Name: scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing
Uploaded: 2019-09-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing at JoVE.com

हम डॉ पेट्रा Weissgerber और SPF पशु सुविधा के ट्रांसजीन इकाई (SFB 894 की परियोजना P2) चिकित्सा संकाय और Saarland विश्वविद्यालय, Homburg के चिकित्सा संकाय में नैदानिक और प्रायोगिक सर्जरी के संस्थान में पशु सुविधा धन्यवाद. हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ एंड्रियास बेक धन्यवाद. इस अध्ययन के लिए ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, परियोजना A3 से A.B. और V.F.) द्वारा वित्त पोषित किया गया था.

सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी और नैतिकता के नियमों और Saarland और Saarland विश्वविद्यालय के पशु कल्याण समितियों के अनुसार प्रदर्शन किया गया.
1 प्राथमिक सेल संस्कृति और siRNA transfection
न...

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	<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li><li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing--aiming+for+perfect+skin+regeneration.">Wound healing--aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276, 75-81 (1997).</li><li>Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+actin+cytoskeleton+during+early+endothelial+regeneration+in+vitro.">Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro.</a> Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).</li><li>Belkacemi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP3+Receptor-Dependent+Cytoplasmic+Ca(2+)+Signals+Are+Tightly+Controlled+by+Cavbeta3.">IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3.</a> Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).</li><li>Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healing+of+partial+thickness+porcine+skin+wounds+in+a+liquid+environment.">Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment.</a> Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).</li><li>Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+wounds+in+the+MRL/MPJ+mouse+heal+with+scar.">Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar.</a> Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).</li><li>Vagesjo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+in+mice+by+on-site+production+and+delivery+of+CXCL12+by+transformed+lactic+acid+bacteria.">Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria.</a> Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).</li><li>Eming, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+closure+in+mice+deficient+for+interleukin-10.">Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10.</a> American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).</li><li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber.">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).</li><li>Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dorsal+skinfold+chamber:+window+into+the+dynamic+interaction+of+biomaterials+with+their+surrounding+host+tissue.">The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue.</a> European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).</li><li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration.">Cell migration.</a> Comprehensive Physiology. 2, 2369-2392 (2012).</li><li>Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Alternative+Functions+for+the+Auxiliary+Subunits+of+the+Voltage-Gated+Calcium+Channels.">Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels.</a> Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+4.1G+Regulates+Cell+Adhesion,+Spreading,+and+Migration+of+Mouse+Embryonic+Fibroblasts+through+the+beta1+Integrin+Pathway.">Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).</li><li>Dewor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+migration+inhibitory+factor+(MIF)+promotes+fibroblast+migration+in+scratch-wounded+monolayers+in+vitro.">Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro.</a> FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).</li><li>Handly, L. N., Wollman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound-induced+Ca(2+)+wave+propagates+through+a+simple+release+and+diffusion+mechanism.">Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism.</a> Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).</li><li>Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+In+Vitro+Wound+Healing+Assay+to+Evaluate+Cell+Migration.">A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), 56825 (2018).</li><li>Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular+and+Affordable+Time-Lapse+Imaging+and+Incubation+System+Based+on+3D-Printed+Parts,+a+Smartphone,+and+Off-The-Shelf+Electronics.">A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics.</a> PLoS One. 11, 0167583 (2016).</li><li>Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+adhesion+and+migration.">Endothelial cell adhesion and migration.</a> Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).</li><li>Treloar, K. K., Simpson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+of+edge+detection+methods+for+quantifying+cell+migration+assays.">Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays.</a> PLoS One. 8, 67389 (2013).</li><li>Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+starvation:+caveat+emptor.">Serum starvation: caveat emptor.</a> American Journal of Physiology-Cell Physioliology. 301, 272-279 (2011).</li><li>Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+access+chamber+for+the+rat+dorsal+skin+fold.">A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold.</a> Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).</li><li>Deoliveira, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ear+punch+model+for+studying+the+effect+of+radiation+on+wound+healing.">An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing.</a> International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).</li><li>Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+excisional+wound+model:+Contraction+revisited.">The murine excisional wound model: Contraction revisited.</a> Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).</li><li>Dunn, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+wound+healing.">Murine model of wound healing.</a> Journal of Visualized Experiment. (75), e50265 (2013).</li><li>Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juglone+ameliorates+skin+wound+healing+by+promoting+skin+cell+migration+through+Rac1/Cdc42/PAK+pathway.">Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway.</a> Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).</li></ol>

इस पांडुलिपि में, हम एक इन विट्रो और विवो घाव भरने परख में वर्णन और प्राप्त परिणामसहसंबंध. इन विट्रो परख के लिए, हम प्राथमिक माउस फाइब्रोब्लास्ट्स4,14,15 जो घाव भरने और ऊ?...

त्वचा की अखंडता को बहाल करने और संक्रमण से जीव की रक्षा करने के लिए त्वचा की चोट के तुरंत बाद त्वचा घाव भरने शुरू होता है। घाव भरने की प्रक्रिया चार ओवरलैपिंग चरणों के माध्यम से चला जाता है; स्कंदन, सूजन, नए ऊतक गठन, और ऊतक remodeling1. इन चरणों के दौरान सेल प्रवास महत्वपूर्ण है। भड़काऊ कोशिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, keratincytes, endothelial कोशिकाओं, और फाइब्रोब्लास्ट अलग अलग समय बिंदुओं पर सक्रिय कर रहे हैं और घाव क्षेत्र2पर आक्रमण। इन विट्रो और विवो में घाव भरने की जांच करने के तरीके न केवल अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए बल्कि नई दवाओं का परीक्षण करने और त्वचा घाव भरने में सुधार करने और तेजी लाने के लिए लक्ष्य वाली नई रणनीतियों को विकसित करने के लिए बहुत रुचि के हैं।
सेल माइग्रेशन की निगरानी और विश्लेषण करने के लिए, स्क्रैच माइग्रेशन परख का उपयोग किया जा सकता है. यह अक्सर इन विट्रो घाव भरने परख के रूप में जाना जाता है। इस विधि के लिए एक सेल संस्कृति सुविधा 3 की आवश्यकताहै। यह एक सरल प्रक्रिया है, वहाँ उच्च अंत उपकरणों की कोई जरूरत नहीं है और परख सबसे सेल जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में किया जा सकता है. इस परख में, एक सेल मुक्त क्षेत्र एक confluent सेल मोनोलेयर के यांत्रिक विघटन के द्वारा बनाई गई है, अधिमानतः उपकला- या endothelial की तरह कोशिकाओं या फाइब्रोब्लास्ट्स. खरोंच के किनारे पर कोशिकाओं को बनाया अंतर repopulate करने के लिए माइग्रेट करेंगे. समय के साथ घटते सेल-मुक्त क्षेत्र का परिमाणीकरण प्रवास दर से मिलता-जुलता है और उस समय को इंगित करता है, जिसे कोशिकाओं को अंतराल को बंद करने की आवश्यकता होती है। इस उद्देश्य के लिए, जांचकर्ताओं या तो गंभीर रूप से अलग कोशिकाओं WT चूहों या चूहों ब्याज की एक जीन की कमी से उपयोग कर सकतेहैं 4, या विश्वसनीय सेल खजाने से उपलब्ध अमर कोशिकाओं. खरोंच परख औषधीय रूप से सक्रिय यौगिकों के प्रभाव या सेल प्रवास पर transfected CDNAs या siRNAs के प्रभाव का अध्ययन करने की अनुमति देता है.
विवो में, घाव भरने एक जटिल शारीरिक प्रक्रिया है, जिसमें केराटिनोसाइट्स, सूजन कोशिकाओं, फाइब्रोब्लास्ट्स, प्रतिरक्षा कोशिकाओं और एंडोथेलियल कोशिकाओं सहित विभिन्न प्रकार की आवश्यकता होती है ताकि त्वचा की शारीरिक अखंडता को तेजी से संभव 1 के रूप में बहाल किया जा सके . विवो घाव भरने के विभिन्न तरीकों का विकास किया गया है और इसका उपयोग पिछले5,6,7,8में किया गया है . इस लेख में वर्णित पृष्ठीय त्वचा का चर्खन पहले घाव भरने के लिए इस्तेमाल किया गया था. यह चूहों के लिए एक संशोधित पृष्ठीय skinfold कक्ष तैयारी के रूप में प्रयोग किया जाता है. संशोधित skinfold चैम्बर मॉडल कई फायदे हैं. 1) यह त्वचा संकुचन को कम करता है, जो घाव भरने की प्रक्रिया को देख रोकता है और चूहों में घाव की मरम्मत को प्रभावित कर सकता है। 2) यह कक्ष एक गिलास कवरस्लिप के साथ घाव को कवर करने, ऊतक संक्रमण और शुष्कता को कम करने का उपयोग करता है, जो उपचार प्रक्रिया में देरी कर सकता है। 3) रक्त प्रवाह और संवहनी सीधे नजर रखी जा सकती है. 4) यह घाव का इलाज करने और9,10के उपचार में तेजी लाने के लिए औषधीय रूप से सक्रिय यौगिकों और अभिकर्मकों के दोहराव सामयिक आवेदन की अनुमति देता है .
हमने दो स्वतंत्र प्रोटोकॉल का उपयोग करके त्वचा घाव भरने को प्रभावित करने के लिए एक संभावित लक्ष्य अणु के रूप में उच्च वोल्टेज-गेट्ड कैल्शियम चैनलों (कैवजेड 3) की $3 उपइकाई की पहचान की, अर्थात इन विट्रो खरोंच प्रवास परख और इन विवो पृष्ठीय त्वचा फ़ोल्ड चैम्बर मॉडल। इन विट्रो परख के लिए, हम प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट्स का इस्तेमाल किया, इन कोशिकाओं Cacnb3 जीन एन्कोडिंग Cav$ 3 प्रोटीन व्यक्त करते हैं, लेकिन depolarization प्रेरित Ca2 + प्रवाह या वोल्टेज पर निर्भर Ca2 + धाराओं की कमी है. हमने इन फाइब्रोब्लास्ट्स में कैव के एक उपन्यास समारोह का वर्णन किया है: कैव$3 इनोसिटोल 1,4,5-ट्राइसफॉस्फेट रिसेप्टर (IP3R) को बांधता है और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम से कैल्शियम की रिहाई पर प्रतिबंध लगा देता है। चूहों में Cacnb3 जीन के विलोपन IP3 के लिए IP3R की संवेदनशीलता में वृद्धि की ओर जाता है, बढ़ाया सेल प्रवास और त्वचा घाव की मरम्मत में वृद्धि4.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9 % NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Kai Industries</td>
			<td>48201</td>
			<td>2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297)</td>
			<td>Origene</td>
			<td>SR415626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilation cream</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any depilation cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>3400935940179.00</td>
			<td>(BEPANTHEN)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine)</td>
			<td>Bayer Health Care</td>
			<td></td>
			<td>Rompun 2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagon full nut</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>KETASET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Keyence, Osaka, Japan</td>
			<td>BZ-8000</td>
			<td>Similar microscopes might be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse restrainer</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>plan apo 10x/0.45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene sutures</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwdriver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin disinfectant (octeniderm)</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH</td>
			<td>118212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted cheese head screw</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap ring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap ring plier</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope with camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica M651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium frames for the skinfold chamber</td>
			<td>IROLA</td>
			<td>160001</td>
			<td>Halteblech M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire piler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing

बिगड़ा cutaneous घाव भरने मधुमेह से पीड़ित रोगियों के लिए और बुजुर्ग लोगों के लिए एक प्रमुख चिंता का विषय है, और वहाँ एक प्रभावी उपचार के लिए एक की जरूरत है. त्वचा घाव भरने की प्रक्रिया में सुधार करने के लिए दवा उपचार के लिए नए लक्ष्य अणुओं की पहचान के लिए इन विट्रो और विवो दृष्टिकोणों में उपयुक्त आवश्यक हैं। हमने दो स्वतंत्र परखों में घाव भरने को प्रभावित करने के लिए एक संभावित लक्ष्य अणु के रूप में वोल्टेज-गेट्ड कैल्शियम चैनलों (कैवजेड 3) की $3 उपइकाई की पहचान की, अर्थात इन विट्रो खरोंच प्रवास परख और इन विवो पृष्ठीय त्वचा फ़ोल्ड चैम्बर मॉडल। प्राथमिक माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट्स (एमईएफ) तीव्रता से जंगली प्रकार से अलग (WT) और Cav-3 कमी चूहों (Cav]3 KO) या फाइब्रोब्लास्ट्स तीव्रता से WT चूहों से अलग siRNA के साथ इलाज के लिए नीचे Cacnb3 जीन की अभिव्यक्ति को विनियमित , एन्कोडिंग Cav]3, का उपयोग किया गया. एक खरोंच एक confluent सेल monolayer पर लागू किया गया था और अंतर बंद करने के लिए निर्धारित समय अंक पर सूक्ष्म छवियों लेने के द्वारा पीछा किया गया था जब तक पलायन कोशिकाओं द्वारा अंतर की पूरी repopulation. इन छवियों का विश्लेषण किया गया, और सेल माइग्रेशन दर प्रत्येक शर्त के लिए निर्धारित किया गया था। एक में विवो परख में, हम WT और Cav$3 KO चूहों पर एक पृष्ठीय skinfold कक्ष प्रत्यारोपित, 2 मिमी व्यास की एक परिभाषित परिपत्र घाव लागू, एक गिलास coverslip के साथ घाव को कवर करने के लिए यह संक्रमण और desiccation से बचाने के लिए, और स्थूल घाव बंद नजर रखी समय के साथ. घाव बंद Cacnb3-जीन कमी चूहों में काफी तेजी से था. क्योंकि में विवो के परिणाम और इन विट्रो परख अच्छी तरह से सहसंबंधित, इन विट्रो परख में विवो घाव भरने मॉडल द्वारा इन विट्रो हिट मान्य करने से पहले उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी हो सकता है. क्या हम यहाँ जंगली प्रकार के लिए दिखाया गया है और Cav-3 कमी चूहों या कोशिकाओं को भी विशिष्ट अणुओं के लिए लागू हो सकता है केव के अलावा अन्य Cav $3.

खरोंच परख जंगली प्रकार के एक confluent सेल मोनोलेयर पर किया गया था और $ 3 कमी MEFs (चित्र 1ग). एक 200 डिग्री पिपेट टिप का उपयोग कर "स्क्रैच" प्रदर्शन करने के बाद, दोनों जीनोटाइप से कोशिकाओं को खरोंच क्ष?...

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Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

यहाँ, हम प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग कर एक इन विट्रो खरोंच परख के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं और चूहों में एक विवो त्वचा घाव भरने परख के लिए। दोनों परख इन विट्रो में और विवो घाव भरने में आकलन करने के लिए सरल तरीके हैं।

खरोंच प्रवास परख और डोर्सल स्किनफ़ोल्ड चैंबर इन विट्रो के लिए और घाव हीलिंग के Vivo विश्लेषण में

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

त्वचा के घावों के उपचार के लिए विद्रोही की जरूरत है। दवा उपचार के लिए अपने लक्षित अणुओं की पहचान करने के लिए, इन विट्रो और वीवो परीक्षण प्रणालियों की आवश्यकता होती है। उपयुक्त सिस्टम इन विट्रो स्क्रैच परख हैं, और वीवो पृष्ठीय त्वचा गुना कक्ष में हैं।दोनों कोशिका प्रवास और त्वचा घाव भरने की निगरानी के लिए सीधे आगे की प्रक्रियाएं हैं, अनुपस्थिति और औषधीय रूप से सक्रिय यौगिकों की उपस्थिति में। हालांकि दोनों तकनीकें सीधे आगे हैं, जांचकर्ताओं को स्क्रैच एप्लिकेशन का अभ्यास करना चाहिए। और पृष्ठीय त्वचा गुना कक्ष प्रत्यारोपण, और विश्वसनीय और प्रजनन योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए घायल।प्रक्रियाओं का प्रदर्शन डॉ मैथियस लाश्के, एक सर्जन और नैदानिक और प्रायोगिक सर्जरी संस्थान के प्रोफेसर द्वारा किया जाएगा । प्रक्रिया शुरू करने से पहले, प्रत्येक संस्कृति के लिए खरोंच क्षेत्र को चित्रित करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से नीचे एक क्षैतिज रेखा के साथ, सेल प्रकार प्रति एक छह अच्छी तरह से प्लेट को चिह्नित करने के लिए एक अल्ट्रा ठीक स्थायी मार्कर का उपयोग करें। अगली प्लेट प्राथमिक फाइबर विस्फोटों जंगली प्रकार और बीटा 3 कमी चूहों से अलग, एक छह अच्छी तरह से थाली में एक 5 बार 10 पर अच्छी तरह से एकाग्रता प्रति पांचवें फाइबर विस्फोटों के लिए ।डीएमईएम के 2mL में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक। प्लेटों को सेल प्रकार, जीनोटाइप और तिथि के साथ लेबल करें। और प्लेटों को 24 घंटे के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखें।अगली सुबह प्रत्येक लिपिड आधारित ट्रांसफैक्शन रिएजेंट के 9 माइक्रो लीटर को व्यक्तिगत माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब में जोड़ें जिसमें 150 माइक्रो लीटर कम सीरम माध्यम प्रति ट्यूब होता है। प्रति ट्यूब 150 माइक्रो लीटर कम सीरम माध्यम से युक्त ट्रांसफैक्शन रीएजेंट के अनुसार एक दूसरे माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब में 1.5 माइक्रो लीटर सिरना जोड़ें। और प्रत्येक सिर्ना समाधान को ट्रांसफैक्शन रीएजेंट समाधान की एक ट्यूब के साथ मिलाएं।संक्षेप में भंवर के बाद मिश्रण को 5 मिनट के लिए 21 डिग्री सेल्सियस पर रखें। इनक्यूबेशन के दौरान ध्यान से प्रत्येक अच्छी तरह से supernate की जगह। ताजा संस्कृति के 2.25mL के साथ कुओं के किनारे नीचे माध्यम ।इनक्यूबेशन के अंत में उपयुक्त सिराना ट्रांसफैक्शन रीएजेंट मिश्रण के 250 माइक्रो लीटर जोड़ें, कोशिकाओं के प्रत्येक संबंधित कुएं में बुद्धिमान छोड़ दें। और 72 घंटे के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में प्लेटें वापस करें। जब कोशिकाएं 100% तक पहुंच गई हैं, तो प्रत्येक अच्छी तरह से संस्कृति सुपरनेट को त्यागें।और एक 200 माइक्रो लीटर पिपेट टिप का उपयोग करने के लिए confluent सेल मोनोलेयर में खरोंच बनाने के लिए। प्रत्येक कुएं के तल पर चिह्नित क्षैतिज रेखा के लिए ऊर्ध्वाधर। फिर ध्यान से धोने प्रति पीपीएस के 2mL के साथ 2 बार प्रत्येक घायल अच्छी तरह से कुल्ला।क्षतिग्रस्त कोशिकाओं, ढीली कोशिकाओं या खरोंच क्षेत्र से मलबे से किसी भी जारी कारकों को दूर करने के लिए। दूसरे धोने के बाद प्रत्येक अच्छी तरह से 1 या 10 प्रतिशत सीरम के साथ पूरक ताजा सेल संस्कृति माध्यम के 2mL जोड़ें । और एक हल्के माइक्रोस्कोप के मंच पर प्रत्येक प्लेट में घावों की छवियों पर कब्जा।10X आवर्धन पर खरोंच के तुरंत बाद। फिर प्लेट को सेल कल्चर इनक्यूबेटर में वापस करें। अगले 30 घंटों के लिए उचित प्रयोगात्मक समय बिंदुओं पर छवियों को कैप्चर करना जारी रखना।प्रयोग के अंत में संस्कृति के 6, 10 और 30 घंटे के बाद प्रारंभिक सेल मुक्त क्षेत्र और शेष क्षेत्र की मात्रा निर्धारित करते हैं। प्रारंभिक खरोंच क्षेत्र के सापेक्ष माइग्रेटिंग कोशिकाओं द्वारा पुनः आबादी वाले खरोंच क्षेत्र का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए। अंगुली चुटकी के लिए प्रतिक्रिया की कमी की पुष्टि करने के बाद, जंगली प्रकार या बीटा तीन नॉकआउट C57 काले छह माउस में, ध्यान से डोरसम दाढ़ी ।और जानवर की आंखों पर मरहम लगाएं। किसी भी बचे हुए बालों को खत्म करने के लिए डिपिलेटरी क्रीम लगाएं। 10 मिनट के बाद क्रीम को हटा दें।टाइटेनियम कक्ष तैयार करने के लिए, सममित टाइटेनियम चैंबर फ्रेम के एक हिस्से को ठीक करें, नट्स के साथ कनेक्टिंग शिकंजा के साथ। कक्ष के दो सममित भागों के बीच 400 से 500 माइक्रोमीटर बनाए रखना। ताकि त्वचा में ब्लड वेसिकल्स के संपीड़न से बचा जा सके।70% इथेनॉल के साथ उजागर त्वचा को कीटाणुरहित करें। और एक हल्के स्रोत के सामने त्वचा के एक गुना समझ। त्वचा की डबल परत की मध्य रेखा को उस स्थान पर रखें जहां टाइटेनियम कक्ष प्रत्यारोपित किया जाएगा।और कपाल और कौडाली एक पॉलीप्रोपाइलीन सीवन के साथ त्वचा गुना ठीक करते हैं। जोड़ त्वचा उठाने के लिए एक धातु रैक पर सीवन के दूसरे पक्ष को कस लें। और माउस को आराम से बैठने की अनुमति देने के लिए रैक की ऊंचाई को समायोजित करें।सीवन इस पर पॉलीप्रोपाइलीन टांके द्वारा टाइटेनियम चैंबर का पहला फ्रेम पृष्ठीय त्वचा गुना के पीछे बेहतर किनारे। फिर से पुष्टि के बाद स्मेशन त्वचा में छोटे चीरों को बनाने के लिए ठीक कैंची का उपयोग करें। और त्वचा गुना के आधार के माध्यम से टाइटेनियम कक्ष की पहली छमाही से जुड़े दो जोड़ने शिकंजा पास।रैक से माउस निकालें, और जानवर को पार्श्व स्थिति में रखें। टाइटेनियम चैंबर के दूसरे मानार्थ आधे 3 को जोड़ने शिकंजा के शीर्ष पर रखें। और मैन्युअल रूप से टाइटेनियम फ्रेम की दूसरी छमाही के माध्यम से इन शिकंजा पारित करने के लिए मामूली दबाव लागू होते हैं।मुड़ा हुआ त्वचा परत अब टाइटेनियम फ्रेम के दो सममित हिस्सों के बीच सैंडविच है। फिर स्टेनलेस स्टील के नट्स के साथ दोनों सममित हिस्सों को ठीक करें। एक मानकीकृत 2mL व्यास बायोप्सी पंच का उपयोग करना, त्वचा गुना कक्ष की अवलोकन खिड़की के भीतर, त्वचा के केंद्र में घाव क्षेत्र को चिह्नित करें।और निशान के भीतर पूरे एपिडर्मिस और डर्मिस को हटाने के लिए ठीक संदंश और कैंची का उपयोग करें। एक गोलाकार घाव बनाने के लिए। 0.5 ml स्टरल खारा के साथ साढ़े 3 से 4 और एक आधा मिलामीटर चुकता घाव को साफ करें।और घाव को ग्लास कवरलिप से ढक दें। जगह में कवरस्लिप को ठीक करने के लिए टाइटेनियम चैंबर पर स्नैप रिंग प्लियर का उपयोग करें। और तुरंत माउस को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के इमेजिंग चरण में स्थानांतरित करें।फिर 40X आवर्धन पर घाव की छवि। पूर्ण वसूली तक निगरानी के साथ एक पिंजरे में माउस रखने से पहले। इस प्रतिनिधि प्रयोग में, 200 माइक्रो लीटर पिपेट टिप का उपयोग करके एक खरोंच बनाने के बाद, दोनों जीनोटाइप की कोशिकाएं खरोंच क्षेत्र में चली गईं और अंतर को बंद कर दिया।इसके बाद कोशिका प्रवास को खरोंच क्षेत्र के प्रतिशत के रूप में निर्धारित किया गया था जो खरोंच प्रदर्शन करने के 6 घंटे बाद कोशिकाओं को माइग्रेट करके फिर से आबाद किया गया था। उदाहरण के लिए इस प्रयोग में कैव बीटा 3 कमी फाइबर विस्फोटों पलायन जंगली प्रकार चूहों से फाइबर विस्फोटों की तुलना में काफी पहले खरोंच क्षेत्र बंद कर दिया । Cav बीटा 3 निर्भर प्रभाव की पुष्टि करने के लिए Cav बीटा 3 कमी फाइबर विस्फोटों में मनाया, जंगली प्रकार फाइबर विस्फोटों सिरना के साथ संक्रमित करने के लिए नीचे Cav बीटा 3 प्रोटीन को विनियमित किया गया ।फाइबर विस्फोटों के साथ इलाज किया Cav बीटा 3 विशिष्ट siRNAs बीटा 3 कमी फाइबर विस्फोटों की तरह व्यवहार किया । दोनों जीनोटाइप के बीच त्वचा घाव भरने की तुलना करने के लिए, त्वचा गुना कक्ष में घाव क्षेत्र घायल होने के बाद सीधे फोटो खिंचवाने गया था। और घाव अगले 2 हफ्तों में छवि थी ।घावों के आकार छवियों और घाव क्षेत्र पर मापा गया था, एक दिए गए दिन पर प्रारंभिक घाव क्षेत्र का प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया था। जैसा कि उम्मीद थी कि जंगली प्रकार के नियंत्रण की तुलना में कैव बीटा 3 कमी चूहों में घाव बंद करने की दर में वृद्धि हुई थी। प्रत्येक खरोंच के लिए पिपेट टिप पर समान दबाव लागू करना सुनिश्चित करें और प्लेट बॉटम पर खरोंच को यथासंभव बारीकी से नीचे से मैच करें।उपचार प्रक्रिया के दौरान पृष्ठीय त्वचा गुना कक्ष की अवलोकन खिड़की को किसी भी समय खोला जा सकता है। विभिन्न औषधीय रूप से सक्रिय यौगिकों के सामयिक अनुप्रयोग के लिए अनुमति देना। उपचार प्रक्रिया के विभिन्न चरणों में घायल क्षेत्र को उत्पादित करना भी संभव है।आणविक प्रोटीन जैव रासायनिक या हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए।

Research

JoVE Journal

Medicine

Murine Model of Wound Healing

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Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

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माउस के पृष्ठीय skinfold चैंबर में इस्कीमिक ऊतक चोट: एक त्वचा प्रालंब मॉडल तीव्र लगातार Ischemia जांच

Despite profound expertise and advanced surgical techniques, ischemia-induced complications ranging from wound breakdown to extensive tissue necrosis are ...

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चूहे में Taxanes के फार्माकोकाइनेटिक और pharmacodynamic विश्लेषण के लिए मन्या धमनी आधान

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

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Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

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Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

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Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

कॉर्निया घाव भरने के लिए एक मॉडल के रूप में आंख गड़गड़ाहट के साथ Corneal उपकला घर्षण

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