Name: scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing
Uploaded: 2019-09-26T13:00:00
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我々は、ホムブルクのザールラント大学医学部の臨床実験外科研究所の医学部と動物施設のSPF動物施設(SFB 894のプロジェクトP2)のペトラ・ワイスガーバー博士とトランスジーン・ユニットに感謝します。私たちは、原稿の批判的な読み取りのためにアンドレアス・ベック博士に感謝します。この研究は、ドイツのフォルシュンゲミンシャフト(DFG)ソンダーフォルスチュンスベライヒ(SFB)894、A3からA.B.およびV.F.によって資金提供されました。

すべての実験手順は、ザールランドとザールランド大学の倫理規則と動物福祉委員会に従って承認され、実行されました.
1 一次細胞培養とsiRNAトランスフェクション
注:記載の方法では、一次線維芽細胞が使用される。これらの細胞は、創傷治癒および組織リモデリング11において重要な役割を果たす。この実験では、Cacnb3遺伝...

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	<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li><li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing--aiming+for+perfect+skin+regeneration.">Wound healing--aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276, 75-81 (1997).</li><li>Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+actin+cytoskeleton+during+early+endothelial+regeneration+in+vitro.">Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro.</a> Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).</li><li>Belkacemi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP3+Receptor-Dependent+Cytoplasmic+Ca(2+)+Signals+Are+Tightly+Controlled+by+Cavbeta3.">IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3.</a> Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).</li><li>Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healing+of+partial+thickness+porcine+skin+wounds+in+a+liquid+environment.">Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment.</a> Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).</li><li>Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+wounds+in+the+MRL/MPJ+mouse+heal+with+scar.">Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar.</a> Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).</li><li>Vagesjo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+in+mice+by+on-site+production+and+delivery+of+CXCL12+by+transformed+lactic+acid+bacteria.">Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria.</a> Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).</li><li>Eming, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+closure+in+mice+deficient+for+interleukin-10.">Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10.</a> American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).</li><li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber.">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).</li><li>Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dorsal+skinfold+chamber:+window+into+the+dynamic+interaction+of+biomaterials+with+their+surrounding+host+tissue.">The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue.</a> European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).</li><li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration.">Cell migration.</a> Comprehensive Physiology. 2, 2369-2392 (2012).</li><li>Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Alternative+Functions+for+the+Auxiliary+Subunits+of+the+Voltage-Gated+Calcium+Channels.">Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels.</a> Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+4.1G+Regulates+Cell+Adhesion,+Spreading,+and+Migration+of+Mouse+Embryonic+Fibroblasts+through+the+beta1+Integrin+Pathway.">Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).</li><li>Dewor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+migration+inhibitory+factor+(MIF)+promotes+fibroblast+migration+in+scratch-wounded+monolayers+in+vitro.">Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro.</a> FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).</li><li>Handly, L. N., Wollman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound-induced+Ca(2+)+wave+propagates+through+a+simple+release+and+diffusion+mechanism.">Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism.</a> Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).</li><li>Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+In+Vitro+Wound+Healing+Assay+to+Evaluate+Cell+Migration.">A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), 56825 (2018).</li><li>Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular+and+Affordable+Time-Lapse+Imaging+and+Incubation+System+Based+on+3D-Printed+Parts,+a+Smartphone,+and+Off-The-Shelf+Electronics.">A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics.</a> PLoS One. 11, 0167583 (2016).</li><li>Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+adhesion+and+migration.">Endothelial cell adhesion and migration.</a> Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).</li><li>Treloar, K. K., Simpson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+of+edge+detection+methods+for+quantifying+cell+migration+assays.">Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays.</a> PLoS One. 8, 67389 (2013).</li><li>Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+starvation:+caveat+emptor.">Serum starvation: caveat emptor.</a> American Journal of Physiology-Cell Physioliology. 301, 272-279 (2011).</li><li>Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+access+chamber+for+the+rat+dorsal+skin+fold.">A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold.</a> Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).</li><li>Deoliveira, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ear+punch+model+for+studying+the+effect+of+radiation+on+wound+healing.">An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing.</a> International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).</li><li>Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+excisional+wound+model:+Contraction+revisited.">The murine excisional wound model: Contraction revisited.</a> Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).</li><li>Dunn, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+wound+healing.">Murine model of wound healing.</a> Journal of Visualized Experiment. (75), e50265 (2013).</li><li>Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juglone+ameliorates+skin+wound+healing+by+promoting+skin+cell+migration+through+Rac1/Cdc42/PAK+pathway.">Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway.</a> Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).</li></ol>

この原稿では、インビトロおよびインビボ創傷治癒アッセイについて説明し、得られた結果を相関させる。インビトロアッセイでは、創傷治癒および組織リモデリング11において重要な役割を果たす一次マウス線維芽細胞4、14、15を用いた。単層として増殖する他の付着細胞型(例えば、上皮細胞、内皮細?...

皮膚創傷治癒は、皮膚の完全性を回復し、感染から生物を保護するために、皮膚損傷の直後に始まる。創傷治癒プロセスは、4つの重なり合う段階を経る;凝固、炎症、新しい組織形成、および組織リモデリング1.細胞の移行は、これらの段階で非常に重要です。炎症細胞は、免疫細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、および線維芽細胞が異なる時点で活性化され、創傷領域2に侵入する。インビトロおよびインビボで創傷治癒を調査する方法は、根本的なメカニズムを理解するだけでなく、新薬をテストし、皮膚創傷治癒を改善し、加速することを目的とした新しい戦略を開発することに大きな関心を持っています。
セルの移行を監視および分析するには、スクラッチマイグレーションアッセイを使用できます。多くの場合、インビトロ創傷治癒アッセイと呼ばれます。この方法では、細胞培養施設3が必要です。それは簡単なプロシージャであり、ハイエンドの装置の必要性がなく、アッセイはほとんどの細胞生物学の実験室で行うことができる。このアッセイでは、細胞不自由領域は、コンフルエント細胞単層の機械的破壊によって作成され、好ましくは上皮または内皮様細胞または線維芽細胞である。スクラッチの端にあるセルは、作成されたギャップを再設定するために移行します。時間の経過に合った細胞のない領域の定量化は、移動速度に似ており、細胞がギャップを閉じる必要がある時間を示します。この目的のために、研究者は、WTマウスから急性単離された細胞または目的の遺伝子4を欠いているマウス、または信頼性の高い細胞リポジトリから入手可能な不死化細胞のいずれかを使用することができる。スクラッチアッセイは、薬理学的に活性な化合物の影響または細胞移動に対するトランスフェクトされたcDNまたはsiRNAの影響を研究することを可能にする。
生体内では、創傷治癒は複雑な生理学的プロセスであり、皮膚の身体的完全性を可能な限り早く回復させるために、ケラチノサイト、炎症細胞、線維芽細胞、免疫細胞および内皮細胞を含む異なる細胞タイプを必要とする1.生体内創傷治癒における研究の異なる方法は、過去5、6、7、8で開発され、使用されている。この記事に記載されている背中の皮膚折室は、以前に創傷治癒アッセイ9に使用された。マウスに対する修飾後部皮膚折室内製剤として使用される。変更されたスキンフォールドチャンバーモデルにはいくつかの利点がある。1)皮膚収縮を最小限に抑え、創傷治癒過程を観察するのを妨げ、マウスの創傷修復に影響を与える可能性がある。2)この部屋は、ガラスカバースリップで創傷をカバーし、組織感染や乾燥を減らし、治癒プロセスを遅らせる可能性があります。3)血流および血管を直接監視することができる。4)創傷を治療し、治癒を加速するために薬理学的に活性な化合物および試薬の反復的な局所適用を可能にする9、10。
高電圧ゲートカルシウムチャネル(Cavβ3)のβ3サブユニットを、2つの独立したプロトコルを用いて皮膚創傷治癒に影響を与える潜在的な標的分子として同定した。インビトロアッセイでは、一次線維芽細胞を用いて、これらの細胞はCavβ3タンパク質をコードするCacnb3遺伝子を発現するが、脱分極誘発Ca2+流入または電圧依存性Ca2+電流を欠いている。これらの線維芽細胞におけるCavβ3の新規機能を説明した:Cavβ3はイノシトール1,4,5-トリスリン酸受容体(IP3R)に結合し、小平血小石体からのカルシウム放出を制約する。マウスにおけるCacnb3遺伝子の欠失は、IP3に対するIP3Rの感受性の増加、細胞移動の増強および皮膚創傷修復の増加につながる4.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9 % NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Kai Industries</td>
			<td>48201</td>
			<td>2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297)</td>
			<td>Origene</td>
			<td>SR415626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilation cream</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any depilation cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>3400935940179.00</td>
			<td>(BEPANTHEN)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine)</td>
			<td>Bayer Health Care</td>
			<td></td>
			<td>Rompun 2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagon full nut</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>KETASET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Keyence, Osaka, Japan</td>
			<td>BZ-8000</td>
			<td>Similar microscopes might be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse restrainer</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>plan apo 10x/0.45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene sutures</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwdriver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin disinfectant (octeniderm)</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH</td>
			<td>118212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted cheese head screw</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap ring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap ring plier</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope with camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica M651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium frames for the skinfold chamber</td>
			<td>IROLA</td>
			<td>160001</td>
			<td>Halteblech M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire piler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing

生体創傷治癒障害は、糖尿病患者や高齢者にとって大きな関心事であり、効果的な治療が必要である。適切なインビトロおよびインビボアプローチは、皮膚創傷治癒プロセスを改善するために薬物治療のための新しい標的分子の同定に不可欠である。電圧ゲートカルシウムチャネル(Cavβ3)のβ3サブユニットを、2つの独立したアッセイにおいて創傷治癒に影響を与える潜在的な標的分子として同定した、 すなわち、インビトロスクラッチ移行アッセイおよびインビボ背面皮膚折室内モデル。野生型(WT)およびCavβ3欠損マウス(Cavβ3 KO)または線維芽細胞から急性単離された一次マウス胚性線維芽細胞(MEF)またはsiRNAで処理したWTマウスから急性単離した線維芽細胞は、Cacnb3遺伝子の発現をダウンカトリートする、Cavβ3を符号化し、使用した。コンフルエント細胞単層にスクラッチを適用し、ギャップ閉鎖に続いて、移行細胞によるギャップの完全な再集積まで、定義された時点で顕微鏡画像を撮影した。これらの画像を分析し,各条件について細胞移動速度を決定した.インビボアッセイでは、WTおよびCavβ3 KOマウスに背中の皮膚折室内を移植し、直径2mmの定義された円形創傷を適用し、ガラスカバースリップで創傷を覆い、感染症や乾燥から保護し、マクロスコピック創傷閉鎖を監視した。時間が経つにつれて。創傷閉鎖はCacnb3-遺伝子欠損マウスにおいて有意に速かった。インビボとインビトロアッセイの結果は相関性がよくあるため、インビトロアッセイは、インビボ創傷治癒モデルによるインビトロヒットを検証する前のハイスループットスクリーニングに有用でありよい。野生型およびCavβ3欠損マウスまたは細胞についてここで示したものは、Cavβ3以外の特定の分子にも適用可能である可能性があります。

スクラッチアッセイは、野生型およびβ3欠損MEFのコンフルエント細胞単層に対して行った(図1c)。200 μLピペット先端を使用して「スクラッチ」を実行した後、両方のジェノタイプの細胞がスクラッチ領域に移行し、ギャップを閉じます。画像は6、10、30h(図1a)以降に撮影した。細胞の移行はパーセンテージ(%)スクラッチを実...

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Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

ここでは、一次線維芽細胞を用いてインビトロスクラッチアッセイを行い、マウスにおける生体内皮膚創傷治癒アッセイに関するプロトコルを提示する。両方のアッセイは、インビトロおよびインビボ創傷治癒を評価するための簡単な方法です。

インビトロおよび創傷治癒の生体内分析のためのスクラッチ移行アッセイとドーサルスキンフォールドチャンバー

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

皮膚創傷の治療のための反乱軍の必要性。薬物治療のためのあなたのターゲット分子を同定するために、インビトロおよびインビボ試験システムが必要である。適切なシステムは、インビトロスクラッチアッセイ、およびインビボの下振れ皮膚折りチャンバーである。いずれも、薬理学的に活性な化合物の存在および存在下において、細胞遊動および皮膚創傷治癒をモニタリングするためのまっすぐ進んだ処置である。どちらの方法も簡単ですが、調査員はスクラッチアプリケーションを実践する必要があります。そして、後方皮膚折りチャンバーの移植、および創傷は、信頼性と再現性のある結果を得るために。この手順のデモンストレーションは、臨床および実験外科研究所の外科医で教授のマティアス・ラッシュケ博士によって行われます。手順を開始する前に、各培養物のスクラッチ領域を線分にするために、各ウェルの下部に水平線を使用して、セルタイプごとに1つの6つのウェルプレートをマークするために超微細な永久マーカーを使用してください。次のプレートは、野生型およびβ3欠損マウスから単離された一次繊維ブラストを、5倍の10倍の5倍の5倍の繊維濃度で6つのウェルプレートで、十分濃度当たりの5番目の繊維ブラストを行う。DMEMの2mLで10%のウシ胎児血清を補充した。プレートにセルタイプ、遺伝子型、日付のラベルを付けます。そして、24時間培養インキュベーターにプレートを入れます。翌朝、目的とする各脂質ベースのトランスフェクション試薬の9マイクロリットルを加え、チューブあたり150マイクロの減少した血清培地を含む個々のマイクロ遠心管に添加する。150マイクロリットルの減らされた血清培地を含むトランスフェクション試薬ごとに、2マイクロ遠心分離チューブに1.5マイクロリットルのsiRNAを加えます。そして、各siRNA溶液をトランスフェクション試薬溶液の単一のチューブと混合します。短時間渦を打った後、混合物を摂氏21度で5分間置きます。インキュベーション中は、各ウェルのスーパーネートを慎重に交換してください。2.25mLの新鮮な培養培地を井戸の側面に下ろして。インキュベーションの終わりに、適切なsiRNAトランスフェクション試薬混合物の250マイクロリットルを加え、対応する各ウェルの細胞に賢明にドロップする。そして、72時間細胞培養インキュベーターにプレートを戻す。細胞が100%合流した場合は、各ウェルから培養上清を捨てます。また、200マイクロリットルのピペットチップを使用して、コンフルエントセル単層にスクラッチを作成します。各ウェルの下部にマークされた水平線に垂直。その後、1回の洗浄につき2mLのPPSで、負傷した各々を2回慎重に洗い流します。損傷した細胞、緩い細胞または傷ついた領域からの破片から放出された因子を除去する。2回目の洗浄後、各ウェルに1または10%の血清を添加した2mLの新鮮な細胞培養培地を加える。そして、光顕微鏡のステージ上の各プレートの創傷の画像をキャプチャします。10倍の倍率で引っ掻いた直後。その後、プレートを細胞培養インキュベーターに戻す。次の30時間の間、適切な実験時間で画像をキャプチャし続けます。実験終了時に、培養6時間、10時間及び30時間後の初期細胞フリー領域及び残存領域を定量する。初期スクラッチ領域に対する移行セルによって再設定されたスクラッチ領域の割合を決定します。足の指ピンチへの応答の欠如を確認した後、野生のタイプまたはベータ3ノックアウトC57ブラック6マウスで、慎重にドーサムを剃ります。そして、動物の目に軟膏を適用します。脱毛クリームを適用して、残りの髪を排除します。10分後にクリームを取り除く。チタンチャンバーを準備するには、対称的なチタンチャンバーフレームの一部をナットで接続ネジで固定します。チャンバーの2つの対称部分の間に400〜500マイクロメートルを維持する。皮膚の血液小胞の圧迫を避けるために。70%エタノールで露出した皮膚を消毒する。そして、光源の前で皮膚の折り目をつかみます。皮膚の二重層の中間線を、チタンチャンバーが埋め込まれる場所に配置します。そして、歯ごたえとキャドリーポリプロピレン縫合糸で皮膚折り目を固定します。金属ラックの縫合線の反対側を締め、折りたたんだ皮膚を持ち上げます。そして、マウスが快適に座ることができるようにラックの高さを調整します。チタン室の第1フレームを、その上にポリプロピレン縫合糸を裏面の裏面に縫合して背部皮膚フォールドの裏面に縫合する。沈下を再確認した後、皮膚に小さな切開を行うために細かいはさみを使用してください。そして、チタンチャンバーの前半に取り付けられた2本の接続ネジを、皮折りのベースを通して渡します。ラックからマウスを取り外し、動物を横方向の位置に置きます。3つの接続ねじの上にチタンチャンバーの2番目の無料の半分を置きます。そして手動でチタンフレームの後半を通してこれらのネジを渡すためにわずかな圧力を適用します。折り畳まれた皮膚層は、チタンフレームの2つの対称的な半分の間に挟まれています。その後、ステンレス鋼ナットで両方の対称部品を固定します。標準化された直径2mLの生検パンチを使用して、皮膚の中央に創傷領域をマークし、皮膚折りたたみチャンバーの観察窓内で。そして、細かい鉗子とはさみを使用して、マーク内の表皮と真皮全体を取り除きます。円形の巻を作成します。0.5mLの滅菌生理液で3.5mLの2乗の創傷を3.5m以上に洗浄します。そして、ガラスのカバースリップで傷口を覆います。チタンチャンバーのスナップリングペンチを使用して、カバースリップを所定の位置に固定します。そして、すぐに実体顕微鏡の撮像段階にマウスを移す。その後、40倍の倍率で傷を画像化します。完全な回復まで監視とケージにマウスを置く前に。200マイクロリットルのピペットチップを使用してスクラッチを作成した後、この代表的な実験では、両方の遺伝子型の細胞がスクラッチ領域に移行し、ギャップを閉じました。次に、細胞移動を、スクラッチを行ってから6時間後に細胞を移行させることにより、スクラッチ領域の再取り込みの割合として定量した。例えばこの実験では、Cav beta3欠損した繊維ブラストを移行し、野生型マウスからの繊維ブラストよりも大幅に早くスクラッチ領域を閉じた。Cav β3欠損型繊維爆風で観察されたCav β3依存効果を確認するために、野生型繊維ブラストをsiRNAにトランスフェクトし、Cav β3タンパク質をダウン調節した。Cav β3特異的なsiRNAで処理された繊維ブラストは、β3欠損繊維ブラストのように振る舞った。両遺伝子型間の皮膚創傷治癒を比較するために、皮膚折り畳みチャンバーの創傷領域を創傷直後に撮影した。そして、創傷は次の2週間にわたって画像化された。創傷の大きさは、画像および創傷領域で測定され、所定の日に、初期創傷領域の割合として表した。予想通り、野生型制御と比較してCav β3欠損マウスにおいて創傷閉鎖率が増加した。各スクラッチのために、ピペットチップに等しい圧力を加え、できるだけプレート底部のマークされた線に傷を一致させます。下方皮膚折りチャンバーの観察窓は、治癒プロセス中にいつでも開くことができます。異なる薬理学的に活性な化合物の局所適用を可能にする。また、治癒過程の異なる段階で傷ついた領域を切除することも可能である。分子タンパク質生化学または組織学的分析のため。

Research

JoVE Journal

Medicine

Murine Model of Wound Healing

創傷治癒のマウスモデル

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Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

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マウス内視鏡検査のため<em&gt;インビボ</em&gt;発がんと腸の評価のマルチモーダルイメージング創傷治癒および炎症

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

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Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

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Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

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顕微鏡法によるIn Vitro創傷が治癒過程における上皮移行の評価

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角膜上皮摩耗眼はりのモデルとして角膜創傷治癒

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