Name: scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing
Uploaded: 2019-09-26T13:00:00
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Agradecemos a la Dra. Petra Weissgerber y a la Unidad Transgénica de la instalación animal SPF (proyecto P2 de la SFB 894) de la Facultad de Medicina y a la instalación animal del Instituto de Cirugía Clínica y Experimental de la Facultad de Medicina de la Universidad del Sarre, Homburg. Agradecemos al Dr. Andreas Beck por la lectura crítica del manuscrito. Este estudio fue financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, proyecto A3 a A.B. y V.F.).

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados y realizados de acuerdo con las regulaciones éticas y los comités de bienestar animal de La Universidad del Sarre y el Sarre.
1 Cultivo celular primario y transfección de siRNA
NOTA: En el método descrito, se utilizan fibroblastos primarios. Estas células juegan un papel crucial en la cicatrización de heridas y la remodelación detejidos 11. En este experimento, el gen Cacnb3,</...

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	<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li><li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing--aiming+for+perfect+skin+regeneration.">Wound healing--aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276, 75-81 (1997).</li><li>Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+actin+cytoskeleton+during+early+endothelial+regeneration+in+vitro.">Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro.</a> Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).</li><li>Belkacemi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP3+Receptor-Dependent+Cytoplasmic+Ca(2+)+Signals+Are+Tightly+Controlled+by+Cavbeta3.">IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3.</a> Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).</li><li>Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healing+of+partial+thickness+porcine+skin+wounds+in+a+liquid+environment.">Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment.</a> Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).</li><li>Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+wounds+in+the+MRL/MPJ+mouse+heal+with+scar.">Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar.</a> Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).</li><li>Vagesjo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+in+mice+by+on-site+production+and+delivery+of+CXCL12+by+transformed+lactic+acid+bacteria.">Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria.</a> Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).</li><li>Eming, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+closure+in+mice+deficient+for+interleukin-10.">Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10.</a> American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).</li><li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber.">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).</li><li>Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dorsal+skinfold+chamber:+window+into+the+dynamic+interaction+of+biomaterials+with+their+surrounding+host+tissue.">The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue.</a> European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).</li><li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration.">Cell migration.</a> Comprehensive Physiology. 2, 2369-2392 (2012).</li><li>Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Alternative+Functions+for+the+Auxiliary+Subunits+of+the+Voltage-Gated+Calcium+Channels.">Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels.</a> Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+4.1G+Regulates+Cell+Adhesion,+Spreading,+and+Migration+of+Mouse+Embryonic+Fibroblasts+through+the+beta1+Integrin+Pathway.">Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).</li><li>Dewor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+migration+inhibitory+factor+(MIF)+promotes+fibroblast+migration+in+scratch-wounded+monolayers+in+vitro.">Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro.</a> FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).</li><li>Handly, L. N., Wollman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound-induced+Ca(2+)+wave+propagates+through+a+simple+release+and+diffusion+mechanism.">Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism.</a> Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).</li><li>Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+In+Vitro+Wound+Healing+Assay+to+Evaluate+Cell+Migration.">A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), 56825 (2018).</li><li>Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular+and+Affordable+Time-Lapse+Imaging+and+Incubation+System+Based+on+3D-Printed+Parts,+a+Smartphone,+and+Off-The-Shelf+Electronics.">A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics.</a> PLoS One. 11, 0167583 (2016).</li><li>Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+adhesion+and+migration.">Endothelial cell adhesion and migration.</a> Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).</li><li>Treloar, K. K., Simpson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+of+edge+detection+methods+for+quantifying+cell+migration+assays.">Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays.</a> PLoS One. 8, 67389 (2013).</li><li>Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+starvation:+caveat+emptor.">Serum starvation: caveat emptor.</a> American Journal of Physiology-Cell Physioliology. 301, 272-279 (2011).</li><li>Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+access+chamber+for+the+rat+dorsal+skin+fold.">A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold.</a> Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).</li><li>Deoliveira, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ear+punch+model+for+studying+the+effect+of+radiation+on+wound+healing.">An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing.</a> International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).</li><li>Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+excisional+wound+model:+Contraction+revisited.">The murine excisional wound model: Contraction revisited.</a> Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).</li><li>Dunn, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+wound+healing.">Murine model of wound healing.</a> Journal of Visualized Experiment. (75), e50265 (2013).</li><li>Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juglone+ameliorates+skin+wound+healing+by+promoting+skin+cell+migration+through+Rac1/Cdc42/PAK+pathway.">Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway.</a> Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).</li></ol>

En este manuscrito, describimos un ensayo de cicatrización de heridas in vitro e in vivo y correlacionamos los resultados obtenidos. Para el ensayo in vitro, utilizamos fibroblastos primarios de ratón4,14,15 que juegan un papel importante en la cicatrización de heridas y la remodelación detejidos 11. También se pueden utilizar otros tipos de células adherentes que crecen como monocapas (por ejemplo,...

La cicatrización de heridas en la piel comienza inmediatamente después de la lesión de la piel con el fin de restaurar la integridad de la piel y proteger al organismo de las infecciones. El proceso de cicatrización de heridas pasa por cuatro fases superpuestas; coagulación, inflamación, formación de tejido nuevo y remodelación tisular1. La migración celular es crucial durante estas fases. Las células inflamatorias, las células inmunitarias, los queratinocitos, las células endoteliales y los fibroblastos se activan en diferentes momentos e invaden el área de la herida2. Los métodos para investigar la cicatrización de heridas in vitro e in vivo son de gran interés no sólo para entender los mecanismos subyacentes, sino también para probar nuevos fármacos y desarrollar nuevas estrategias con el objetivo de mejorar y acelerar la cicatrización de heridas en la piel.
Para supervisar y analizar la migración de celdas, se puede utilizar el ensayo de migración de cero. A menudo se conoce como ensayo de cicatrización de heridas in vitro. Este método requiere una instalación de cultivo celular3. Es un procedimiento simple, no hay necesidad de equipos de alta gama y el ensayo se puede realizar en la mayoría de los laboratorios de biología celular. En este ensayo, una zona libre de células es creada por la interrupción mecánica de una monocapa celular confluente, preferiblemente células epiteliales o endoteliales o fibroblastos. Las celdas en el borde del rasguño se migrarán para volver a rellenar la brecha creada. La cuantificación del área libre de celdas decreciente con el tiempo se asemeja a la tasa de migración e indica el tiempo, que las celdas necesitan para cerrar la brecha. Para este propósito, los investigadores pueden utilizar células agudamente aisladas de ratones WT o ratones que carecen de un gen de interés4,o células inmortalizadas disponibles en repositorios celulares confiables. El ensayo de arañazos permite estudiar la influencia de los compuestos farmacológicamente activos o el efecto de los CDNA transinfectados o siRNAs en la migración celular.
In vivo, la cicatrización de heridas es un proceso fisiológico complejo, que requiere diferentes tipos de células, incluyendo queratinocitos, células inflamatorias, fibroblastos, células inmunitarias y células endoteliales con el fin de restaurar la integridad física de la piel lo más rápido posible1 . Diferentes métodos para estudiar la cicatrización de heridas in vivo se han desarrollado y utilizado en los últimos5,6,7,8. La cámara dorsal de pliegue de la piel descrita en este artículo se utilizó anteriormente para los ensayos de cicatrización de heridas9. Se utiliza como una preparación de la cámara dorsal de la piel modificada para ratones. El modelo de cámara skinfold modificado tiene varias ventajas. 1) Minimiza la contracción de la piel, lo que evita observar el proceso de cicatrización de heridas y podría influir en la reparación de heridas en ratones. 2) Esta cámara hace uso de cubrir la herida con un cubreobjetos de vidrio, reducir las infecciones de tejido y la desecación, que podría retrasar el proceso de curación. 3) El flujo sanguíneo y la vascularización se pueden controlar directamente. 4) Permite la aplicación tópica repetitiva de compuestos y reactivos farmacológicamente activos con el fin de tratar la herida y acelerar la curación9,10.
Identificamos la subunidad 3 de canales de calcio cerrados de alta tensión (Cav-3) como una molécula objetivo potencial para influir en la cicatrización de heridas de la piel utilizando dos protocolos independientes, es decir, el ensayo de migración de arañazos in vitro y el modelo de cámara de plegado de piel dorsal in vivo. Para el ensayo in vitro, utilizamos fibroblastos primarios, estas células expresan el gen Cacnb3 que codifica la proteína Cav-3, pero carecen de influjo Ca2+ inducido por despolarización o corrientes Ca2+ dependientes del voltaje. Hemos descrito una función novedosa de Cav-3 en estos fibroblastos: Cav-3 se une al receptor de inositol 1,4,5-trisfosfato (IP3R) y restricciones liberación de calcio del retículo endoplasmático. La eliminación del gen Cacnb3 en ratones conduce a una mayor sensibilidad del IP3R para IP3, una mayor migración celular y una mayor reparación de heridas cutáneas4.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9 % NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Kai Industries</td>
			<td>48201</td>
			<td>2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297)</td>
			<td>Origene</td>
			<td>SR415626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilation cream</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any depilation cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>3400935940179.00</td>
			<td>(BEPANTHEN)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine)</td>
			<td>Bayer Health Care</td>
			<td></td>
			<td>Rompun 2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagon full nut</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>KETASET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Keyence, Osaka, Japan</td>
			<td>BZ-8000</td>
			<td>Similar microscopes might be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse restrainer</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>plan apo 10x/0.45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene sutures</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwdriver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin disinfectant (octeniderm)</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH</td>
			<td>118212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted cheese head screw</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap ring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap ring plier</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope with camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica M651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium frames for the skinfold chamber</td>
			<td>IROLA</td>
			<td>160001</td>
			<td>Halteblech M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire piler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing

La cicatrización de heridas cutáneas deterioradas es una preocupación importante para los pacientes que sufren de diabetes y para las personas mayores, y es necesario un tratamiento eficaz. Los enfoques in vitro e in vivo adecuados son esenciales para la identificación de nuevas moléculas diana para tratamientos farmacológicos para mejorar el proceso de cicatrización de heridas en la piel. Identificamos la subunidad 3 de canales de calcio cerrados por voltaje (Cav-3) como una molécula objetivo potencial para influir en la cicatrización de heridas en dos ensayos independientes, es decir, el ensayo de migración de arañazos in vitro y el modelo de cámara de plegado de piel dorsal in vivo. Fibroblastos embrionarios de ratón primario (MEF) agudamente aislados de ratones de tipo salvaje (WT) y de cav3-deficienciat(Cav3KO) o fibroblastos agudamente aislados de ratones WT tratados con siRNA para regular la reducción de la expresión del gen Cacnb3 , se utilizaron la codificación Cav3. Se aplicó un rasguño en una monocapa de células confluentes y el cierre de brecha fue seguido por la toma de imágenes microscópicas en puntos de tiempo definidos hasta la repoblación completa de la brecha por las células migratorias. Estas imágenes se analizaron y se determinó la tasa de migración de celdas para cada condición. En un ensayo in vivo, implantamos una cámara dorsal en ratones WT y Cav-3 KO, aplicamos una herida circular definida de 2 mm de diámetro, cubrimos la herida con un cubrecristalo para protegerla de infecciones y desecación, y monitoreamos el cierre de la herida macroscópica con el tiempo. El cierre de heridas fue significativamente más rápido en cacnb3-ratones con deficiencia de genes. Debido a que los resultados de los ensayos in vivo y in vitro se correlacionan bien, el ensayo in vitro puede ser útil para el cribado de alto rendimiento antes de validar los golpes in vitro por el modelo de cicatrización de heridas in vivo. Lo que hemos mostrado aquí para ratones o células de tipo salvaje y de deficiencia deCav3 también podría ser aplicable para moléculas específicas distintas de Cav-3.

El ensayo de arañazos se realizó en una monocapa de células confluentes de MEF de tipo salvaje y deficientes en 3(Figura 1c). Después de realizar el "rasguño" usando una punta de pipeta de 200 l, las células de ambos genotipos migran a la zona de arañazos y cierran la brecha. Las imágenes se tomaron después de 6, 10 y 30 h(Figura 1a). La migración celular se cuantificó como porcentaje (%) área de arañazos repoblada ...

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Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo de arañazos in vitro utilizando fibroblastos primarios y para un ensayo de cicatrización de heridas de piel in vivo en ratones. Ambos ensayos son métodos sencillos para evaluar la cicatrización in vitro e in vivo de heridas.

Ensayo de migración de arañazos y cámara dorsal Skinfold para análisis In Vitro e In Vivo de sanación de heridas

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

La necesidad insurgente de tratamiento de heridas cutáneas. Para identificar las moléculas diana para tratamientos farmacológicos, se requieren sistemas de prueba in vitro e in vivo. Los sistemas apropiados son el ensayo de arañazo in vitro, y la cámara de plegado de la piel dorsal in vivo.Ambos son procedimientos directos para monitorear la migración celular y la cicatrización de heridas en la piel, en ausencia y presencia de compuestos farmacológicamente activos. Aunque ambas técnicas son directas, los investigadores deben practicar la aplicación de arañazos. Y la piel dorsal doblar la cámara de implante, y heridas para obtener resultados confiables y reproducibles.La demostración de los procedimientos será realizada por el Dr. Matthias Laschke, cirujano y profesor del Instituto de Cirugía Clínica y Experimental. Antes de comenzar el procedimiento, utilice un marcador permanente ultra fino para marcar una placa de seis pozos por tipo de celda, con una línea horizontal en la parte inferior de cada pozo para delinear la región de arañazos para cada cultivo. Al lado de la placa de fibra primaria explosiones aisladas de tipo salvaje y beta 3 ratones deficientes, en una placa de seis pozos a una 5 veces 10 a la quinta explosión de fibra por concentración de pozo.En 2 ml de DMEM complementado con 10%suero bovino fetal. Etiquete las placas con el tipo de celda, el genotipo y la fecha. Y coloque las placas en la incubadora de cultivo celular durante 24 horas.A la mañana siguiente añadir 9 micro litros de cada reactivo de transfección a base de lípidos de interés, a tubos de micro centrífuga individuales que contienen 150 micro litros de medio sérico reducido por tubo. Añadir 1,5 micro litros de SIRNA a un segundo tubo de micro centrífuga por reactivo de transfección que contenga 150 micro litros de medio sérico reducido por tubo. Y mezcle cada solución de siRNA con un solo tubo de solución de reactivo de transfección.Después de vórtices brevemente colocar las mezclas a 21 grados Celsius durante 5 minutos. Durante la incubación reemplace cuidadosamente el supernate en cada pocó. Con 2,25 ml de medio de cultivo fresco por el lado de los pozos.Al final de la incubación añadir 250 micro litros de la mezcla de reactivo de transfección de siRNA adecuada, dejar caer sabiamente en cada pocóp medio correspondiente de las células. Y devuelva las placas a la incubadora de cultivo celular durante 72 horas. Cuando las células hayan alcanzado el 100% de confluencia, deseche el sobrenadante de cultivo de cada pozo.Y utilice una punta de pipeta de 200 micro litros para crear arañazos en la monocapa de células confluentes. Vertical a la línea horizontal marcada en la parte inferior de cada pozo. A continuación, enjuague cuidadosamente cada herido bien 2 veces con 2 ml de PPS por lavado.Para eliminar cualquier factor liberado de las células dañadas, células sueltas o desechos de la zona rayada. Después del segundo lavado añadir 2 ml de medio de cultivo celular fresco complementado con 1 o 10 por ciento de suero a cada pozo. Y capturar imágenes de las heridas en cada placa en el escenario de un microscopio de luz.Inmediatamente después de rascarse con un aumento de 10X. A continuación, devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular. Continuar capturando imágenes en los puntos de tiempo experimentales adecuados durante las próximas 30 horas.Al final del experimento cuantificar el área libre de células iniciales y el área restante después de 6, 10 y 30 horas de cultivo. Determinar el porcentaje del área de rayado rellenada por las celdas migratorias en relación con el área de rayado inicial. Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del final, en el tipo salvaje o beta tres knockout C57 negro seis ratón, afeitar cuidadosamente el dorso.Y aplica un ung en los ojos del animal. Aplica crema depilatoria para eliminar cualquier cabello restante. Retirar la crema después de 10 minutos.Para preparar la cámara de titanio, fije una parte del marco de la cámara de titanio simétrico, con los tornillos de conexión con tuercas. Mantener de 400 a 500 micrómetros entre las dos partes simétricas de la cámara. Para evitar la compresión de las vesículas sanguíneas en la piel.Desinfectar la piel expuesta con 70% de etanol. Y agarra un pliegue de piel delante de una fuente de luz. Coloque la línea media de la doble capa de piel donde se implantará la cámara de titanio.Y la piel fija y lonja caudalmente con una sutura de polipropileno. Apriete el otro lado de la sutura en un estante metálico para levantar la piel doblada. Y ajuste la altura del bastidor para permitir que el ratón se siente cómodamente.Suturar el primer marco de la cámara de titanio por suturas de polipropileno en el borde superior a la parte posterior del pliegue de la piel dorsal. Después de reconfirmar la sedación use tijeras finas para hacer pequeñas incisiones en la piel. Y pase los dos tornillos de conexión unidos a la primera mitad de la cámara de titanio a través de la base del pliegue de la piel.Retire el ratón del bastidor y colóquelo en una posición lateral. Coloque la segunda mitad de cortesía de la cámara de titanio encima de los 3 tornillos de conexión. Y aplicar manualmente una ligera presión para pasar estos tornillos a través de la segunda mitad del marco de titanio.La capa de piel plegada ahora se intercala entre las dos mitades simétricas del marco de titanio. A continuación, fije ambas piezas simétricas con tuercas de acero inoxidable. Usando un punzón de biopsia estandarizado de 2 ml de diámetro, marque el área de la herida en el centro de la piel, dentro de la ventana de observación de la cámara de plegado de la piel.Y usa fórceps finos y tijeras para eliminar toda la epidermis y la dermis dentro de la marca. Para crear una herida circular. Limpie la herida cuadrada de 3 y medio a 4 milómetros y medio con 0,5 ml de solución salina esterilizada.Y cubre la herida con un cubreobjetos de vidrio. Utilice el alicate de anillo de presión en la cámara de titanio para fijar el cubreobjetos en su lugar. Y transfiera inmediatamente el ratón a la etapa de imagen de un estereomicroscopio.A continuación, imagine la herida con un aumento de 40X. Antes de colocar el ratón en una jaula con monitoreo hasta la recuperación completa. Después de crear un rasguño usando una punta de pipeta de 200 micro litros como se demostró, en este experimento representativo, las células de ambos genotipos migraron al área de arañazos y cerraron la brecha.A continuación, se cuantificó la migración de celdas como el porcentaje de área de rayado rellenada por la migración de celdas 6 horas después de realizar el scratch. Por ejemplo, en este experimento de migración de cav beta 3 explosiones de fibra deficientes cerró el área de arañazos significativamente antes que las explosiones de fibra de ratones de tipo salvaje. Para confirmar el efecto dependiente de Cav beta 3 observado en las explosiones de fibra deficientes de Cav beta 3, las explosiones de fibra de tipo salvaje se trans infectaron con siRNA para regular la proteína Cav beta 3.Las explosiones de fibra tratadas con los siRNAS específicos de Cav beta 3 se comportaron como explosiones de fibra deficientes beta 3. Para comparar la cicatrización de heridas cutáneas entre ambos genotipos, el área de la herida en la cámara de plegado de la piel fue fotografiada directamente después de la herida. Y la herida fue se imán en las siguientes 2 semanas.Los tamaños de las heridas se midieron en las imágenes y el área de la herida, en un día determinado se expresó como, el porcentaje de la zona inicial de la herida. Como era de esperar, la tasa de cierre de la herida se incrementó en ratones con deficiencia de Cav beta 3 en comparación con los controles de tipo salvaje. Asegúrese de aplicar la misma presión a la punta de la pipeta, para cada rasguño y para que coincida con los arañazos con las líneas marcadas en la parte inferior de la placa lo más cerca posible.La ventana de observación de la cámara de plegado de la piel dorsal se puede abrir en cualquier momento durante el proceso de curación. Permite la aplicación tópica de diferentes compuestos farmacológicamente activos. También es posible extirpar el área de los heridos en diferentes etapas del proceso de curación.Para análisis bioquímicos o histológicos de proteínas moleculares.

Research

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