שני הגנוטיפים, אזור הפצע בתא קפל העור צולם מיד לאחר הפציעה. והפצע תדמית במהלך השבועיים הבאים.מידות הפצעים נמדדו בתמונות ובתחום הפצעים, ביום נתון, בא לידי ביטוי כאחוז מאזור הפצע הראשוני. כצפוי, קצב סגירת הפצעים הוגדל בעכברים לקויים של Cav beta 3 בהשוואה לפקדים מסוג פראי. הקפד להפעיל לחץ שווה על קצה פיפטה, עבור כל שריטה כדי להתאים את השריטות על הקווים המסומנים בתחתית הצלחת מקרוב ככל האפשר.חלון התצפית של תא קיפול העור הגבי ניתן לפתוח בכל עת במהלך תהליך הריפוי. המאפשר את היישום אקטואלי של תרכובות פרמקולוגיות פעילות שונות. ניתן גם למלמל את האזור הפצוע בשלבים שונים של תהליך הריפוי.לניתוח ביוכימי או היסטולוגי של חלבונים מולקולריים.

Research

JoVE Journal

Medicine

Murine Model of Wound Healing

מודל עכברי של ריפוי פצע

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

העכברי אנדוסקופיה ל<em&gt; בVivo</em&gt; ריפוי Multimodal הדמיה של היווצרות הסרטן וההערכה של מעיים פצע ודלקת

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Ischemic Tissue Injury in the Dorsal Skinfold Chamber of the Mouse: A Skin Flap Model to Investigate Acute Persistent Ischemia

פגיעה ברקמות איסכמי בהגבו skinfold לשכת העכבר: דגם דש עור לחקור איסכמיה מתמיד חריפה

Despite profound expertise and advanced surgical techniques, ischemia-induced complications ranging from wound breakdown to extensive tissue necrosis are ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

חליטות עורק הראשי לpharmacokinetic וpharmacodynamic ניתוח של taxanes בעכברים

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

חסך בתאי עכבר מן xenografts גידול האנושי משפר משמעותי ניתוח במורד זרם של תאי יעד

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

פיתוח מודל ישיר מכסת-זול עבור הערכת pulpal ריפוי פצע גיבוש מתקנת הדנטין של עכברים

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

ניתוח אופטימלי של<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; כבדית steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

מיקרוסקופ המבוסס על שיטות להערכה של נדידת תאים אפיתל במהלך במבחנה ריפוי הפצע

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

אפיתל שחיקה הקרנית עם עינית Burr כמודל עבור קרנית ריפוי פצעים

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...