Name: scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing
Uploaded: 2019-09-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing at JoVE.com

Ringraziamo la Dott.ssa Petra Weissgerber e l'Unità Transgene dell'impianto animale SPF (progetto P2 di SFB 894) della Facoltà di Medicina e la struttura animale presso l'Istituto di Chirurgia Clinica e Sperimentale presso la Facoltà di Medicina dell'Università di Saarland, Homburg. Ringraziamo il dottor Andreas Beck per la lettura critica del manoscritto. Questo studio è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, dal progetto A3 per A.B. e V.F.).

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate ed eseguite in conformità con i regolamenti etici e i comitati per il benessere degli animali della Saarland e dell'Università di Saarland.
1 Coltura cellulare primaria e trasfezione del siRNA
NOTA: nel metodo descritto, vengono utilizzati fibroblasti primari. Queste cellule svolgono un ruolo cruciale nella guarigione delle ferite e nel rimodellamento dei tessuti11. In questo esperimento, i...

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	<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li><li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing--aiming+for+perfect+skin+regeneration.">Wound healing--aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276, 75-81 (1997).</li><li>Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+actin+cytoskeleton+during+early+endothelial+regeneration+in+vitro.">Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro.</a> Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).</li><li>Belkacemi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP3+Receptor-Dependent+Cytoplasmic+Ca(2+)+Signals+Are+Tightly+Controlled+by+Cavbeta3.">IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3.</a> Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).</li><li>Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healing+of+partial+thickness+porcine+skin+wounds+in+a+liquid+environment.">Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment.</a> Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).</li><li>Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+wounds+in+the+MRL/MPJ+mouse+heal+with+scar.">Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar.</a> Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).</li><li>Vagesjo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+in+mice+by+on-site+production+and+delivery+of+CXCL12+by+transformed+lactic+acid+bacteria.">Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria.</a> Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).</li><li>Eming, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+closure+in+mice+deficient+for+interleukin-10.">Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10.</a> American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).</li><li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber.">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).</li><li>Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dorsal+skinfold+chamber:+window+into+the+dynamic+interaction+of+biomaterials+with+their+surrounding+host+tissue.">The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue.</a> European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).</li><li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration.">Cell migration.</a> Comprehensive Physiology. 2, 2369-2392 (2012).</li><li>Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Alternative+Functions+for+the+Auxiliary+Subunits+of+the+Voltage-Gated+Calcium+Channels.">Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels.</a> Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+4.1G+Regulates+Cell+Adhesion,+Spreading,+and+Migration+of+Mouse+Embryonic+Fibroblasts+through+the+beta1+Integrin+Pathway.">Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).</li><li>Dewor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+migration+inhibitory+factor+(MIF)+promotes+fibroblast+migration+in+scratch-wounded+monolayers+in+vitro.">Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro.</a> FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).</li><li>Handly, L. N., Wollman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound-induced+Ca(2+)+wave+propagates+through+a+simple+release+and+diffusion+mechanism.">Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism.</a> Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).</li><li>Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+In+Vitro+Wound+Healing+Assay+to+Evaluate+Cell+Migration.">A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), 56825 (2018).</li><li>Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular+and+Affordable+Time-Lapse+Imaging+and+Incubation+System+Based+on+3D-Printed+Parts,+a+Smartphone,+and+Off-The-Shelf+Electronics.">A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics.</a> PLoS One. 11, 0167583 (2016).</li><li>Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+adhesion+and+migration.">Endothelial cell adhesion and migration.</a> Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).</li><li>Treloar, K. K., Simpson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+of+edge+detection+methods+for+quantifying+cell+migration+assays.">Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays.</a> PLoS One. 8, 67389 (2013).</li><li>Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+starvation:+caveat+emptor.">Serum starvation: caveat emptor.</a> American Journal of Physiology-Cell Physioliology. 301, 272-279 (2011).</li><li>Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+access+chamber+for+the+rat+dorsal+skin+fold.">A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold.</a> Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).</li><li>Deoliveira, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ear+punch+model+for+studying+the+effect+of+radiation+on+wound+healing.">An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing.</a> International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).</li><li>Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+excisional+wound+model:+Contraction+revisited.">The murine excisional wound model: Contraction revisited.</a> Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).</li><li>Dunn, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+wound+healing.">Murine model of wound healing.</a> Journal of Visualized Experiment. (75), e50265 (2013).</li><li>Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juglone+ameliorates+skin+wound+healing+by+promoting+skin+cell+migration+through+Rac1/Cdc42/PAK+pathway.">Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway.</a> Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).</li></ol>

In questo manoscritto, descriviamo un test di guarigione delle ferite in vitro e in vivo e correliamo i risultati ottenuti. Per il saggio in vitro, abbiamo usato fibroblasti di topo primari4,14,15 che svolgono un ruolo importante nella guarigione delle ferite e nella ristrutturazione dei tessuti11. Possono essere utilizzati anche altri tipi di cellule aderenti che crescono come monostrati (ad esempio, cel...

La guarigione della ferita cutanea inizia immediatamente dopo la lesione cutanea al fine di ripristinare l'integrità della pelle e per proteggere l'organismo dalle infezioni. Il processo di guarigione della ferita passa attraverso quattro fasi sovrapposte; coagulazione, infiammazione, formazione di nuovi tessuti e rimodellamento dei tessuti1. La migrazione cellulare è fondamentale in queste fasi. Cellule infiammatorie, cellule immunitarie, cheratinociti, cellule endoteliali e fibroblasti vengono attivati in diversi punti temporali e invadono l'area della ferita2. I metodi per studiare la guarigione delle ferite in vitro e in vivo sono di grande interesse non solo per comprendere i meccanismi sottostanti, ma anche per testare nuovi farmaci e per sviluppare nuove strategie che mirano a migliorare e accelerare la guarigione delle ferite della pelle.
Per monitorare e analizzare la migrazione delle celle, è possibile utilizzare il saggio di migrazione scratch. È spesso indicato come analisi di guarigione della ferita in vitro. Questo metodo richiede una struttura di coltura cellulare3. Si tratta di una procedura semplice, non c'è bisogno di attrezzature di fascia alta e il saggio può essere eseguito nella maggior parte dei laboratori di biologia cellulare. In questo saggio, un'area priva di cellule viene creata dall'interruzione meccanica di un monostrato cellulare confluente, preferibilmente cellule epiteliali o fibroblaste endoteliali o fibroblaste. Le celle sul bordo del graffio verranno migrate per ripopolare lo spazio creato. La quantificazione dell'area libera dalle cellule decrescenti nel tempo assomiglia al tasso di migrazione e indica il tempo di cui le cellule hanno bisogno per colmare il divario. A tale scopo, i ricercatori possono utilizzare cellule acutamente isolate da topi O topi WT privi di un gene di interesse4o cellule immortalate disponibili da archivi cellulari affidabili. Il saggio di graffio permette di studiare l'influenza dei composti farmacologicamente attivi o l'effetto dei cDNA trafetti o dei siRNA sulla migrazione cellulare.
In vivo, la guarigione delle ferite è un processo fisiologico complesso, che richiede diversi tipi di cellule tra cui cheratinociti, cellule infiammatorie, fibroblasti, cellule immunitarie e cellule endoteliali al fine di ripristinare l'integrità fisica della pelle il più velocemente possibile1 . Diversi metodi per studiare la guarigione delle ferite in vivo sono stati sviluppati e utilizzati negli ultimi5,6,7,8. La camera dorsale a forma di pelle descritta in questo articolo è stata precedentemente utilizzata per i saggi di guarigione delle ferite9. Viene utilizzato come preparazione a camera dorsale modificata per i topi. Il modello di camera skinfold modificato ha diversi vantaggi. 1) Riduce al minimo la contrazione della pelle, che impedisce l'osservazione del processo di guarigione della ferita e potrebbe influenzare la riparazione della ferita nei topi. 2) Questa camera fa uso di coprire la ferita con un vetrine di vetro, riducendo le infezioni dei tessuti e la disidratazione, che potrebbe ritardare il processo di guarigione. 3) Il flusso sanguigno e la vascolarizzazione possono essere monitorati direttamente. 4) Permette ripetutamente l'applicazione topica di composti e reagenti farmacologicamente attivi al fine di trattare la ferita e accelerare la guarigione9,10.
Abbiamo identificato la sottounità n. 3 di canali di calcio ad alta tensione (Cav-3) come una potenziale molecola bersaglio per influenzare la guarigione della pelle della pelle utilizzando due protocolli indipendenti, vale a dire il saggio di migrazione del graffio in vitro e il modello della camera dorsale in vivo. Per il saggio in vitro, abbiamo usato fibroblasti primari, queste cellule esprimono il gene Cacnb3 che codifica la proteina Cav3, ma mancano di afflusso di Ca2 o di afflusso di tensione. Abbiamo descritto una nuova funzione di Cav-3 in questi fibroblasti: Cav-3 si lega al recettore dell'inositolo 1,4,5-trisfosfato (IP3R) e vincoli di rilascio di calcio dal reticolo endoplasmico. L'eliminazione del gene Cacnb3 nei topi porta ad una maggiore sensibilità dell'IP3R per IP3, a una maggiore migrazione cellulare e ad una maggiore riparazione della pelle4.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9 % NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Kai Industries</td>
			<td>48201</td>
			<td>2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297)</td>
			<td>Origene</td>
			<td>SR415626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilation cream</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any depilation cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>3400935940179.00</td>
			<td>(BEPANTHEN)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine)</td>
			<td>Bayer Health Care</td>
			<td></td>
			<td>Rompun 2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagon full nut</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>KETASET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Keyence, Osaka, Japan</td>
			<td>BZ-8000</td>
			<td>Similar microscopes might be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse restrainer</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>plan apo 10x/0.45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene sutures</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwdriver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin disinfectant (octeniderm)</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH</td>
			<td>118212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted cheese head screw</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap ring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap ring plier</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope with camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica M651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium frames for the skinfold chamber</td>
			<td>IROLA</td>
			<td>160001</td>
			<td>Halteblech M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire piler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing

La guarigione delle ferite cutanee alterate è una delle principali preoccupazioni per i pazienti affetti da diabete e per le persone anziane, e c'è bisogno di un trattamento efficace. Approcci appropriati in vitro e in vivo sono essenziali per l'identificazione di nuove molecole bersaglio per i trattamenti farmacologici per migliorare il processo di guarigione della ferita cutanea. Abbiamo identificato la sottounità n. 3 di canali di calcio legati alla tensione (Cav-3) come una potenziale molecola bersaglio per influenzare la guarigione della ferita in due saggi indipendenti, vale a dire il saggio di migrazione del graffio in vitro e il modello di camera in vivo dorsale skinfold. Fibroblasti embrionali murici primari (MEF) acutamente isolati da topi selvatici (WT) e cav-3-decisi (Cav-3 KO) o fibroblasti acutamente isolati dai topi WT trattati con siRNA per down-regolare l'espressione del gene Cacnb3 , codificacazione Cavn.3, sono stati utilizzati. Un graffio è stato applicato su un monostrato cellulare confluente e la chiusura del gap è stata seguita prendendo immagini microscopiche in punti temporali definiti fino al ripopolamento completo del divario da parte delle cellule che migrano. Queste immagini sono state analizzate e il tasso di migrazione delle cellule è stato determinato per ogni condizione. In un test in vivo, abbiamo impiantato una camera dorsale a pelli su topi WT e Cav-3 KO, abbiamo applicato una ferita circolare definita di 2 mm di diametro, coperto la ferita con un coperchio di vetro per proteggerla da infezioni e disidratazione, e monitorato la chiusura della ferita macroscopica nel corso del tempo. La chiusura delle ferite è stata significativamente più veloce nei topi carenti di Cacnb3. Poiché i risultati degli esami in vivo e in vitro sono correlati bene, il saggio in vitro può essere utile per lo screening ad alto rendimento prima di convalidare i colpi in vitro del modello di guarigione della ferita in vivo. Ciò che abbiamo mostrato qui per i topi o le cellule di tipo selvatico e Cav-3-deciziali potrebbe essere applicabile anche a molecole specifiche diverse da Cav.

Il saggio di graffio è stato eseguito su un monostrato di cellule confluenti di MEF di tipo selvaggio e a 3 persone (Figura 1c). Dopo aver eseguito il "scratch" utilizzando una punta di pipetta da 200, le cellule di entrambi i genotipi migrano nell'area del graffio e chiudono il divario. Le immagini sono state scattate dopo 6, 10 e 30 h (Figura 1a). La migrazione cellulare è stata quantificata come percentuale (%) dell'area sc...

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Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Qui, presentiamo un protocollo per un saggio in vitro graffio utilizzando fibroblasti primari e per un saggio di guarigione della ferita della pelle in vivo nei topi. Entrambi i test sono metodi semplici per valutare la guarigione delle ferite in vitro e in vivo.

Scratch Migration Ssay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro e In Vivo Analisi della Guarigione delle Ferite

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

Il bisogno insurrezionale di trattamento delle ferite della pelle. Per identificare le molecole target per i trattamenti farmacologici, sono necessari sistemi di test in vitro e in vivo. I sistemi appropriati sono il test dei graffi in vitro e la camera di piegatura dorsale in vivo della pelle.Entrambi sono procedure semplici per monitorare la migrazione cellulare e la guarigione delle ferite cutanee, in assenza e presenza di composti farmacologicamente attivi. Sebbene entrambe le tecniche siano dritte, gli investigatori dovrebbero praticare l'applicazione scratch. E l'impianto della camera della piega dorsale della pelle, e il mento per ottenere risultati affidabili e riproducibili.La dimostrazione delle procedure sarà effettuata dal Dott. Matthias Laschke, chirurgo e professore dell'istituto di chirurgia clinica e sperimentale. Prima di iniziare la procedura, utilizzare un marcatore permanente ultra fine per contrassegnare una piastra a sei pozzi per tipo di cella, con una linea orizzontale nella parte inferiore di ogni pozzo per delineare la regione di graffio per ogni coltura. La fibra primaria della piastra successiva esplode isolata dal tipo selvatico e dai topi beta 3 carenti, in una piastra a sei pozzi a 5 volte 10 alla quinta esplosione di fibre per concentrazione di pozzi.In 2mL di DMEM integrato con siero bovino fetale al 10%. Etichettare le lastre con il tipo di cella, il genotipo e la data. E posizionare le piastre nell'incubatore di coltura cellulare per 24 ore.La mattina successiva aggiungere 9 micro litri di ogni reagente di trasfezione a base lipidica di interesse, ai singoli tubi di micro centrifuga contenenti 150 micro litri di mezzo siero ridotto per tubo. Aggiungere 1,5 micro litri di siRNA a un secondo tubo di micro centrifuga per reagente di trasfezione contenente 150 micro litri di mezzo siero ridotto per tubo. E mescolare ogni soluzione di siRNA con un unico tubo di soluzione di reagente di trasfezione.Dopo aver brevemente vortice posizionare le miscele a 21 gradi Celsius per 5 minuti. Durante l'incubazione sostituire con cura il supernate in ogni pozzo. Con 2,25 mL di mezzo di coltura fresco lungo il lato dei pozzi.Alla fine dell'incubazione aggiungere 250 micro litri della miscela di reagente di trasfezione del siRNA appropriata, cadere saggiamente in ogni pozzo corrispondente di cellule. E riportare le piastre all'incubatore di coltura cellulare per 72 ore. Quando le celle hanno raggiunto il 100% di confluenza, scartare il supernatante delle impostazioni cultura da ogni pozzo.E usa una punta di pipetta da 200 micro litri per creare graffi nel monostrato a celle confluenti. Verticale alla linea orizzontale contrassegnata nella parte inferiore di ogni pozzo. Quindi sciacquare accuratamente ogni ferito ben 2 volte con 2mL di PPS per lavaggio.Per rimuovere eventuali fattori rilasciati dalle cellule danneggiate, dalle cellule sciolte o dai detriti dall'area graffiata. Dopo il secondo lavaggio aggiungere 2mL di mezzo di coltura cellulare fresco integrato con 1 o 10 percento di siero ad ogni pozzo. E catturare le immagini delle ferite in ogni piatto sul palco di un microscopio luminoso.Immediatamente dopo aver graffiato con un ingrandimento 10X. Quindi riportare il piatto all'incubatore di coltura cellulare. Continuare a catturare le immagini nei punti di tempo sperimentali appropriati per le prossime 30 ore.Al termine dell'esperimento quantificare l'area libera iniziale delle cellule e l'area rimanente dopo 6, 10 e 30 ore di coltura. Per determinare la percentuale dell'area scratch ripopolata dalle celle di migrazione rispetto all'area iniziale del graffio. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del dito, nel tipo selvaggio o beta tre knockout C57 nero sei topo, radere accuratamente il dorsum.E applicare unguento agli occhi dell'animale. Applicare la crema depilatoria per eliminare i capelli rimanenti. Rimozione della crema dopo 10 minuti.Per preparare la camera in titanio, fissare una parte del telaio simmetrico della camera in titanio, con le viti di collegamento con dadi. Per mantenere da 400 a 500 micrometri tra le due parti simmetriche della camera. Per evitare la compressione delle vescicole di sangue nella pelle.Disinfettare la pelle esposta con il 70% di etanolo. E afferrare una piega di pelle di fronte a una fonte di luce. Posizionare la linea centrale del doppio strato di pelle in cui verrà impiantata la camera in titanio.E fissare cranialmente e caudally la piega della pelle con una sutura in polipropilene. Stringere l'altro lato della sutura su un rack metallico per sollevare la pelle piegata. E regolare l'altezza del rack per consentire al mouse di sedersi comodamente.Sutura il primo telaio della camera in titanio da suture in polipropilene su di esso bordo superiore alla parte posteriore della piega dorsale della pelle. Dopo aver riconfermato la sedazione utilizzare forbici fini per fare piccole incisioni nella pelle. E passare le due viti di collegamento attaccate alla prima metà della camera in titanio attraverso la base della piega della pelle.Rimuovere il mouse dal rack e posizionare l'animale in posizione laterale. Posizionare la seconda metà in omaggio della camera in titanio sopra le 3 viti di collegamento. E applicare manualmente una leggera pressione per passare queste viti attraverso la seconda metà del telaio in titanio.Lo strato di pelle piegata è ora inserito tra le due metà simmetriche del telaio in titanio. Quindi fissare entrambe le parti simmetriche con dadi in acciaio inossidabile. Utilizzando un punzone di biopsia standardizzato di 2 mL di diametro, contrassegnare l'area della ferita al centro della pelle, all'interno della finestra di osservazione della camera di piegatura della pelle.E usa forcep e forbici fini per rimuovere l'intera epidermide e derma all'interno del marchio. Per creare una ferita circolare. Pulire la ferita quadrata da 3 a mezzo a 4 metri e mezzo con 0,5 mL di steril salina.E coprire la ferita con una coverlip di vetro. Utilizzare la pinzera dell'anello a scatto sulla camera in titanio per fissare il coperchio in posizione. E trasferire immediatamente il mouse nella fase di imaging di uno stereomicroscopio.Quindi immagine della ferita con un ingrandimento 40X. Prima di posizionare il mouse in una gabbia con monitoraggio fino al completo recupero. Dopo aver creato un graffio utilizzando una punta di pipetta da 200 micro litri come dimostrato, in questo esperimento rappresentativo, le cellule di entrambi i genotipi migrarono nell'area dei graffi e coldere lo spazio.La migrazione cellulare è stata quindi quantificata come percentuale di area scratch ripopolata migrando le cellule 6 ore dopo aver eseguito il graffio. Ad esempio in questo esperimento la migrazione di esplosioni di fibre carenti di Cav beta 3 ha chiuso l'area dei graffi significativamente prima delle esplosioni di fibre da topi di tipo selvatico. Per confermare l'effetto dipendente Cav beta 3 osservato nelle esplosioni di fibre carenti di Cav beta 3, le esplosioni di fibre di tipo selvatico sono state trasfette con siRNA per regolare verso il basso la proteina Cav beta 3.Le esplosioni in fibra trattate con i siRNA specifici Cav beta 3 si sono comportate come esplosioni di fibre carenti di beta 3. Per confrontare la guarigione delle ferite cutanee tra entrambi i genotipi, l'area della ferita nella camera di piegatura della pelle è stata fotografata direttamente dopo il mento. E la ferita è stata con un'immagine nelle prossime due settimane.Le dimensioni delle ferite sono state misurate sulle immagini e l'area della ferita, in un dato giorno è stata espressa come, la percentuale dell'area iniziale della ferita. Come previsto il tasso di chiusura delle ferite è stato aumentato nel Cav beta 3 topi carenti rispetto ai controlli di tipo selvaggio. Assicurarsi di applicare la stessa pressione alla punta della pipetta, per ogni graffio e di abbinare i graffi alle linee contrassegnate sul fondo della piastra il più vicino possibile.La finestra di osservazione della camera di piegatura della pelle dorsale può essere aperta in qualsiasi momento durante il processo di guarigione. Consentendo l'applicazione topica di diversi composti farmacologicamente attivi. È anche possibile asportare l'area ferita in diverse fasi del processo di guarigione.Per analisi biochimiche o istologiche delle proteine molecolari.

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