Name: scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing
Uploaded: 2019-09-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing at JoVE.com

Agradecemos ao Dr. Petra Weissgerber e à unidade transgênica da instalação animal SPF (projeto P2 da SFB 894) da faculdade de medicina e da instalação animal no Instituto de cirurgia clínica e experimental da faculdade de medicina da Universidade de Saarland, Homburg. Agradecemos ao Dr. Andreas Beck pela leitura crítica do manuscrito. Este estudo foi financiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, projeto a3 para A.B. e V.F.).

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados e realizados de acordo com os regulamentos de ética e os comitês de bem-estar animal da Saarland e da Universidade de Saarland.
1 cultura de pilha preliminar e transfection do siRNA
Nota: no método descrito, os fibroblastos primários são usados. Estas pilhas desempenham um papel crucial na cicatrização de feridas e remodelação tecidual11. Neste experimento, o gene Cacnb3 , c...

<ol>
	<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li><li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing--aiming+for+perfect+skin+regeneration.">Wound healing--aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276, 75-81 (1997).</li><li>Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+actin+cytoskeleton+during+early+endothelial+regeneration+in+vitro.">Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro.</a> Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).</li><li>Belkacemi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP3+Receptor-Dependent+Cytoplasmic+Ca(2+)+Signals+Are+Tightly+Controlled+by+Cavbeta3.">IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3.</a> Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).</li><li>Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healing+of+partial+thickness+porcine+skin+wounds+in+a+liquid+environment.">Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment.</a> Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).</li><li>Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+wounds+in+the+MRL/MPJ+mouse+heal+with+scar.">Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar.</a> Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).</li><li>Vagesjo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+in+mice+by+on-site+production+and+delivery+of+CXCL12+by+transformed+lactic+acid+bacteria.">Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria.</a> Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).</li><li>Eming, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+closure+in+mice+deficient+for+interleukin-10.">Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10.</a> American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).</li><li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber.">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).</li><li>Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dorsal+skinfold+chamber:+window+into+the+dynamic+interaction+of+biomaterials+with+their+surrounding+host+tissue.">The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue.</a> European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).</li><li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration.">Cell migration.</a> Comprehensive Physiology. 2, 2369-2392 (2012).</li><li>Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Alternative+Functions+for+the+Auxiliary+Subunits+of+the+Voltage-Gated+Calcium+Channels.">Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels.</a> Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+4.1G+Regulates+Cell+Adhesion,+Spreading,+and+Migration+of+Mouse+Embryonic+Fibroblasts+through+the+beta1+Integrin+Pathway.">Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).</li><li>Dewor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+migration+inhibitory+factor+(MIF)+promotes+fibroblast+migration+in+scratch-wounded+monolayers+in+vitro.">Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro.</a> FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).</li><li>Handly, L. N., Wollman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound-induced+Ca(2+)+wave+propagates+through+a+simple+release+and+diffusion+mechanism.">Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism.</a> Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).</li><li>Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+In+Vitro+Wound+Healing+Assay+to+Evaluate+Cell+Migration.">A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), 56825 (2018).</li><li>Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular+and+Affordable+Time-Lapse+Imaging+and+Incubation+System+Based+on+3D-Printed+Parts,+a+Smartphone,+and+Off-The-Shelf+Electronics.">A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics.</a> PLoS One. 11, 0167583 (2016).</li><li>Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+adhesion+and+migration.">Endothelial cell adhesion and migration.</a> Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).</li><li>Treloar, K. K., Simpson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+of+edge+detection+methods+for+quantifying+cell+migration+assays.">Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays.</a> PLoS One. 8, 67389 (2013).</li><li>Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+starvation:+caveat+emptor.">Serum starvation: caveat emptor.</a> American Journal of Physiology-Cell Physioliology. 301, 272-279 (2011).</li><li>Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+access+chamber+for+the+rat+dorsal+skin+fold.">A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold.</a> Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).</li><li>Deoliveira, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ear+punch+model+for+studying+the+effect+of+radiation+on+wound+healing.">An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing.</a> International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).</li><li>Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+excisional+wound+model:+Contraction+revisited.">The murine excisional wound model: Contraction revisited.</a> Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).</li><li>Dunn, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+wound+healing.">Murine model of wound healing.</a> Journal of Visualized Experiment. (75), e50265 (2013).</li><li>Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juglone+ameliorates+skin+wound+healing+by+promoting+skin+cell+migration+through+Rac1/Cdc42/PAK+pathway.">Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway.</a> Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).</li></ol>

Neste manuscrito, descrevemos um ensaio in vitro e in vivo de cicatrização de feridas e correlacionamos os resultados obtidos. Para o ensaio invitro, utilizamosfibroblastos primários do camundongo4,14,15 que desempenham um papel importante na cicatrização de feridas e remodelação tecidual11. Outros tipos de células aderentes crescendo como monocamadas (por exemplo, células epiteliais, células en...

A cicatrização da ferida cutânea começa imediatamente após a lesão cutânea, a fim de restaurar a integridade da pele e proteger o organismo contra infecções. O processo de cicatrização de feridas atravessa quatro fases de sobreposição; coagulação, inflamação, nova formação tecidual e remodelação tecidual1. A migração celular é crucial durante essas fases. Células inflamatórias, células imunes, queratinócitos, células endoteliais e fibroblastos são ativados em diferentes pontos temporais e invadem a área da ferida2. Métodos para investigar a cicatrização de feridas in vitro e in vivo são de grande interesse não só para compreender os mecanismos subjacentes, mas também para testar novas drogas e desenvolver novas estratégias visando melhorar e acelerar a cicatrização da ferida cutânea.
Para monitorar e analisar a migração de células, o ensaio de migração de arranhões pode ser usado. É frequentemente referido como ensaio de cicatrização de feridas in vitro. Este método requer um recurso de cultura de célula3. É um procedimento simples, não há nenhuma necessidade de equipamento high-end e o ensaio pode ser executado em a maioria de laboratórios da biologia da pilha. Neste ensaio, uma área livre de células é criada pelo rompimento mecânico de uma monocamada de células confluentes, preferencialmente células epiteliais ou endoteliais ou fibroblastos. As células na borda do arranhão migrarão para preencher novamente a lacuna criada. A quantificação da área livre de células decrescentes ao longo do tempo assemelha-se à taxa de migração e indica o tempo, que as células precisam para fechar a lacuna. Para esta finalidade, os investigadores podem usar pilhas aguda isoladas dos ratos ou dos ratos do WT que faltam um gene do interesse4, ou pilhas imortalized disponíveis dos repositórios de pilha de confiança. O ensaio de risco permite estudar a influência de compostos farmacologicamente ativos ou o efeito de cDNAs transfected ou siRNAs na migração celular.
In vivo, cicatrização de feridas é um processo fisiológico complexo, exigindo diferentes tipos de células, incluindo queratinócitos, células inflamatórias, fibroblastos, células imunes e células endoteliais, a fim de restaurar a integridade física da pele o mais rápido possível1 . Diferentes métodos para estudar in vivo cicatrização de feridas foram desenvolvidos e utilizados nos últimos5,6,8. A câmara de dobras cutâneas dorsal descrita neste artigo foi utilizada anteriormente para ensaios de cicatrização de feridas9. É usado como uma preparação de câmara de dobra cutânea dorsal modificada para camundongos. O modelo de câmara de dobras cutâneas modificada tem várias vantagens. 1) minimiza a contração da pele, que impede observar o processo healing da ferida e pôde influenciar o reparo da ferida nos ratos. 2) esta câmara faz uso de cobrir a ferida com uma lamínula de vidro, reduzindo as infecções do tecido e dessecação, o que poderia atrasar o processo de cicatrização. 3) o fluxo sanguíneo e a vascularização podem ser monitorados diretamente. 4) permite a aplicação tópica repetitiva de compostos farmacologicamente ativos e reagentes, a fim de tratar a ferida e acelerar a cicatrização9,10.
Identificamos a subunidade β3 de canais de cálcio de alta voltagem (Cavβ3) como uma molécula alvo potencial para influenciar a cicatrização de feridas cutâneas utilizando dois protocolos independentes, ou seja, o ensaio in vitro de migração de arranhões e o modelo de câmara cutânea dorsal in vivo. Para o ensaio in vitro, utilizamos fibroblastos primários, estas células expressam o gene Cacnb3 que codifica a proteína cavβ3, mas a falta de CA2 + afluxo despolarization-induzida ou tensão-dependente CA2 + correntes. Nós descrevemos uma função nova de Cavβ3 nestes fibroblasto: o Cavβ3 liga-se ao inositol 1, 4, 5-receptor do trisphosphate (IP3R) e liberação do cálcio das limitações do reticulum endoplasmático. O apagamento do gene Cacnb3 nos ratos conduz ao aumento da sensibilidade do IP3R para IP3, migração aumentada da pilha e reparo aumentado da ferida da pele4.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9 % NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Kai Industries</td>
			<td>48201</td>
			<td>2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297)</td>
			<td>Origene</td>
			<td>SR415626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilation cream</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any depilation cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>3400935940179.00</td>
			<td>(BEPANTHEN)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine)</td>
			<td>Bayer Health Care</td>
			<td></td>
			<td>Rompun 2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagon full nut</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>KETASET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Keyence, Osaka, Japan</td>
			<td>BZ-8000</td>
			<td>Similar microscopes might be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse restrainer</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>plan apo 10x/0.45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene sutures</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwdriver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin disinfectant (octeniderm)</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH</td>
			<td>118212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted cheese head screw</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap ring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap ring plier</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope with camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica M651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium frames for the skinfold chamber</td>
			<td>IROLA</td>
			<td>160001</td>
			<td>Halteblech M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire piler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing

A cicatrização de feridas cutâneas prejudicada é uma grande preocupação para os pacientes que sofrem de diabetes e para pessoas idosas, e há a necessidade de um tratamento eficaz. Abordagens in vitro e in vivo apropriadas são essenciais para a identificação de novas moléculas-alvo para tratamentos medicamentoso para melhorar o processo de cicatrização da ferida cutânea. Nós identificamos o subunidade β3 de canaletas tensão-fechados do cálcio (cavβ3) como uma molécula potencial do alvo para influenciar a cura da ferida em dois ensaios independentes, isto é, o ensaio in vitro da migração do risco e o modelo in vivo da câmara de dobra cutânea dorsal. Os fibroblastos embrionários do rato preliminar (MEFs) isolados aguda do selvagem-tipo (WT) e os ratos 3-deficientes de CAVβ(CAVβ3 ko) ou os fibroblasto isolados aguda dos ratos do WT trataram com o siRNA para baixo-regulam a expressão do gene Cacnb3 , foi utilizada a codificação CAVβ3. Um risco foi aplicado em uma monocamada de pilha confluente e o fechamento da abertura foi seguido tomando imagens microscópicas em pontos definidos do tempo até o repovoamento completo da abertura pelas pilhas migrando. Essas imagens foram analisadas e a taxa de migração da célula foi determinada para cada condição. Em um ensaio in vivo, implantamos uma câmara de dobra cutânea dorsal nos camundongos WT e Cavβ3 KO, aplicou uma ferida circular definida de 2 mm de diâmetro, cobriu a ferida com uma lamínula de vidro para protegê-la de infecções e dessecações, e monitorou o fechamento da ferida macroscópica ao longo do tempo. O fechamento da ferida era significativamente mais rápido em Cacnb3-ratos gene-deficientes. Como os resultados dos ensaios in vivo e in vitro se correlacionam bem, o ensaio in vitro pode ser útil para a triagem de alta produtividade antes de validar os acertos in vitro pelo modelo in vivo de cicatrização de feridas. O que mostramos aqui para camundongos ou células com deficiência de tipo selvagem e CAVβ3 pode também ser aplicável para moléculas específicas que não sejam Cavβ3.

O teste do risco foi executado em um monocamada da pilha confluente do selvagem-tipo e β3-deficientes mefs (Figura 1c). Depois de executar o "Scratch" usando uma ponta de pipeta de 200 μL, as células de ambos os genótipos migram para a área de arranhão e fecham a lacuna. As imagens foram realizadas após 6, 10 e 30 h (Figura 1a). A migração celular foi quantificada como percentual (%) da área de rascunho repovoada migra...

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Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Aqui, nós apresentamos um protocolo para um ensaio in vitro do risco usando fibroblastos preliminares e para um ensaio in vivo da cicatrização da ferida da pele nos ratos. Ambos os ensaios são métodos diretos para avaliar in vitro e in vivo a cicatrização de feridas.

Ensaio de migração de riscos e câmara de dobras cutâneas dorsal para análise in vitro e in vivo da cicatrização de feridas

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

A necessidade insurgente de tratamento de feridas de pele. Para identificar suas moléculas-alvo para tratamentos medicamentosos, são necessários sistemas de teste in vitro e in vivo. Os sistemas apropriados são o ensaio de arranhão in vitro, e a câmara de dobra de pele in vivo dorsal.Ambos são procedimentos diretos para monitorar a migração celular e a cicatrização de feridas na pele, na ausência e presença de compostos farmacologicamente ativos. Embora ambas as técnicas sejam diretas, os investigadores devem praticar a aplicação do arranhão. E a implantação da câmara de dobra dorsal da pele, e ferida para obter resultados confiáveis e reprodutíveis.A demonstração dos procedimentos será feita pelo Dr. Matthias Laschke, cirurgião e professor do Instituto de Cirurgia Clínica e Experimental. Antes de iniciar o procedimento, use um marcador permanente ultra fino para marcar uma placa de seis poços por tipo de célula, com uma linha horizontal na parte inferior de cada poço para delinear a região de risco para cada cultura. As próximas explosões de fibra primária da placa isoladas do tipo selvagem e camundongos deficientes beta 3, em uma placa de seis poços a uma placa de 5 vezes 10 para a quinta explosão de fibra por concentração de poço.Em 2mL de DMEM suplementado com soro bovino 10%. Rotule as placas com o tipo de célula, genótipo e data. E coloque as placas na incubadora de cultura celular por 24 horas.Na manhã seguinte, adicione 9 micro litros de cada reagente de transfecção à base de lipídios de interesse, a tubos individuais de micro centrífugas contendo 150 micro litros de meio soro reduzido por tubo. Adicione 1,5 micro litros de siRNA a um segundo tubo de micro centrífugas por reagente de transfecção contendo 150 micro litros de meio soro reduzido por tubo. E misture cada solução siRNA com um único tubo de solução de reagente transfeccionado.Depois de brevemente vórtice coloque as misturas a 21 graus Celsius por 5 minutos. Durante a incubação substitua cuidadosamente o supernato em cada poço. Com 2,25mL de cultura fresca meio ao lado dos poços.No final da incubação adicione 250 micro litros da mistura apropriada de reagente de transfecção siRNA, solte em sábio em cada poço correspondente de células. E devolva as placas à incubadora de cultura celular por 72 horas. Quando as células atingirem 100% de confluência, descarte a cultura sobrenatária de cada poço.E use uma ponta de pipeta de 200 micro litros para criar um arranhão na monocamada de célula confluente. Vertical para a linha horizontal marcada na parte inferior de cada poço. Em seguida, enxágue cuidadosamente cada ferido bem 2 vezes com 2mL de PPS por lavagem.Para remover quaisquer fatores liberados das células danificadas, células soltas ou detritos da área arranhada. Após a segunda lavagem adicione 2mL de cultura celular fresca complementada com 1 ou 10% de soro para cada poço. E capturar imagens das feridas em cada placa no palco de um microscópio leve.Imediatamente após coçar em uma ampliação de 10X. Em seguida, devolva a placa para a incubadora de cultura celular. Continuando a capturar imagens nos pontos de tempo experimentais apropriados para as próximas 30 horas.Ao final do experimento quantificar a área livre de células iniciais e a área restante após 6, 10 e 30 horas de cultura. Para determinar a porcentagem da área de risco repovoada pelas células migratórias em relação à área inicial de risco. Depois de confirmar a falta de resposta ao toe pinch, no tipo selvagem ou beta três nocaute C57 preto seis mouse, cuidadosamente raspar o dorso.E aplique pomada aos olhos do animal. Aplique creme depilatório para eliminar qualquer cabelo restante. Removendo o creme após 10 minutos.Para preparar a câmara de titânio, fixar uma parte da estrutura da câmara de titânio simétrico, com os parafusos de conexão com porcas. Para manter de 400 a 500 micrômetros entre as duas partes simétricas da câmara. Para evitar a compressão das vesículas sanguíneas na pele.Desinfete a pele exposta com 70% de etanol. E segure uma dobra de pele na frente de uma fonte de luz. Posicione a linha média da camada dupla de pele para onde a câmara de titânio será implantada.E cranialmente e caudally fixar a dobra da pele com uma sutura de polipropileno. Aperte o outro lado da sutura em um rack de metal para levantar a pele dobrada. E ajuste a altura do rack para permitir que o mouse se sente confortavelmente.Suturar o primeiro quadro da câmara de titânio por suturas de polipropileno sobre a borda superior à parte de trás da dobra dorsal da pele. Após a reconfirmação da sedação use uma tesoura fina para fazer pequenas incisões na pele. E passe os dois parafusos de conexão ligados à primeira metade da câmara de titânio através da base da dobra da pele.Retire o mouse do rack e coloque o animal em posição lateral. Coloque a segunda metade de cortesia da câmara de titânio em cima dos 3 parafusos de conexão. E aplique manualmente uma leve pressão para passar esses parafusos através da segunda metade do quadro de titânio.A camada de pele dobrada está agora entre as duas metades simétricas da estrutura de titânio. Em seguida, fixar ambas as peças simétricas com porcas de aço inoxidável. Utilizando um soco de biópsia padronizado de 2mL de diâmetro, marque a área da ferida no centro da pele, dentro da janela de observação da câmara de dobra da pele.E use fórceps finos e tesouras para remover toda a epiderme e derme dentro da marca. Para criar uma ferida circular. Limpe a ferida quadrada de 3,5 a 4 milômetros com 0,5 mL de soro fisiológico estéril.E cubra a ferida com uma mancha de vidro. Use o plier de anel de encaixe na câmara de titânio para fixar a mancha no lugar. E transfira imediatamente o mouse para o estágio de imagem de um estereótipo.Em seguida, imagem a ferida em uma ampliação de 40X. Antes de colocar o mouse em uma gaiola com monitoramento até a recuperação completa. Depois de criar um arranhão usando uma ponta de pipeta de 200 micro litros como demonstrado, neste experimento representativo, células de ambos os genótipos migraram para a área de risco e fecharam a lacuna.A migração celular foi então quantificada como a porcentagem de área de risco repovoada por células migratórias 6 horas após a realização do arranhão. Por exemplo, neste experimento migrando cav beta 3 explosões de fibra deficiente fechou a área de risco significativamente mais cedo do que explosões de fibras de ratos do tipo selvagem. Para confirmar o efeito dependente cav beta 3 observado em cav beta 3 explosões de fibra deficiente, explosões de fibras do tipo selvagem foram transfectadas com siRNA para baixo regular a proteína Cav beta 3.Explosões de fibra tratadas com o Cav beta 3 siRNAs específicas se comportaram como explosões de fibra deficientes beta 3. Para comparar a cicatrização da ferida da pele entre ambos os genótipos, a área da ferida na câmara de dobra da pele foi fotografada logo após o ferimento. E a ferida foi imagens nas próximas duas semanas.Os tamanhos das feridas foram medidos nas imagens e a área da ferida, em um determinado dia foi expressa como, a porcentagem da área inicial da ferida. Como esperado, a taxa de fechamento de feridas foi aumentada em camundongos deficientes cav beta 3 em comparação com controles do tipo selvagem. Certifique-se de aplicar a mesma pressão na ponta da pipeta, para cada arranhão e combinar os arranhões com as linhas marcadas na parte inferior da placa o mais de perto possível.A janela de observação da câmara dorsal da dobra da pele pode ser aberta a qualquer momento durante o processo de cura. Permitindo a aplicação atual de diferentes compostos farmacologicamente ativos. Também é possível extir situar a área ferida em diferentes estágios do processo de cura.Para análise bioquímica ou histológica de proteína molecular.

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