Name: scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing
Uploaded: 2019-09-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing at JoVE.com

Vi takker Dr. Petra Weissgerber og transgene Unit av SPF dyr anlegget (prosjekt P2 av SFB 894) av medisinsk fakultet og dyret anlegget ved Institutt for klinisk og eksperimentell kirurgi ved medisinsk fakultet Saarland University, Homburg. Vi takker Dr. Andreas Beck for kritisk lesning av manuskriptet. Denne studien ble finansiert av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, prosjekt a3 til A.B. og V.F.).

Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent og utført i samsvar med etikk regelverket og dyrevelferd komiteer i Saarland og Saarland University.
1 primær cellekultur og siRNA transfeksjoner
Merk: i den beskrevne metoden brukes primær fibroblaster. Disse cellene spiller en avgjørende rolle i såret healing og vev remodeling11. I dette eksperimentet, det Cacnb3 genet, koding av Cavβ3 delenhet av høy spenning-gated kalsiumkanaler<s...

<ol>
	<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li><li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing--aiming+for+perfect+skin+regeneration.">Wound healing--aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276, 75-81 (1997).</li><li>Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+actin+cytoskeleton+during+early+endothelial+regeneration+in+vitro.">Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro.</a> Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).</li><li>Belkacemi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP3+Receptor-Dependent+Cytoplasmic+Ca(2+)+Signals+Are+Tightly+Controlled+by+Cavbeta3.">IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3.</a> Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).</li><li>Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healing+of+partial+thickness+porcine+skin+wounds+in+a+liquid+environment.">Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment.</a> Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).</li><li>Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+wounds+in+the+MRL/MPJ+mouse+heal+with+scar.">Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar.</a> Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).</li><li>Vagesjo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+in+mice+by+on-site+production+and+delivery+of+CXCL12+by+transformed+lactic+acid+bacteria.">Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria.</a> Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).</li><li>Eming, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+closure+in+mice+deficient+for+interleukin-10.">Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10.</a> American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).</li><li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber.">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).</li><li>Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dorsal+skinfold+chamber:+window+into+the+dynamic+interaction+of+biomaterials+with+their+surrounding+host+tissue.">The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue.</a> European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).</li><li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration.">Cell migration.</a> Comprehensive Physiology. 2, 2369-2392 (2012).</li><li>Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Alternative+Functions+for+the+Auxiliary+Subunits+of+the+Voltage-Gated+Calcium+Channels.">Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels.</a> Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+4.1G+Regulates+Cell+Adhesion,+Spreading,+and+Migration+of+Mouse+Embryonic+Fibroblasts+through+the+beta1+Integrin+Pathway.">Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).</li><li>Dewor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+migration+inhibitory+factor+(MIF)+promotes+fibroblast+migration+in+scratch-wounded+monolayers+in+vitro.">Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro.</a> FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).</li><li>Handly, L. N., Wollman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound-induced+Ca(2+)+wave+propagates+through+a+simple+release+and+diffusion+mechanism.">Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism.</a> Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).</li><li>Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+In+Vitro+Wound+Healing+Assay+to+Evaluate+Cell+Migration.">A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), 56825 (2018).</li><li>Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular+and+Affordable+Time-Lapse+Imaging+and+Incubation+System+Based+on+3D-Printed+Parts,+a+Smartphone,+and+Off-The-Shelf+Electronics.">A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics.</a> PLoS One. 11, 0167583 (2016).</li><li>Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+adhesion+and+migration.">Endothelial cell adhesion and migration.</a> Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).</li><li>Treloar, K. K., Simpson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+of+edge+detection+methods+for+quantifying+cell+migration+assays.">Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays.</a> PLoS One. 8, 67389 (2013).</li><li>Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+starvation:+caveat+emptor.">Serum starvation: caveat emptor.</a> American Journal of Physiology-Cell Physioliology. 301, 272-279 (2011).</li><li>Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+access+chamber+for+the+rat+dorsal+skin+fold.">A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold.</a> Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).</li><li>Deoliveira, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ear+punch+model+for+studying+the+effect+of+radiation+on+wound+healing.">An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing.</a> International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).</li><li>Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+excisional+wound+model:+Contraction+revisited.">The murine excisional wound model: Contraction revisited.</a> Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).</li><li>Dunn, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+wound+healing.">Murine model of wound healing.</a> Journal of Visualized Experiment. (75), e50265 (2013).</li><li>Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juglone+ameliorates+skin+wound+healing+by+promoting+skin+cell+migration+through+Rac1/Cdc42/PAK+pathway.">Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway.</a> Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).</li></ol>

I dette manuskriptet, beskriver vi en in vitro og in vivo såret healing analysen og relatere resultatene oppnådd. For in vitro-analysen, brukte vi primær mus fibroblaster4,14,15 som spiller en viktig rolle i såret healing og vev remodeling11. Andre tilhenger celletyper som vokser som monolagere (f. eks, epitelceller, endothelial celler, keratinocytter) kan brukes også. Plating samme antall levedyktig...

Skin sår healing starter umiddelbart etter hudskader for å gjenopprette hudens integritet og for å beskytte organismen fra infeksjoner. Sår helbredelsesprosessen går gjennom fire overlappende faser; blødnings, betennelse, nye vevs dannelse og vevs remodeling1. Celle migrering er avgjørende i disse fasene. Inflammatoriske celler, immunceller, keratinocytter, endothelial celler, og fibroblaster er aktivert på ulike tidspunkt poeng og invadere såret området2. Metoder for å undersøke såret healing in vitro og in vivo er av stor interesse ikke bare å forstå de underliggende mekanismene, men også for å teste nye legemidler og å utvikle nye strategier som tar sikte på å forbedre og akselerere huden sår helbredelse.
For å overvåke og analysere celle migrering, kan du bruke scratch Migration-analysen. Det er ofte referert til som in vitro såret healing analysen. Denne metoden krever en cellekultur anlegg3. Det er en enkel prosedyre, er det ikke behov for High-End utstyr og analysen kan utføres i de fleste cellebiologi laboratorier. I denne analysen er en celle-fritt område skapt av mekanisk forstyrrelse av en confluent celle monolag, fortrinnsvis epitel-eller endothelial-lignende celler eller fibroblaster. Celler på kanten av scratch vil migrere for å gjenbefolke det opprettede gapet. Kvantifisering av den synkende celle-fritt område over tid ligner migrasjon hastighet og indikerer tiden, som cellene trenger for å lukke gapet. For dette formålet, kan etterforskere bruke enten akutt isolerte celler fra WT mus eller mus mangler et gen av interesse4, eller udødeliggjort celler tilgjengelig fra pålitelige celle repositories. Scratch analysen gjør det mulig å studere påvirkning av farmakologisk aktive forbindelser eller effekten av transfekterte cDNAs eller siRNAs på celle migrasjon.
In vivo, er sår helbredelse en kompleks fysiologisk prosess, som krever ulike celletyper, inkludert keratinocytter, inflammatoriske celler, fibroblaster, immunceller og endothelial celler for å gjenopprette hudens fysiske integritet så raskt som mulig1 . Ulike metoder for å studere in vivo såret healing har blitt utviklet og brukt i de siste5,6,7,8. Rygg skinfold kammeret beskrevet i denne artikkelen ble tidligere brukt til sår healing-analyser9. Den brukes som en modifisert rygg skinfold kammer forberedelse til mus. Den modifiserte skinfold kammer modellen har flere fordeler. 1) det minimerer hud sammentrekning, som hindrer observere sår helbredelsesprosessen og kan påvirke såret reparasjon i mus. 2) dette kammeret gjør bruk av dekker såret med et glass dekkglass, redusere vevs infeksjoner og uttørking, som kan forsinke helbredelsesprosessen. 3) blodstrøm og endometrial blodkar kan overvåkes direkte. 4) det tillater repeterende aktuell anvendelse av farmakologisk aktive forbindelser og reagenser for å behandle såret og akselerere helbredelse9,10.
Vi identifiserte β3 delenhet av høyspennings-gated kalsiumkanaler (Cavβ3) som en potensiell mål molekyl å påvirke huden såret healing ved hjelp av to uavhengige protokoller, dvs., in vitro scratch migrasjon analysen og in vivo rygg skinfold kammer modell. For in vitro-analysen, brukte vi primære fibroblaster, disse cellene gjør uttrykke Cacnb3 genet koding av Cavβ3 protein, men mangel depolarization-indusert ca2 + tilstrømningen eller spennings avhengig ca2 + strømninger. Vi beskrev en ny funksjon av Cavβ3 i disse fibroblaster: Cavβ3 binder seg til Inositol 1, 4, 5-trisphosphate reseptor (IP3R) og begrensninger kalsium utgivelse fra endoplasmatiske retikulum. Sletting av Cacnb3 genet i mus fører til økt følsomhet av IP3R for IP3, forbedret celle migrasjon og økt hud såret reparasjon4.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9 % NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Kai Industries</td>
			<td>48201</td>
			<td>2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297)</td>
			<td>Origene</td>
			<td>SR415626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilation cream</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any depilation cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>3400935940179.00</td>
			<td>(BEPANTHEN)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine)</td>
			<td>Bayer Health Care</td>
			<td></td>
			<td>Rompun 2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagon full nut</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>KETASET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Keyence, Osaka, Japan</td>
			<td>BZ-8000</td>
			<td>Similar microscopes might be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse restrainer</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>plan apo 10x/0.45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene sutures</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwdriver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin disinfectant (octeniderm)</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH</td>
			<td>118212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted cheese head screw</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap ring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap ring plier</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope with camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica M651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium frames for the skinfold chamber</td>
			<td>IROLA</td>
			<td>160001</td>
			<td>Halteblech M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire piler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing

Nedsatt hud såret healing er en stor bekymring for pasienter som lider av diabetes og for eldre mennesker, og det er behov for en effektiv behandling. Hensiktsmessig in vitro og in vivo tilnærminger er avgjørende for identifisering av nye målmolekyler for narkotika behandlinger for å forbedre huden sår helbredelsesprosessen. Vi identifiserte β3 delenhet av spennings-gated kalsiumkanaler (Cavβ3) som en potensiell mål molekyl å påvirke såret healing i to uavhengige analyser, dvs., in vitro scratch migrasjon analysen og in vivo rygg skinfold kammer modell. Primær mus embryonale fibroblaster (MEFs) akutt isolert fra vill-type (WT) og CAVβ3-mangelfull mus (CAVβ3 ko) eller FIBROBLASTER akutt isolert fra WT mus behandlet med siRNA å ned-regulere uttrykket av Cacnb3 Gene , koding CAVβ3, ble brukt. En ripe ble brukt på en confluent celle monolag og gapet nedleggelsen ble fulgt ved å ta mikroskopiske bilder på definerte tidspunkt poeng til fullstendig Repopulation av gapet ved å migrere celler. Disse bildene ble analysert, og cellen migrasjon rate ble bestemt for hver tilstand. I en in vivo-analyse implantert vi en rygg skinfold kammer på WT og Cavβ3 KO mus, anvendt en definert sirkulær sår på 2 mm diameter, dekket såret med et glass dekkglass for å beskytte den mot infeksjoner og uttørking, og overvåket makroskopisk såret nedleggelse over tid. Såret lukking var betydelig raskere i Cacnb3-genet-mangelfull mus. Fordi resultatene av in vivo og in vitro-analysene samsvarer godt, kan in vitro-analysen være nyttig for screening med høy gjennomstrømming før validering av in vitro-treffene ved in vivo-såret helbredende modell. Det vi har vist her for vill-type og CAVβ3-mangelfull mus eller celler kan også være aktuelt for spesifikke molekyler enn Cavβ3.

Scratch-analysen ble utført på en confluent celle monolag av vill-type og β3-mangelfull MEFs (figur 1c). Når du har utført "scratch" ved hjelp av et 200-genotyper μL pipette, migrerer celler fra begge i kladdeområdet og lukker gapet. Bildene ble tatt etter 6, 10 og 30 h (figur 1a). Celle overføringen ble kvantifisert som prosentandel (%) av kladdeområdet repopulated ved å migrere celler 6 timer etter at du har utført ...

Watch this Scientific Journal Video about Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing at JoVE.com

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Her presenterer vi en protokoll for en in vitro scratch analysen ved hjelp av primære fibroblaster og for en in vivo hud såret healing analysen i mus. Begge analysene er enkle metoder for å vurdere in vitro-og in vivo-sår helbredelse.

Scratch Migration analysen og rygg Skinfold Chamber for in vitro og in vivo analyse av såret healing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

Opprørernes behov for behandling av hudsår. For å identifisere dine målmolekyler for medikamentelle behandlinger, er in vitro og in vivo testsystemer nødvendig. Passende systemer er in vitro scratch analyse, og in vivo dorsal hud fold kammer.Begge er rett frem prosedyrer for overvåking av cellemigrasjon og hudsårheling, i fravær og tilstedeværelse av farmakologisk aktive forbindelser. Selv om begge teknikkene er rett frem, bør etterforskerne praktisere scratch-applikasjonen. Og den dorsale hudfoldkammerimplantasjonen, og såret for å oppnå pålitelige og reproduserbare resultater.Demonstrasjon av prosedyrene vil bli gjort av Dr.Matthias Laschke, en kirurg og professor fra institutt for klinisk og eksperimentell kirurgi. Før du begynner prosedyren, bruk en ultra fin permanent markør for å markere en seks brønnplate per celletype, med en horisontal linje nederst i hver brønn for å avgrense scratch-regionen for hver kultur. Neste plate primære fiber blasts isolert fra vill type og beta 3 mangelfulle mus, i en seks brønnplate på en 5 ganger 10 til den femte fiber blasts per brønnkonsentrasjon.I 2ml dmem supplert med 10% fosterbovin serum. Merk platene med celletype, genotype og dato. Og legg platene i cellekulturinkubatoren i 24 timer.Neste morgen legger du til 9 mikro liter av hver lipidbasert transfection reagens av interesse, til individuelle mikrosentriduduer som inneholder 150 mikro liter redusert serummedium per rør. Tilsett 1,5 mikro liter siRNA til et annet mikrosentrigerrør per transfeksjonsreagens som inneholder 150 mikro liter redusert serummedium per rør. Og bland hver siRNA-løsning med ett enkelt rør med transfeksjonsreagensløsning.Etter kort vortexing legg blandingene ved 21 grader Celsius i 5 minutter. Under inkubasjonen erstatter du forsiktig supernatet i hver brønn. Med 2,25ml fersk kultur medium ned på siden av brønnene.På slutten av inkubasjonen tilsett 250 mikro liter av den aktuelle siRNA transfection reagensblandingen, slipp klokt inn i hver tilsvarende brønn av celler. Og returnere platene til cellekulturinkubatoren i 72 timer. Når cellene har nådd 100% samløpet, kast kulturen overnaturant fra hver brønn.Og bruk en 200 mikro liter pipettespiss for å lage riper i den sammensnekkende cellemonolaget. Vertikal til den merkede horisontale linjen nederst i hver brønn. Skyll deretter forsiktig hver sårede godt 2 ganger med 2ml PPS per vask.For å fjerne eventuelle frigjorte faktorer fra skadede celler, løse celler eller rusk fra det ripede området. Etter den andre vasken legge 2ml av fersk celle kultur medium supplert med 1 eller 10 prosent serum til hver brønn. Og ta bilder av sårene i hver plate på scenen av et lett mikroskop.Umiddelbart etter riper på en 10X forstørrelse. Deretter returnerer platen til cellekulturinkubatoren. Fortsetter å ta bilder på de riktige eksperimentelle tidspunktene for de neste 30 timene.På slutten av eksperimentet kvantifiserer det første cellefrie området og gjenværende område etter 6, 10 og 30 timer med kultur. Hvis du vil fastslå prosentandelen av kladdeområdet, befolkes det på nytt av de overførte cellene i forhold til det opprinnelige kladdeområdet. Etter å ha bekreftet mangel på respons på tå klemme, i vill type eller beta tre knockout C57 svart seks mus, forsiktig barbere dorsum.Og påfør salve på dyrets øyne. Påfør hårfjerningskrem for å eliminere gjenværende hår. Fjern kremen etter 10 minutter.For å forberede titankammeret, fest en del av den symmetriske titankammerrammen, med tilkoblingsskruene med muttere. For å opprettholde 400 til 500 mikrometer mellom de to symmetriske delene av kammeret. For å unngå kompresjon av blod vesikler i huden.Desinfiser den eksponerte huden med 70 % etanol. Og grip en hudfold foran en lyskilde. Plasser midtlinjen i det doble hudlaget til der titankammeret skal implanteres.Og kranialt og caudally fikse huden fold med en polypropylen sutur. Stram den andre siden av suturen på et metallstativ for å løfte den brettede huden. Og justere høyden på stativet slik at musen til å sitte komfortabelt.Sutur den første rammen av titankammeret av polypropylen suturer på den overlegne kanten til baksiden av rygghudfolden. Etter reconfirming sedasjon bruke fin saks for å gjøre små snitt i huden. Og pass de to tilkoblingsskruene festet til første halvdel av titankammeret gjennom bunnen av hudfolden.Fjern musen fra stativet, og plasser dyret i sidestilling. Plasser den andre gratis halvdelen av titankammeret på toppen av de 3 tilkoblingsskruene. Og manuelt bruke lite trykk for å passere disse skruene gjennom andre halvdel av titanrammen.Det brettede hudlaget er nå klemt mellom de to symmetriske halvdelene av titanrammen. Fest deretter begge symmetriske delene med muttere i rustfritt stål. Ved hjelp av en standardisert 2ml diameter biopsi punch, markere sårområdet i midten av huden, innenfor observasjonsvinduet i huden fold kammer.Og bruk fine tang og saks for å fjerne hele epidermis og dermis i merket. For å skape et sirkulært sår. Rengjør 3 og en halv til 4 og et halvt milometer kvadrert sår med 0,5 ml steril saltvann.Og dekk såret med en glassdekslelip. Bruk snap ring plier på titankammeret for å feste dekkslippen på plass. Og overfør musen umiddelbart til bildestadiet til et stereomikroskop.Deretter bilde såret på en 40X forstørrelse. Før du plasserer musen i et bur med overvåking til full gjenoppretting. Etter å ha laget en ripe ved hjelp av en 200 mikro liter pipettespiss som demonstrert, i dette representative eksperimentet, migrerte celler fra begge genotyper inn i scratch-området og lukket gapet.Celleoverføringen ble deretter kvantifisert da prosentandelen av kladdeområdet ble befolket på nytt ved å overføre celler 6 timer etter at scratch. For eksempel i dette eksperimentet migrerer Cav beta 3 mangelfulle fibereksplosjoner lukket scratch området betydelig tidligere enn fiber blasts fra vill type mus. For å bekrefte Cav beta 3 avhengig effekt observert i Cav beta 3 mangelfulle fiber blasts, vill type fiber blasts ble transfected med siRNA å ned regulere Cav beta 3 protein.Fiber blasts behandlet med Cav beta 3 spesifikke siRNAs oppførte seg som beta 3 mangelfull fiber blasts. For å sammenligne hudsårheling mellom begge genotyper, ble sårområdet i hudfoldkammeret fotografert rett etter såret. Og såret ble avbildet i løpet av de neste 2 ukene.Størrelsene på sårene ble målt på bildene og sårområdet, på en gitt dag ble uttrykt som prosentandelen av det første sårområdet. Som forventet ble frekvensen av sårlukking økt i Cav beta 3 mangelfulle mus sammenlignet med vill typekontroller. Pass på å legge like trykk på pipettespissen, for hver ripe og for å matche ripene til de merkede linjene på platebunnen så nært som mulig.Observasjonsvinduet i den dorsale hudfoldkammeret kan åpnes når som helst under helbredelsesprosessen. Tillater lokal bruk av ulike farmakologisk aktive forbindelser. Det er også mulig å avgiftsdirektoratet det sårede området på forskjellige stadier av helbredelsesprosessen.For molekylær protein biokjemisk eller histologisk analyse.

Research

JoVE Journal

Medicine

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murine Endoskopi for<em&gt; In Vivo</em&gt; Multimodal Imaging av Carcinogenesis og vurdering av Intestinal sårheling og Betennelse

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Ischemic Tissue Injury in the Dorsal Skinfold Chamber of the Mouse: A Skin Flap Model to Investigate Acute Persistent Ischemia

Iskemisk skade på kroppsvev i Dorsal skinfold Chamber of Mouse: A Skin Flap modell for å undersøke Akutt Vedvarende Ischemia

Despite profound expertise and advanced surgical techniques, ischemia-induced complications ranging from wound breakdown to extensive tissue necrosis are ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Carotisar infusjoner for farmakokinetiske og farmakodynamiske Analyse av Taxaner i Mus

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Nedbryting av museceller fra menneske tumorxenotransplantater forbedrer Nedstrøms Analyse av Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

Utvikling av en direkte Pulp-capping modell for evaluering av pulpal Wound Healing og reparerende Dentin Dannelse i Mus

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Optimalisert Analyse av<em&gt; I Vivo</em&gt; og<em&gt; In Vitro</em&gt; Leversteatose

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

Mikroskopi basert metoder for vurdering av epitelial celle migrasjon ved In Vitro sårheling

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Hornhinnen Epithelial slitasje med okulær Burr som modell for hornhinnen sårtilheling

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...