Name: scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing
Uploaded: 2019-09-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing at JoVE.com

Мы благодарим д-ра Петру Вайсгербер и подразделение Transgene животного комплекса SPF (проект P2 SFB 894) медицинского факультета и животное в Институте клинической и экспериментальной хирургии на медицинском факультете Саарлендского университета в Хомбурге. Мы благодарим доктора Андреаса Бека за критическое чтение рукописи. Это исследование было профинансировано Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, проектом A3 для A.B. и V.F.).

Все экспериментальные процедуры были утверждены и проведены в соответствии с правилами этики и комитетами по защите животных Саарландского и Саарского университетов.
1 Первичная культура клеток и трансфекция siRNA
ПРИМЕЧАНИЕ: В описанном методе используютс...

<ol>
	<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li><li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing--aiming+for+perfect+skin+regeneration.">Wound healing--aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276, 75-81 (1997).</li><li>Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+actin+cytoskeleton+during+early+endothelial+regeneration+in+vitro.">Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro.</a> Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).</li><li>Belkacemi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP3+Receptor-Dependent+Cytoplasmic+Ca(2+)+Signals+Are+Tightly+Controlled+by+Cavbeta3.">IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3.</a> Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).</li><li>Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healing+of+partial+thickness+porcine+skin+wounds+in+a+liquid+environment.">Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment.</a> Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).</li><li>Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+wounds+in+the+MRL/MPJ+mouse+heal+with+scar.">Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar.</a> Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).</li><li>Vagesjo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+in+mice+by+on-site+production+and+delivery+of+CXCL12+by+transformed+lactic+acid+bacteria.">Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria.</a> Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).</li><li>Eming, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+closure+in+mice+deficient+for+interleukin-10.">Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10.</a> American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).</li><li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber.">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).</li><li>Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dorsal+skinfold+chamber:+window+into+the+dynamic+interaction+of+biomaterials+with+their+surrounding+host+tissue.">The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue.</a> European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).</li><li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration.">Cell migration.</a> Comprehensive Physiology. 2, 2369-2392 (2012).</li><li>Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Alternative+Functions+for+the+Auxiliary+Subunits+of+the+Voltage-Gated+Calcium+Channels.">Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels.</a> Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+4.1G+Regulates+Cell+Adhesion,+Spreading,+and+Migration+of+Mouse+Embryonic+Fibroblasts+through+the+beta1+Integrin+Pathway.">Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).</li><li>Dewor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+migration+inhibitory+factor+(MIF)+promotes+fibroblast+migration+in+scratch-wounded+monolayers+in+vitro.">Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro.</a> FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).</li><li>Handly, L. N., Wollman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound-induced+Ca(2+)+wave+propagates+through+a+simple+release+and+diffusion+mechanism.">Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism.</a> Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).</li><li>Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+In+Vitro+Wound+Healing+Assay+to+Evaluate+Cell+Migration.">A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), 56825 (2018).</li><li>Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular+and+Affordable+Time-Lapse+Imaging+and+Incubation+System+Based+on+3D-Printed+Parts,+a+Smartphone,+and+Off-The-Shelf+Electronics.">A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics.</a> PLoS One. 11, 0167583 (2016).</li><li>Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+adhesion+and+migration.">Endothelial cell adhesion and migration.</a> Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).</li><li>Treloar, K. K., Simpson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+of+edge+detection+methods+for+quantifying+cell+migration+assays.">Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays.</a> PLoS One. 8, 67389 (2013).</li><li>Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+starvation:+caveat+emptor.">Serum starvation: caveat emptor.</a> American Journal of Physiology-Cell Physioliology. 301, 272-279 (2011).</li><li>Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+access+chamber+for+the+rat+dorsal+skin+fold.">A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold.</a> Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).</li><li>Deoliveira, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ear+punch+model+for+studying+the+effect+of+radiation+on+wound+healing.">An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing.</a> International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).</li><li>Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+excisional+wound+model:+Contraction+revisited.">The murine excisional wound model: Contraction revisited.</a> Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).</li><li>Dunn, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+wound+healing.">Murine model of wound healing.</a> Journal of Visualized Experiment. (75), e50265 (2013).</li><li>Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juglone+ameliorates+skin+wound+healing+by+promoting+skin+cell+migration+through+Rac1/Cdc42/PAK+pathway.">Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway.</a> Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).</li></ol>

В этой рукописи мы описываем in vitro и in vivo анализ заживления ран и соотносим полученные результаты. Для анализа in vitro мы использовали первичныефибробласты мыши4,14,15, которые играют важную роль в заживлении ран и ремоделирования тканей...

Заживление ран ы кожи начинается сразу после повреждения кожи, чтобы восстановить целостность кожи и защитить организм от инфекций. Процесс заживления ран проходит через четыре перекрывающиеся фазы; коагуляция, воспаление, формирование новых тканей и ремоделированиетканей 1. Миграция ячеек имеет решающее значение на этих этапах. Воспалительные клетки, иммунные клетки, кератиноциты, эндотелиальные клетки и фибробласты активируются в разное время и вторгаются в рануобласти 2. Методы исследования заживления ран in vitro и in vivo представляют большой интерес не только для понимания основных механизмов, но и для тестирования новых препаратов и разработки новых стратегий, направленных на улучшение и ускорение заживления ран ы.
Для мониторинга и анализа миграции клеток можно использовать анализ миграции царапин. Это часто называют in vitro раны заживления анализа. Этот метод требует объекта культуры клеток3. Это простая процедура, нет необходимости в высококачественном оборудовании и анализ может быть выполнен в большинстве лабораторий клеточной биологии. В этом ассоциировании область, свободная от клеток, создается механическим нарушением монослойной клеток, предпочтительно эпителиальных или эндотелиальных клеток или фибробластов. Клетки на краю нуля будут мигрировать для того, чтобы заселить созданный пробел. Количественная оценка уменьшающейся области, свободной от клеток, со временем напоминает скорость миграции и указывает время, которое ячейки должны закрыть разрыв. Для этой цели, исследователи могут использовать либо остро изолированных клеток из WT мышей или мышей, не имеющих гена интереса4, или увековеченные клетки, доступные из надежных хранилищ клеток. Анализ царапин позволяет изучать влияние фармакологически активных соединений или влияние трансинфицированных cDNA или siRNAs на миграцию клеток.
In vivo, заживление ран является сложным физиологическим процессом, требующим различных типов клеток, включая кератиноциты, воспалительные клетки, фибробласты, иммунные клетки и эндотелиальные клетки для того, чтобы восстановить физическую целостность кожи как можно быстрее1 . Различные методы для изучения in vivo заживление ран были разработаны и используются в прошлом5,6,7,8. Дорсальная камера скожа, описанная в этой статье, ранее использовалась для анализов заживления ран9. Он используется в качестве модифицированного складной шкуры подготовки к коже для мышей. Модифицированная модель камеры для стежков имеет ряд преимуществ. 1) Это сводит к минимуму сокращение кожи, что предотвращает наблюдение за процессом заживления ран и может повлиять на восстановление рану у мышей. 2) Эта камера использует покрытие раны со стеклянным покрыванием, снижение инфекций тканей и высыхания, которые могут задержать процесс заживления. 3) Поток крови и васкуляризация могут непосредственно контролироваться. 4) Это позволяет повторяющиеся актуальные применения фармакологически активных соединений и реагентов для того, чтобы лечить рану и ускорить заживление9,10.
Мы определили субъединики высокого напряжения-gated кальциевых каналов (Cav'3) в качестве потенциальной целевой молекулы, чтобы влиять на заживление раны кожи с помощью двух независимых протоколов, т.е. в пробирке нуля миграции анализа и in vivo дорсальный кожной камеры модели. Для анализа in vitro, мы использовали первичные фибробласты, эти клетки выражают ген Cacnb3, кодирующий белок Cav'3, но не имеют деполяризации индуцированной Ca2 "приток или напряжение-зависимых Токов Ca2 ". Мы описали новую функцию Cav'3 в этих фибробластах: Каве3 связывается с инозитол1,4,5-трисфосфатный рецептор (IP3R) и ограничения кальция релиз из эндоплазмической ретикулума. Удаление гена Cacnb3 у мышей приводит к повышенной чувствительности IP3R для IP3, усиленной миграции клеток и увеличению ремонта раны кожи4.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9 % NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Kai Industries</td>
			<td>48201</td>
			<td>2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297)</td>
			<td>Origene</td>
			<td>SR415626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilation cream</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any depilation cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>3400935940179.00</td>
			<td>(BEPANTHEN)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine)</td>
			<td>Bayer Health Care</td>
			<td></td>
			<td>Rompun 2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagon full nut</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>KETASET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Keyence, Osaka, Japan</td>
			<td>BZ-8000</td>
			<td>Similar microscopes might be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse restrainer</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>plan apo 10x/0.45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene sutures</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwdriver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin disinfectant (octeniderm)</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH</td>
			<td>118212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted cheese head screw</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap ring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap ring plier</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope with camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica M651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium frames for the skinfold chamber</td>
			<td>IROLA</td>
			<td>160001</td>
			<td>Halteblech M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire piler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing

Нарушение кожного заживления ран является серьезной проблемой для пациентов, страдающих диабетом и для пожилых людей, и есть необходимость в эффективном лечении. Соответствующие подходы in vitro и in vivo необходимы для идентификации новых молекул-мишеней для лечения лекарственными препаратами для улучшения процесса заживления ран. Мы определили субъединицу кальциевых каналов с напряжением,загнанные в напряжение (Каве3) в качестве потенциальной целевой молекулы, способной влиять на заживление ран в двух независимых анализах, т.е. в анализе миграции в пробирке и модели камеры in vivo dorsal skinfold. Первичные мыши эмбриональных фибробластов (MEFs) остро изолированы от дикого типа (WT) и Cav3-дефицитныхмышей (CavNo3 KO) или фибробластов остро изолированы от WT мышей, обработанных siRNA для снижения регулирования экспрессии гена Cacnb3 , кодирование CavNo3, были использованы. Царапина была применена на монослой соединительных клеток, и за закрытием разрыва последовало получение микроскопических изображений в определенных временных точках до полного перераспределения разрыва мигрирующими клетками. Эти изображения были проанализированы, и скорость миграции клеток была определена для каждого состояния. В in vivo анализ, мы имплантировали царской кожи камеры на WT и Cav'3 KO мышей, применяется определенная круговая рана 2 мм диаметром, покрыл рану стеклянным крышкой, чтобы защитить его от инфекций и высыхания, и мониторинг макроскопической замыкания раны с течением времени. Закрытие ран было значительно быстрее у мышей Cacnb3-генно-дефицитных. Потому что результаты in vivo и in vitro assays коррелируют хорошо, анализ in vitro может быть полезен для скрининга высокой пропускной способностью перед проверкой in vitro хитов по модели заживления ран In vivo. То, что мы показали здесьдля диких типа и Cav 3-дефицитных мышей или клеток также может быть применимо к конкретным молекулам, кроме Cav'3.

Царапина была проведена на слияние клеток монослой дикого типа и No 3-дефицитных MEFs(Рисунок 1c). После выполнения "царапины" с помощью наконечника пипетки 200 л, клетки из обоих генотипов мигрируют в область нуля и закрывают зазор. Изображения были сделаны после 6, 10 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing at JoVE.com

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Здесь мы представляем протокол для анализа в пробирке нуля с использованием первичных фибробластов и для in vivo кожи раны заживления анализа у мышей. Оба анализа являются простыми методами для оценки in vitro и in vivo заживления ран.

Царапина Миграция Анализ и Dorsal Skinfold камеры для in Vitro и In Vivo Анализ раны исцеления

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

Повстанцы нуждаются в лечении кожных ран. Для определения ваших целевых молекул для лечения наркотиков, в пробирке и in vivo тестовых систем не требуется. Соответствующие системы в пробирке нуля анализ, и in vivo спинной кожи сложить камеру.Оба являются прямыми процедурами для мониторинга миграции клеток и заживления ран кожи, при отсутствии и наличии фармакологически активных соединений. Хотя оба метода прямо вперед, следователи должны практиковать применение нуля. И спинной кожи сложить камерной имплантации, и раны для получения надежных и воспроизводимых результатов.Демонстрацию процедур будет делать д-р Маттиас Лашке, хирург и профессор из Института клинической и экспериментальной хирургии. Перед началом процедуры используйте сверхтонкий перманентный маркер, чтобы отметить один шесть хорошо пластины на тип ячейки, с горизонтальной линии в нижней части каждой скважины, чтобы разграничить область нуля для каждой культуры. Следующая пластина первичного волокна взрывов изолированы от дикого типа и бета 3 дефицитных мышей, в шесть пластины хорошо в 5 раз от 10 до пятого волокна взрывов на концентрацию хорошо.В 2 мл ДМЭМ дополняется 10%фетальной сывороткой крупного рогатого скота. Наклеить таблички с типом ячейки, генотипом и датой. И поместите тарелки в инкубатор клеточной культуры на 24 часа.На следующее утро добавить 9 микролитров каждого липидного реагента трансфекции на основе интереса, к отдельным микро центрифуг трубки, содержащие 150 микролитров уменьшенной среды сыворотки на трубку. Добавьте 1,5 микролитров сирны во вторую микро центрифугу на трансфектный реагент, содержащий 150 микролитров пониженной среды сыворотки на трубку. И смешать каждый раствор siRNA с одной трубкой трансфекции реагентного раствора.После краткого вихря место смеси на 21 градусов по Цельсию в течение 5 минут. Во время инкубации тщательно замените супернят в каждой колодец. С 2.25mL свежей культуры среды вниз стороне скважин.В конце инкубации добавить 250 микролитров соответствующей смеси трансфекции siRNA, падение мудрым в каждом соответствующем хорошо клеток. И верните пластины в инкубатор клеточной культуры на 72 часа. Когда клетки достигли 100% слияния, отбросить культуру supernatant из каждой хорошо.И использовать 200 микролитровый наконечник пипетки для создания царапин в монослойной ячейки. Вертикаль к отмеченной горизонтальной линии в нижней части каждой скважины. Затем тщательно промыть каждый раненый хорошо 2 раза с 2mL PPS за стирку.Чтобы удалить любые освобожденные факторы из поврежденных клеток, свободных клеток или мусора из поцарапаемой области. После второй стирки добавить 2 мл свежей клеточной культуры среды дополняется 1 или 10 процентов сыворотки для каждого хорошо. И захватить изображения ран в каждой пластине на сцене светового микроскопа.Сразу после царапин при 10X увеличении. Затем верните пластину в инкубатор клеточной культуры. Продолжение захвата изображений в соответствующих экспериментальных точках времени в течение следующих 30 часов.В конце эксперимента количественная оценка начальной свободной от клеток области и оставшейся площади после 6, 10 и 30 часов культуры. Определить процент от площади царапин, заселенной мигрирующими ячейками по отношению к первоначальной области царапины. После подтверждения отсутствия реакции на щепотку ноша, в диком типе или бета три нокаута C57 черный шесть мышей, тщательно брить спину.И нанесите мазь на глаза животного. Нанесите крем для депиля applyatory для того чтобы исключить все остальные волосы. Удаление крема через 10 минут.Чтобы подготовить титановую камеру, зафиксните одну часть симметричной титановой камерной рамы, со соединительными винтами с гайками. Для поддержания от 400 до 500 микрометров между двумя симметричными частями камеры. Чтобы избежать сжатия пузырьков крови в коже.Дезинфицировать обитуемую кожу 70%этанолом. И схватить складку кожи перед источником света. Распоитите среднюю линию двойного слоя кожи туда, где будет имплантирована титановая камера.И черепно и caudally исправить складку кожи с полипропиленовым швом. Затяните другую сторону шва на металлическую стойку, чтобы поднять сложенную кожу. И отрегулируйте высоту стойки, чтобы мышь сидеть удобно.Шов первый каркас титановой камеры полипропиленовыми швами на нем превосходит край спинной кожи. После подтверждения сеяния используйте тонкие ножницы, чтобы сделать небольшие разрезы в коже. И пройти два соединительных винта прилагается к первой половине титановой камеры через основание кожи раза.Снимите мышь со стойки и поместите животное в боковое положение. Поместите вторую бесплатную половину титановой камеры поверх 3 соединительных винтов. И вручную применить небольшое давление, чтобы пройти эти винты через вторую половину титановой рамы.Сложенный слой кожи теперь зажат между двумя симметричными половинками титановой рамы. Затем исправить обе симметричные части с орехами из нержавеющей стали. Используя стандартизированный пунш биопсии диаметром 2 мЛ, отметь область раны в центре кожи, в окне наблюдения камеры складки кожи.И использовать тонкие миппы и ножницы, чтобы удалить весь эпидермис и дерма в знак. Создать круглую рану. Очистите рану в квадрате от 3,5 до 4 с половиной милометров с 0,5 мл стерильного солевого раствора.И накройте рану стеклянной крышкой. Используйте плоскогубец кольца оснастки на титановой камере, чтобы исправить крышку на месте. И немедленно перенесите мышь на стадию визуализации стереомикроскопа.Затем изображение раны при увеличении 40X. Перед тем, как поместить мышь в клетку с мониторингом до полного выздоровления. После создания царапины с помощью 200 микролитровый наконечник пипетки, как попродемонстрировано, в этом репрезентативном эксперименте, клетки из обоих генотипов мигрировали в область царапин и закрыли зазор.Миграция клеток была затем количественно, как процент нуля области заселены мигрирующих клеток 6 часов после выполнения нуля. Например, в этом эксперименте миграция Cav бета 3 недостаточного волокна взрывов закрыты области нуля значительно раньше, чем волокна взрывов от диких мышей типа. Чтобы подтвердить Cav бета 3 зависимый эффект наблюдается в Cav бета 3 недостаточного волокна взрывов, дикого типа волокна взрывов были трансфицированы с siRNA вниз регулировать Cav бета 3 белка.Волокно взрывов, обработанных Cav бета 3 конкретных siRNAs вели себя как бета 3 недостаточное волокно взрывов. Для сравнения заживления раны кожи между обоими генотипами, область раны в камере складки кожи была сфотографирована сразу после ранения. И рана была изображена в течение следующих 2 недель.Размеры ран измерялись на снимках и в области раны, в тот или иной день была выражена процентная доля первоначальной области раны. Как и ожидалось, скорость закрытия раны была увеличена в Cav бета 3 дефицитных мышей по сравнению с дикими контроля типа. Не забудьте применить равное давление на кончик пипетки, для каждой царапины и сопоставить царапины с отмеченными линиями на дне пластины как можно ближе.Окно наблюдения спинной камеры складки кожи может быть открыто в любое время во время процесса заживления. Позволяет актуальное применение различных фармакологически активных соединений. Также можно подакцизиз иметь подакцизную часть на разных стадиях процесса заживления.Для молекулярно-белкового биохимического или гистологического анализа.

Research

JoVE Journal

Medicine

Murine Model of Wound Healing

Мышиной модели заживления ран

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Мышиный Эндоскопия для<em&gt; В Vivo</em&gt; Мультимодальные изображений канцерогенеза и оценки кишечной заживления ран и воспаления

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Ischemic Tissue Injury in the Dorsal Skinfold Chamber of the Mouse: A Skin Flap Model to Investigate Acute Persistent Ischemia

Ишемическая тканей Травмы в спинной кожной складки палаты Mouse: кожный лоскут модель для изучения Острая стойких ишемии

Despite profound expertise and advanced surgical techniques, ischemia-induced complications ranging from wound breakdown to extensive tissue necrosis are ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Сонной артерии Настои для Фармакокинетические и фармакодинамические анализ Таксаны в мышах

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Истощение мышиных клеток из ксенотрансплантатов опухолей человека значительно улучшает Downstream Анализ клеток-мишеней

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

Развитие прямого Pulp-укупорки модель для оценки пульпозного ранозаживляющим и Репаративная дентина Формирование у мышей

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Оптимизированный анализ<em&gt; В Vivo</em&gt; и<em&gt; In Vitro</em&gt; Стеатоз печени

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

Микроскопия на основе методов для оценки миграции эпителиальных клеток во время в Vitro заживление ран

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Роговицы эпителиальных истиранию с глазной заусенцев, как модель для роговицы заживление ран

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...