Name: scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing
Uploaded: 2019-09-26T13:00:00
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우리는 박사 페트라 바이스 거버와 SPF 동물 시설의 트랜스 유전자 단위 (SFB의 프로젝트 P2 894) 의료 학부의 및 자를 란트 대학의 의료 학부에서 임상 및 실험 수술 연구소의 동물 시설, 홈버그. 안드레아스 벡 박사님이 원고를 비판적으로 읽어 주신 것에 감사드립니다. 이 연구는 도이치 포르충스게마인샤프트(DFG) 손더포스충스베라이히(SFB) 894, A3~A.B. 및 V.F.에 의해 지원되었다.

모든 실험 절차는 자를란트 와 자를란트 대학의 윤리 규정 및 동물 복지위원회에 따라 승인되고 수행되었습니다.
1 1 1 차적인 세포 배양 및 siRNA 형질감염
참고 : 설명 된 방법에서 1 차 섬유 아세포가 사용됩니다. 이들 세포는 상처 치유 및 조직 리모델링11에중요한 역할을 한다. 본 실험에서, Cacnb3 유전자는, 고전압 게이트 칼슘<sup cl...

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	<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li><li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing--aiming+for+perfect+skin+regeneration.">Wound healing--aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276, 75-81 (1997).</li><li>Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+actin+cytoskeleton+during+early+endothelial+regeneration+in+vitro.">Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro.</a> Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).</li><li>Belkacemi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP3+Receptor-Dependent+Cytoplasmic+Ca(2+)+Signals+Are+Tightly+Controlled+by+Cavbeta3.">IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3.</a> Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).</li><li>Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healing+of+partial+thickness+porcine+skin+wounds+in+a+liquid+environment.">Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment.</a> Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).</li><li>Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+wounds+in+the+MRL/MPJ+mouse+heal+with+scar.">Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar.</a> Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).</li><li>Vagesjo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+in+mice+by+on-site+production+and+delivery+of+CXCL12+by+transformed+lactic+acid+bacteria.">Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria.</a> Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).</li><li>Eming, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+closure+in+mice+deficient+for+interleukin-10.">Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10.</a> American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).</li><li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber.">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).</li><li>Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dorsal+skinfold+chamber:+window+into+the+dynamic+interaction+of+biomaterials+with+their+surrounding+host+tissue.">The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue.</a> European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).</li><li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration.">Cell migration.</a> Comprehensive Physiology. 2, 2369-2392 (2012).</li><li>Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Alternative+Functions+for+the+Auxiliary+Subunits+of+the+Voltage-Gated+Calcium+Channels.">Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels.</a> Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+4.1G+Regulates+Cell+Adhesion,+Spreading,+and+Migration+of+Mouse+Embryonic+Fibroblasts+through+the+beta1+Integrin+Pathway.">Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).</li><li>Dewor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+migration+inhibitory+factor+(MIF)+promotes+fibroblast+migration+in+scratch-wounded+monolayers+in+vitro.">Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro.</a> FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).</li><li>Handly, L. N., Wollman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound-induced+Ca(2+)+wave+propagates+through+a+simple+release+and+diffusion+mechanism.">Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism.</a> Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).</li><li>Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+In+Vitro+Wound+Healing+Assay+to+Evaluate+Cell+Migration.">A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), 56825 (2018).</li><li>Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular+and+Affordable+Time-Lapse+Imaging+and+Incubation+System+Based+on+3D-Printed+Parts,+a+Smartphone,+and+Off-The-Shelf+Electronics.">A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics.</a> PLoS One. 11, 0167583 (2016).</li><li>Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+adhesion+and+migration.">Endothelial cell adhesion and migration.</a> Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).</li><li>Treloar, K. K., Simpson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+of+edge+detection+methods+for+quantifying+cell+migration+assays.">Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays.</a> PLoS One. 8, 67389 (2013).</li><li>Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+starvation:+caveat+emptor.">Serum starvation: caveat emptor.</a> American Journal of Physiology-Cell Physioliology. 301, 272-279 (2011).</li><li>Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+access+chamber+for+the+rat+dorsal+skin+fold.">A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold.</a> Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).</li><li>Deoliveira, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ear+punch+model+for+studying+the+effect+of+radiation+on+wound+healing.">An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing.</a> International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).</li><li>Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+excisional+wound+model:+Contraction+revisited.">The murine excisional wound model: Contraction revisited.</a> Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).</li><li>Dunn, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+wound+healing.">Murine model of wound healing.</a> Journal of Visualized Experiment. (75), e50265 (2013).</li><li>Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juglone+ameliorates+skin+wound+healing+by+promoting+skin+cell+migration+through+Rac1/Cdc42/PAK+pathway.">Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway.</a> Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).</li></ol>

이 원고에서, 우리는 생체 외 및 생체 내 상처 치유 분석기를 설명하고 얻어진 결과를 상관시상한다. 시험관내 분석의 경우, 1차 마우스 섬유아세포4,14,15를 사용하였으며 이는 상처 치유 및 조직 리모델링에 중요한 역할을 한다11. 단층으로 성장하는 다른 부착 세포 유형 (예를 들어, 상피 세포, 내피 세포, 각?...

피부 상처 치유는 피부의 무결성을 회복하고 감염으로부터 유기체를 보호하기 위해 피부 손상 직후에 시작됩니다. 상처 치유 과정은 네 개의 겹치는 단계를 거칩니다. 응고, 염증, 새로운 조직 형성 및 조직 리모델링1. 세포 마이그레이션은 이러한 단계에서 매우 중요합니다. 염증성 세포, 면역 세포, 각질 세포, 내피 세포 및 섬유아세포는 상이한 시점에서 활성화되고 상처 부위2를침범한다. 시험관 내 및 생체 내 상처 치유를 조사하는 방법은 근본적인 메커니즘을 이해하는 것뿐만 아니라 새로운 약물을 테스트하고 피부 상처 치유를 개량하고 가속화하는 것을 목표로하는 새로운 전략을 개발하는 데 큰 관심이 있습니다.
셀 마이그레이션을 모니터링하고 분석하기 위해 스크래치 마이그레이션 분석을 사용할 수 있습니다. 그것은 종종 시험관 내 상처 치유 분석이라고합니다. 이 방법은 세포 배양 시설3을필요로 한다. 그것은 간단한 절차이고, 고급 장비의 필요가 없고 대부분의 세포 생물학 실험실에서 분석이 수행될 수 있습니다. 이 분석에서, 무세포 영역은 동봉된 세포 단층, 바람직하게는 상피-또는 내피 유사 세포 또는 섬유아세포의 기계적 파괴에 의해 생성된다. 스크래치 가장자리의 셀은 생성된 간격을 다시 채우기 위해 마이그레이션됩니다. 시간이 지남에 따라 감소하는 세포 없는 영역의 정량화는 이동 속도와 유사하며 세포가 간격을 좁힐 필요가 있는 시간을 나타냅니다. 이를 위해, 조사자는 WT 마우스 또는 관심 유전자가 결여된 마우스로부터의 급성 단리된 세포또는4, 또는 신뢰할 수 있는 세포 저장소로부터 사용할 수 있는 불멸의 세포를 사용할 수 있다. 스크래치 분석법은 약리활성 화합물의 영향 또는 형질 감염된 cDNAs 또는 siRNAs가 세포 이동에 미치는 영향을 연구할 수 있게 합니다.
생체 내에서 상처 치유는 피부의 물리적 무결성을 가능한 한 빨리 복원하기 위해 각질 세포, 염증 세포, 섬유 아세포, 면역 세포 및 내피 세포를 포함한 다양한 세포 유형을 필요로하는 복잡한 생리적과정입니다 1 . 생체 내에서 연구하는 다른 방법은 과거5,6,7,8에서개발및 사용되어 왔다. 본 항에 기재된 등쪽 피부접이식 챔버는 이전에 상처 치유 어세9에사용되었다. 마우스에 대한 변형된 등지 피부 접힘 챔버 제제로서 사용된다. 변형된 스킨폴드 챔버 모델은 몇 가지 장점이 있다. 1) 그것은 상처 치유 과정을 관찰하는 것을 방지하고 마우스의 상처 수리에 영향을 미칠 수있는 피부 수축을 최소화합니다. 2) 이 챔버는 유리 커버 슬립으로 상처를 덮어 조직 감염과 탈수를 줄여 치유 과정을 지연시킬 수 있습니다. 3) 혈류와 혈관을 직접 모니터링 할 수 있습니다. 4) 상처를 치료하고 치유를 가속화하기 위해 약리활성 화합물 및 시약의 반복적 인 국소 적용을허용9,10.
우리는 고전압 게이트 칼슘 채널 (Cavβ3)의 β3 소단위를 두 개의 독립적 인 프로토콜, 즉 생체 외 스크래치 이동 분석 및 생체 내 등쪽 피부 접힘 챔버 모델을 사용하여 피부 상처 치유에 영향을 미치는 잠재적 인 표적 분자로 확인했습니다. 시험관내 분석의 경우, 우리는 1차 섬유아세포를 사용하였지만, 이들 세포는 Cavβ3 단백질을 코딩하는 Cacnb3 유전자를 발현하지만 탈분극 유도된Ca2+ 유입 또는 전압 의존적Ca2+ 전류가 부족하다. 우리는 이 섬유아세포에서 Cavβ3의 새로운 기능을 기술했습니다: Cavβ3는 이노시톨 1,4,5-삼위산염 수용체(IP3R)에 결합하고 소포체로부터 칼슘 방출을 제약합니다. 마우스에서 Cacnb3 유전자의 삭제는 IP3에 대한 IP3R의 감도 증가, 향상된 세포 이동 및 증가된 피부 상처 복구4를유도한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9 % NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Kai Industries</td>
			<td>48201</td>
			<td>2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297)</td>
			<td>Origene</td>
			<td>SR415626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilation cream</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any depilation cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>3400935940179.00</td>
			<td>(BEPANTHEN)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine)</td>
			<td>Bayer Health Care</td>
			<td></td>
			<td>Rompun 2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagon full nut</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>KETASET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Keyence, Osaka, Japan</td>
			<td>BZ-8000</td>
			<td>Similar microscopes might be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse restrainer</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>plan apo 10x/0.45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene sutures</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwdriver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin disinfectant (octeniderm)</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH</td>
			<td>118212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted cheese head screw</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap ring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap ring plier</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope with camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica M651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium frames for the skinfold chamber</td>
			<td>IROLA</td>
			<td>160001</td>
			<td>Halteblech M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire piler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing

손상된 절단 상처 치유는 당뇨병을 앓고있는 환자와 노인에게 중요한 관심사이며 효과적인 치료가 필요합니다. 적절한 생체외 및 생체내 접근법은 피부 상처 치유 과정을 개선하기 위한 약물 치료를 위한 새로운 표적 분자의 식별에 필수적이다. 우리는 전압 게이트 칼슘 채널 (Cavβ3)의 β3 소단위를 두 개의 독립적 인 분석법, 즉 생체 외 스크래치 이동 분석 및 생체 내 등쪽 피부 접힘 챔버 모델에서 상처 치유에 영향을 미치는 잠재적 인 표적 분자로 확인했습니다. 1 차 마우스 배아 섬유아세포 (MEFs) 야생 형 (WT) 및 Cavβ3 결핍 마우스 (Cavβ3 KO) 또는 SiRNA로 처리 된 WT 마우스로부터 급성으로 분리 된 섬유 아세포는 Cacnb3 유전자의 발현을 하향 조절합니다. , Cavβ3을 인코딩하여 사용했습니다. 스크래치는 결합 된 세포 단층에 적용하고 갭 클로저는 마이그레이션 셀에 의해 갭의 완전한 재모독까지 정의 된 시점에서 현미경 이미지를 복용하여 뒤따랐다. 이들 이미지는 분석되었고, 각 조건에 대해 세포 이동 속도를 결정하였습니다. 생체 내 분석에서, 우리는 WT와 Cavβ3 KO 마우스에 등쪽 피부 접이식 챔버를 이식하고, 직경 2mm의 정의된 원형 상처를 적용하고, 감염및 탈수로부터 보호하기 위해 유리 커버 슬립으로 상처를 덮고, 거시적 상처 폐쇄를 모니터링했습니다. 시간이 지남에 따라. 상처 폐쇄는 Cacnb3-유전자결핍 마우스에서 상당히 빨랐다. 생체외 분석의 결과는 생체외 분석과 상관관계가 잘 연관되기 때문에, 시험관내 분석노는 생체내 상처 치유 모델에 의한 시험관 내 안타를 검증하기 전에 높은 처리량 스크리닝에 유용할 수 있다. 우리가 야생형 및 Cavβ3 결핍 마우스 또는 세포를 위해 여기에서 보여준 것은 또한 Cavβ3 이외에 특정 분자를 위해 적용될 수 있습니다.

스크래치 분석은 야생형 및 β3 결핍 MEFs의 동시 세포 단층상에서 수행하였다(도1c). 200 μL 파이펫 팁을 사용하여 "스크래치"를 수행 한 후, 두 유전형의 세포가 스크래치 영역으로 이동하고 간격을 닫습니다. 이미지는 6, 10 및 30시간 후에 촬영하였다(도1a). 셀 마이그레이션을 백분율(%)으로 정량화했습니다. 스크래치 를 수행한 ?...

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Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

여기서, 우리는 1차 섬유아세포를 이용한 시험관내 스크래치 분석및 마우스에서 의 피부 상처 치유 분석실험을 위한 프로토콜을 제시한다. 두 방법 모두 시험관 내 및 생체 내 상처 치유를 평가하는 간단한 방법입니다.

스크래치 마이그레이션 분석 및 등갈 피부 접기 챔버 에서 생체 외 및 상처 치유의 생체 내 분석

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

피부 상처의 치료에 대한 반란의 필요성. 약물 치료에 대 한 대상 분자를 식별 하려면, 시험 관 및 생체 내 테스트 시스템 필요. 적절한 시스템은 생체 외 스크래치 분석, 및 생체 내 등등 피부 접이식 챔버입니다.둘 다 약리학적활성 화합물의 부재와 존재에서 세포 이동 및 피부 상처 치유를 모니터링하기위한 직선 앞으로 절차입니다. 두 기술이 모두 직선적이지만 조사관은 스크래치 응용 프로그램을 연습해야 합니다. 그리고 등변 피부 접이식 챔버 이식, 그리고 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 얻기 위해 상처.절차의 데모는 박사 마티아스 Laschke에 의해 수행됩니다, 임상 및 실험 수술 연구소의 외과 의사 및 교수. 절차를 시작하기 전에 초미세 영구 마커를 사용하여 셀 유형당 6 개의 우물 플레이트를 표시하고 각 웰의 하단에 수평 선이 되어 각 배양에 대한 스크래치 영역을 묘사합니다. 다음 플레이트 1차 섬유 폭발은 야생형 및 베타 3 결핍 마우스로부터 분리되어, 6개의 웰 플레이트에서 5배 10에서 5배 의 5배 섬유 폭발에 잘 농도당 폭발한다.DMEM의 2mL에서 10 %의 태아 소 세럼으로 보충. 세포 유형, 유전자형 및 날짜로 플레이트에 레이블을 지정합니다. 그리고 24 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 배치합니다.다음 날 아침, 각 지질 기반 의 형질 전환 시약의 마이크로 리터 9 마이크로 리터를 튜브 당 150 마이크로 리터의 감소 된 혈청 매질을 포함하는 개별 마이크로 원심 분리 튜브에 추가합니다. 튜브 당 150 마이크로 리터의 감소 된 혈청 매체를 포함하는 transfection 시약 당 두 번째 마이크로 원심 분리튜브에 1.5 마이크로 리터의 siRNA를 추가하십시오. 각 siRNA 용액을 단일 형질 시약 용액과 혼합합니다.잠시 소용돌이 후 혼합물을 섭씨 21도에서 5분간 배치합니다. 인큐베이션 동안 각 우물의 슈퍼네이트를 조심스럽게 교체하십시오. 우물의 측면 아래로 신선한 문화 매체의 2.25mL.인큐베이션의 끝에서 적절한 siRNA 경질 시약 혼합물의 250 마이크로 리터를 추가하고, 세포의 각 해당 우물에 현명하게 드롭. 그리고 72 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 반환합니다. 세포가 100%에 도달하면 각 우물에서 배양 상류를 폐기하십시오.그리고 200 마이크로 리터 파이펫 팁을 사용하여 컨클레이트 셀 단층에서 스크래치를 만듭니다. 각 웰의 하단에 표시된 수평 선으로 수직입니다. 그런 다음 조심스럽게 세차 당 PPS의 2mL로 2 번 잘 부상 각 상처를 씻어.손상된 세포에서 방출된 요인을 제거하려면, 긁힌 부위에서 느슨한 세포 또는 파편. 두 번째 세척 후 신선한 세포 배양 배지의 2mL을 각 우물에 1 또는 10 %의 혈청으로 보충합니다. 그리고 가벼운 현미경의 단계에서 각 접시에 상처의 이미지를 캡처합니다.10X 배율에서 긁힌 직후. 그런 다음 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 되돌려 놓습니다. 다음 30시간 동안 적절한 실험 시간 지점에서 이미지를 계속 캡처합니다.실험의 끝에서 초기 세포 자유 영역과 6, 10 및 30 시간의 배양 후 남은 영역을 정량화한다. 초기 스크래치 영역을 기준으로 마이그레이션 셀에 의해 다시 채워진 스크래치 영역의 백분율을 결정합니다. 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 야생 유형 또는 베타 3 녹아웃 C57 블랙 6 마우스에서, 신중하게 dorsum을 면도.그리고 동물의 눈에 연고를 적용합니다. 남은 모발을 제거하기 위해 디필 크림을 바르습니다. 10 분 후에 크림을 제거합니다.티타늄 챔버를 준비하려면 대칭 티타늄 챔버 프레임의 한 부분을 너트와 연결된 나사로 수정합니다. 챔버의 두 대칭 부분 사이에 400 내지 500 마이크로미터를 유지한다. 피부에 혈액 소포의 압축을 피하기 위해.노출된 피부를 70%에탄올로 소독합니다. 그리고 광원 앞에서 피부의 주름을 잡습니다. 티타늄 챔버가 이식될 곳에 피부 의 이중 층의 중간 선을 배치합니다.그리고 두개골과 캐디폴리 프로필렌 봉합사로 피부 주름을 고정합니다. 접힌 피부를 들어 올리기 위해 금속 랙에 봉합사의 반대편을 조입니다. 그리고 마우스가 편안하게 앉을 수 있도록 랙의 높이를 조정합니다.티타늄 챔버의 첫 번째 프레임을 등쪽 피부 주름의 뒷면에 우수한 가장자리에 폴리 프로필렌 봉합사에 의해 봉합. 세이빙을 재확인한 후 미세 한 가위를 사용하여 피부에 작은 절개를 만듭니다. 그리고 티타늄 챔버의 상반기에 부착 된 두 개의 연결 나사를 피부 주름의 베이스를 통해 전달합니다.랙에서 마우스를 제거하고 동물을 측면 위치에 놓습니다. 티타늄 챔버의 두 번째 무료 반쪽을 3개의 연결 나사 위에 놓습니다. 그리고 티타늄 프레임의 후반을 통과하기 위해 수동으로 약간의 압력을 가합니다.접힌 피부 층은 이제 티타늄 프레임의 두 대칭 반쪽 사이에 끼어 있습니다. 그런 다음 스테인레스 스틸 너트로 대칭 부품을 모두 수정합니다. 표준화된 2mL 직경생검 펀치를 사용하여 피부 접이식 챔버의 관찰 창 내에서 피부 중앙에 있는 상처 부위를 표시합니다.그리고 미세 한 집게와 가위를 사용하여 마크 내의 전체 표피와 진피를 제거합니다. 원형 상처를 만들수 있습니다. 멸균 식염수 0.5mL로 3반~4반의 밀로미터 제곱 상처를 청소합니다.그리고 유리 커버 슬립으로 상처를 덮습니다. 티타늄 챔버의 스냅 링 펜치를 사용하여 커버슬립을 제자리에 고정시하십시오. 그리고 마우스를 스테레오 현미경의 이미징 단계로 즉시 전송합니다.그런 다음 상처를 40배배속도로 이미지화합니다. 마우스를 전체 복구할 때까지 모니터링하여 케이지에 넣기 전에. 입증된 바와 같이 200 마이크로 리터 파이펫 팁을 사용하여 스크래치를 만든 후, 이 대표적인 실험에서 두 유전자형의 세포가 스크래치 영역으로 이동하고 간격을 닫았다.세포 이동은 스크래치를 수행한 후 6시간 동안 세포를 마이그레이션하여 다시 채워진 스크래치 영역의 백분율로 정량화되었다. 예를 들어 Cav beta 3 결핍 섬유 폭발을 마이그레이션하는 이 실험에서 야생 형 마우스의 섬유 폭발보다 훨씬 일찍 스크래치 영역을 폐쇄했습니다. Cav 베타 3 결핍 섬유 폭발에서 관찰된 Cav beta 3 의존효과를 확인하기 위해, 야생형 섬유 폭발은 Cav beta 3 단백질을 조절하기 위해 siRNA에 감염되었다.Cav 베타 3 특정 siRNAs로 처리된 섬유 폭발은 베타 3 결핍 섬유 폭발처럼 행동합니다. 두 유전자형 사이의 피부 상처 치유를 비교하기 위해, 피부 접이식 챔버의 상처 부위는 상처 후 직접 촬영되었다. 그리고 상처는 다음 2 주 동안 이미지되었다.상처의 크기는 이미지와 상처 부위에 측정되었으며, 주어진 날에는 초기 상처 부위의 백분율로 표현되었다. 예상대로 카베 베타 3 결핍 마우스에서 상처 폐쇄율이 야생형 대조군과 비교하여 증가하였다. 각 스크래치에 대해 파이펫 팁에 동일한 압력을 가하고 스크래치를 플레이트 바닥의 표시된 선에 가능한 한 가깝게 일치해야 합니다.등등 피부 접이식 챔버의 관찰 창은 치유 과정에서 언제든지 열 수 있습니다. 다른 약리학적 활성 화합물의 국소 적용을 허용. 또한 치유 과정의 다른 단계에서 부상당한 부위를 소비 할 수 있습니다.분자 단백질 생화학 적 또는 조직학적 분석을 위해.

Research

JoVE Journal

Medicine

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연구

의학

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