Name: scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing
Uploaded: 2019-09-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing at JoVE.com

Vi tackar Dr Petra Weissgerber och Transgene enheten av SPF djuranläggningen (Project P2 av SFB 894) av den medicinska fakulteten och djuret anläggningen vid Institutet för klinisk och experimentell kirurgi vid den medicinska fakulteten vid Saarland University, Homburg. Vi tackar Dr. Andreas Beck för kritisk läsning av manuskriptet. Denna studie finansierades av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, projekt a3 till A.B. och V.F.).

Alla experimentella procedurer godkändes och utfördes i enlighet med etik förordningarna och djurskydds kommittéerna vid Saarlands och Saarlands universitet.
1 primär cellkultur och siRNA-transfektion
Anmärkning: i den beskrivna metoden används primära fibroblaster. Dessa celler spelar en avgörande roll i sårläkning och vävnad remodeling11. I detta experiment, den Cacnb3 genen, kodning av cavβ3 subenhet av högspännings-g...

<ol>
	<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li><li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing--aiming+for+perfect+skin+regeneration.">Wound healing--aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276, 75-81 (1997).</li><li>Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+actin+cytoskeleton+during+early+endothelial+regeneration+in+vitro.">Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro.</a> Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).</li><li>Belkacemi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP3+Receptor-Dependent+Cytoplasmic+Ca(2+)+Signals+Are+Tightly+Controlled+by+Cavbeta3.">IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3.</a> Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).</li><li>Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healing+of+partial+thickness+porcine+skin+wounds+in+a+liquid+environment.">Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment.</a> Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).</li><li>Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+wounds+in+the+MRL/MPJ+mouse+heal+with+scar.">Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar.</a> Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).</li><li>Vagesjo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+in+mice+by+on-site+production+and+delivery+of+CXCL12+by+transformed+lactic+acid+bacteria.">Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria.</a> Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).</li><li>Eming, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+closure+in+mice+deficient+for+interleukin-10.">Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10.</a> American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).</li><li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber.">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).</li><li>Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dorsal+skinfold+chamber:+window+into+the+dynamic+interaction+of+biomaterials+with+their+surrounding+host+tissue.">The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue.</a> European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).</li><li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration.">Cell migration.</a> Comprehensive Physiology. 2, 2369-2392 (2012).</li><li>Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Alternative+Functions+for+the+Auxiliary+Subunits+of+the+Voltage-Gated+Calcium+Channels.">Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels.</a> Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+4.1G+Regulates+Cell+Adhesion,+Spreading,+and+Migration+of+Mouse+Embryonic+Fibroblasts+through+the+beta1+Integrin+Pathway.">Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).</li><li>Dewor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+migration+inhibitory+factor+(MIF)+promotes+fibroblast+migration+in+scratch-wounded+monolayers+in+vitro.">Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro.</a> FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).</li><li>Handly, L. N., Wollman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound-induced+Ca(2+)+wave+propagates+through+a+simple+release+and+diffusion+mechanism.">Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism.</a> Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).</li><li>Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+In+Vitro+Wound+Healing+Assay+to+Evaluate+Cell+Migration.">A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), 56825 (2018).</li><li>Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular+and+Affordable+Time-Lapse+Imaging+and+Incubation+System+Based+on+3D-Printed+Parts,+a+Smartphone,+and+Off-The-Shelf+Electronics.">A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics.</a> PLoS One. 11, 0167583 (2016).</li><li>Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+adhesion+and+migration.">Endothelial cell adhesion and migration.</a> Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).</li><li>Treloar, K. K., Simpson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+of+edge+detection+methods+for+quantifying+cell+migration+assays.">Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays.</a> PLoS One. 8, 67389 (2013).</li><li>Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+starvation:+caveat+emptor.">Serum starvation: caveat emptor.</a> American Journal of Physiology-Cell Physioliology. 301, 272-279 (2011).</li><li>Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+access+chamber+for+the+rat+dorsal+skin+fold.">A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold.</a> Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).</li><li>Deoliveira, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ear+punch+model+for+studying+the+effect+of+radiation+on+wound+healing.">An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing.</a> International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).</li><li>Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+excisional+wound+model:+Contraction+revisited.">The murine excisional wound model: Contraction revisited.</a> Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).</li><li>Dunn, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+wound+healing.">Murine model of wound healing.</a> Journal of Visualized Experiment. (75), e50265 (2013).</li><li>Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juglone+ameliorates+skin+wound+healing+by+promoting+skin+cell+migration+through+Rac1/Cdc42/PAK+pathway.">Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway.</a> Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).</li></ol>

I detta manuskript beskriver vi en in vitro-och in vivo sårläknings analys och korrelerar de erhållna resultaten. För in vitro-analysen använde vi primära mus fibroblaster4,14,15 som spelar en viktig roll i sårläkning och vävnad remodeling11. Andra anhängare celltyper växer som enskiktslager (t. ex., epitelceller, endotelceller, keratinocyter) kan användas också. Plätering samma antal livskr...

Hud sårläkning börjar omedelbart efter hud skadan för att återställa hudens integritet och för att skydda organismen från infektioner. Sårläkningsprocessen går igenom fyra överlappande faser; koagulation, inflammation, ny vävnadsbildning, och vävnad remodeling1. Cell migration är avgörande under dessa faser. Inflammatoriska celler, immunceller, keratinocyter, endotelceller, och fibroblaster aktiveras vid olika tidpunkter och invadera såret område2. Metoder för att undersöka sårläkning in vitro och in vivo är av stort intresse inte bara för att förstå de bakomliggande mekanismerna utan också för att testa nya läkemedel och utveckla nya strategier som syftar till att lindra och påskynda hudens sårläkning.
För att övervaka och analysera cellmigrering kan Scratch migration-analysen användas. Det benämns ofta som in vitro sårläkning assay. Denna metod kräver en cellkultur anläggning3. Det är ett enkelt förfarande, det finns inget behov av hög-end utrustning och analysen kan utföras i de flesta cellbiologi laboratorier. I denna analys, ett cellfritt område skapas genom den mekaniska störningar i en konfluenta cell monolayer, företrädesvis epitelial-eller endothelial-liknande celler eller fibroblaster. Celler på kanten av Scratch kommer att migrera för att återbefolka den skapade klyftan. Kvantifiering av det minskande cell fria området över tiden liknar migreringshastigheten och anger den tid som cellerna behöver för att stänga gapet. För detta ändamål kan utredarna använda antingen akut isolerade celler från WT möss eller möss som saknar en gen av intresse4, eller förevigade celler tillgängliga från pålitliga cell förråd. Scratch-analysen gör det möjligt att studera påverkan av farmakologiskt aktiva föreningar eller effekten av transfekterade cdnas eller sirnas på cell migration.
In vivo, sårläkning är en komplex fysiologisk process, som kräver olika celltyper inklusive keratinocyter, inflammatoriska celler, fibroblaster, immunceller och endotelceller för att återställa hudens fysiska integritet så snabbt som möjligt1 . Olika metoder för att studera in vivo sårläkning har utvecklats och använts under de senaste5,6,7,8. Den dorsala skinfold kammare som beskrivs i denna artikel har tidigare använts för sårläkning analyser9. Det används som en modifierad dorsala skinfold kammare förberedelse för möss. Den modifierade skinfold kammar modellen har flera fördelar. 1) det minimerar hudens kontraktion, vilket förhindrar observation av sårläkningsprocessen och kan påverka sårreparation hos möss. 2) denna kammare använder sig av att täcka såret med en glastäckslip, minska vävnads infektioner och uttorkning, vilket kan fördröja läkningsprocessen. 3) blodflöde och vaskularisering kan övervakas direkt. 4) det möjliggör repetitiv topikal applicering av farmakologiskt aktiva föreningar och reagenser för att behandla såret och påskynda läkning9,10.
Vi identifierade β3 subenhet av högspännings-gated kalciumkanaler (cavβ3) som en potentiell målmolekyl för att påverka huden sårläkning med hjälp av två oberoende protokoll, dvs in vitro Scratch migration assay och in vivo dorsala skinfold kammar modell. För in vitro-analysen, vi använde primära fibroblaster, dessa celler uttrycker Cacnb3 gen kodning av Cavβ3-proteinet men saknar depolarisering-inducerad ca2 + tillströmning eller spänningsberoende ca2 + strömmar. Vi beskrev en roman funktion av Cavβ3 i dessa fibroblaster: Cavβ3 binder till inositol 1, 4,5-trisphosphate receptor (IP3R) och begränsningar kalcium frisättning från endoplasmatiska Retikulum. Borttagande av Cacnb3 genen hos möss leder till ökad känslighet i IP3R för IP3, förbättrad cell migration och ökad hud sår reparation4.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9 % NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Kai Industries</td>
			<td>48201</td>
			<td>2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297)</td>
			<td>Origene</td>
			<td>SR415626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilation cream</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any depilation cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>3400935940179.00</td>
			<td>(BEPANTHEN)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine)</td>
			<td>Bayer Health Care</td>
			<td></td>
			<td>Rompun 2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagon full nut</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>KETASET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Keyence, Osaka, Japan</td>
			<td>BZ-8000</td>
			<td>Similar microscopes might be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse restrainer</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>plan apo 10x/0.45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene sutures</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwdriver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin disinfectant (octeniderm)</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH</td>
			<td>118212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted cheese head screw</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap ring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap ring plier</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope with camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica M651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium frames for the skinfold chamber</td>
			<td>IROLA</td>
			<td>160001</td>
			<td>Halteblech M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire piler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing

Försämrad kutan sårläkning är ett stort bekymmer för patienter som lider av diabetes och för äldre människor, och det finns ett behov av en effektiv behandling. Lämpliga in vitro-och in vivo-metoder är viktiga för att identifiera nya målmolekyler för läkemedelsbehandlingar för att förbättra hudens sårläkningsprocess. Vi identifierade β3 subenhet av spännings-gated kalciumkanaler (cavβ3) som en potentiell målmolekyl för att påverka sårläkning i två oberoende analyser, dvs in vitro Scratch migration assay och in vivo dorsala skinfold kammar modell. Primär mus embryonala fibroblaster (MEFs) akut isolerade från Wild-Type (WT) och CAVβ3-bristfällig möss (CAVβ3 Ko) eller FIBROBLASTER akut isolerade från WT möss som behandlats med siRNA att besegra-reglera uttrycket av Cacnb3 genen , kodning av CAVβ3, användes. En repa applicerades på en enskiktslager i konfluenta-cellen och gapet stängdes av med mikroskopiska bilder vid definierade tidpunkter tills fullständig återinsättning av gapet av de migrerande cellerna. Dessa avbildningar analyserades och cell flyttnings hastigheten bestämdes för varje villkor. I en in vivo-analys, implanterade vi en dorsala skinfold kammare på WT och Cavβ3 KO möss, tillämpat ett definierat cirkulär sår på 2 mm diameter, täckte såret med ett glas täckglasburk för att skydda den mot infektioner och uttorkning, och övervakade makroskopiskt sår stängning med tiden. Såret stängning var betydligt snabbare i Cacnb3-gen-brist möss. Eftersom resultaten av in vivo-och in vitro-analyserna korrelerar väl, kan in vitro-analysen vara användbar för den högpresterande screeningen innan validerar in vitro-träffar av in vivo-sårläknings modellen. Vad vi har visat här för Wild-Type och CAVβ3-brist möss eller celler kan också vara tillämpliga för specifika molekyler än Cavβ3.

Scratch-analysen utfördes på en enskiktslager av vildtyp och β3-bristfällig MEFS (figur 1c). Efter att ha utfört "Scratch" med en 200 μL pipett spets, celler från båda genotyper migrera in i repområdet och stänga gapet. Bilderna togs efter 6, 10 och 30 h (figur 1a). Cell migration kvantifierades som procentandel (%) av Scratch område återbefolkade genom att migrera celler 6 timmar efter att ha utfört scratch. Migrer...

Watch this Scientific Journal Video about Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing at JoVE.com

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Här presenterar vi ett protokoll för en in vitro-Scratch analys med hjälp av primära fibroblaster och för en in vivo hud sårläkning analys i möss. Båda analyserna är enkla metoder för att bedöma in vitro-och in vivo sårläkning.

Scratch migration assay och dorsal skinfold kammare för in vitro-och in vivo-analys av sårläkning

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

Det upproriska behovet av behandling av hudsår. För att identifiera dina målmolekyler för läkemedelsbehandlingar krävs in vitro- och in vivo-testsystem. Lämpliga system är in vitro-repastavsägelsen, och in vivo dorsala hudvecket kammare.Båda är rakt fram förfaranden för övervakning av cell migration och hud sårläkning, i avsaknad och närvaro av farmakologiskt aktiva föreningar. Även om båda teknikerna är rakt fram, bör utredarna öva scratch ansökan. Och den dorsala hudvecket kammare implantation, och såra för att få tillförlitliga och reproducerbara resultat.Demonstration av de förfaranden som kommer att göras av Dr.Matthias Laschke, en kirurg och professor från institutet för klinisk och experimentell kirurgi. Innan du börjar med proceduren, använd en ultrafin permanent markör för att markera en sex brunnsplatta per celltyp, med en horisontell linje längst ner på varje brunn för att avgränsa scratch-regionen för varje kultur. Nästa platta primära fiber blaster isolerade från vilda typ och beta 3 bristfälliga möss, i en sex brunnsplatta vid en 5 gånger 10 till den femte fiber blaster per brunn koncentration.I 2mL av DMEM kompletteras med 10%fetala nötkreatur serum. Märk plattorna med celltyp, genotyp och datum. Och placera plattorna i cellkulturinkubatorn i 24 timmar.Nästa morgon lägga 9 mikro liter av varje lipid baserad transfection reagens av intresse, till enskilda mikro centrifugrör som innehåller 150 mikro liter reducerat serum medium per rör. Tillsätt 1,5 mikro liter siRNA till ett andra mikro centrifugrör per transfektionsreagens som innehåller 150 mikro liter reducerat serummedium per rör. Och blanda varje siRNA-lösning med ett enda rör av transfektionsreagenslösning.Efter kort vortexing placera blandningarna på 21 grader Celsius i 5 minuter. Under inkubationen byt försiktigt ut supernaten i varje brunn. Med 2.25mL av färskt odlingsmedium ner sidan av brunnarna.I slutet av inkubationen tillsätt 250 mikro liter av lämplig siRNA transfection reagensblandning, släpp klokt i varje motsvarande brunn av celler. Och återlämna plattorna till cellkulturinkubatorn i 72 timmar. När cellerna har nått 100%konfluency, kassera kulturen supernatant från varje brunn.Och använd en 200 mikro liters pipett spets för att skapa repa i den konfluenta cellen monolayer. Lodrätt mot den markerade horisontella linjen längst ned på varje brunn. Skölj sedan noggrant varje sårad väl 2 gånger med 2mL PPS per tvätt.För att ta bort eventuella frisläppta faktorer från de skadade cellerna, lösa celler eller skräp från det repade området. Efter den andra tvätten tillsätt 2mL av färska cellkultur medium kompletteras med 1 eller 10 procent serum till varje brunn. Och ta bilder av såren i varje platta på scenen av ett ljusmikroskop.Omedelbart efter repor i en 10X förstoring. Sedan tillbaka plattan till cellkulturen inkubatorn. Fortsätter att ta bilder vid lämpliga experimentella tidpunkter för de närmaste 30 timmarna.I slutet av experimentet kvantifiera den ursprungliga cellen fritt område och återstående område efter 6, 10 och 30 timmars kultur. Att bestämma hur stor procentandel av repområdet som återbefolkats av migrerande celler i förhållande till det ursprungliga repområdet. Efter att ha bekräftat en brist på svar på tå nypa, i den vilda typen eller beta tre knockout C57 svart sex mus, noggrant raka dorsum.Och applicera salva på djurets ögon. Applicera depilatory grädde för att eliminera eventuella kvarvarande hår. Ta bort krämen efter 10 minuter.För att förbereda titankammaren, fixera en del av den symmetriska titankammarramen, med anslutningsskruvarna med muttrar. Att bibehålla 400 till 500 mikrometer mellan de två symmetriska delarna av kammaren. För att undvika kompression av blodblåsorna i huden.Desinficera den exponerade huden med 70%etanol. Och ta tag i ett hudveck framför en ljuskälla. Placera mittlinjen av det dubbla lagret av huden till där titankammaren kommer att implanteras.Och kraniellt och caudally fixa hudvecket med en polypropylen sutur. Dra åt suturens andra sida på ett metallställ för att lyfta den vikta huden. Och justera höjden på racket så att musen kan sitta bekvämt.Suturera den första ramen i titankammaren genom polypropylen suturer på den överlägsen kant till baksidan av rygghudsvecket. Efter återkonfirming sedering använda fin sax för att göra små snitt i huden. Och passera de två anslutningsskruvarna som är fästa vid den första halvan av titankammaren genom basen av hudvecket.Ta bort musen från racket, och placera djuret i ett lateralt läge. Placera den andra gratis hälften av titankammaren ovanpå de 3 anslutande skruvarna. Och manuellt tillämpa lätt tryck för att passera dessa skruvar genom den andra halvan av titanramen.Det vikta hudlagret är nu inklämt mellan de två symmetriska halvorna av titanramen. Fixera sedan båda symmetriska delar med rostfria muttrar. Med hjälp av en standardiserad 2mL diameter biopsi punch, markera sårområdet i mitten av huden, inom observation fönstret i huden luckan kammaren.Och använd fina typpor och sax för att ta bort hela epidermis och dermis inom märket. För att skapa ett cirkelsår. Rengör 3 och en halv till 4 och en halv milometer kvadrat såret med 0.5mL steril koksaltlösning.Och täck såret med ett glasöverdrag. Använd snäppringsplier på titankammaren för att fixera täcket på plats. Och omedelbart överföra musen till bildbehandlingsstadiet av ett stereomikroskop.Bild sedan såret vid en 40X förstoring. Innan du placerar musen i en bur med övervakning tills full återhämtning. Efter att ha skapat en repa med hjälp av en 200 mikro liters pipett spets som visats, i detta representativa experiment, celler från båda genotyper migrerade in i scratch området och stängt gapet.Cellmigrationen kvantifierades sedan som andelen scratch area rebevandrade genom att migrera celler 6 timmar efter att ha utfört repa. Till exempel i detta experiment migrera Cav beta 3 bristfällig fiber blaster stängt scratch området betydligt tidigare än fiber blaster från vilda typ möss. För att bekräfta Cav beta 3 beroende effekt som observerats i Cav beta 3 bristfällig fiber blaster, vild typ fiber blaster var transfected med siRNA att ner reglera Cav beta 3 proteinet.Fiber blaster behandlas med Cav beta 3 specifika siRNAs uppförde sig som beta 3 bristfällig fiber blaster. För att jämföra huden sårläkning mellan båda genotyper, var sårområdet i huden luckan kammaren fotograferas direkt efter sår. Och såret avbildades under de kommande 2 veckorna.Storlekarna på såren mättes på bilderna och sårområdet, på en viss dag uttrycktes som, andelen av det ursprungliga sårområdet. Som väntat hastigheten på sår stängningen ökade i Cav beta 3 bristfälliga möss jämfört med vilda typ kontroller. Var noga med att applicera lika tryck på pipettspetsen, för varje repa och att matcha reporna mot de markerade linjerna på plattans botten så nära som möjligt.Observationen fönster i dorsala hudvecket kammaren kan öppnas när som helst under läkningsprocessen. Möjliggör topikal tillämpning av olika farmakologiskt aktiva föreningar. Det är också möjligt att punktskatt det sårade området i olika stadier av läkningsprocessen.För molekylär protein biokemisk eller histologisk analys.

Research

JoVE Journal

Medicine

Murine Model of Wound Healing

Murinmodell sårläkning

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murin Endoskopi för<em&gt; In Vivo</em&gt; Multimodal avbildning av Carcinogenesis och Bedömning av intestinala sårläkning och inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Ischemic Tissue Injury in the Dorsal Skinfold Chamber of the Mouse: A Skin Flap Model to Investigate Acute Persistent Ischemia

Ischemisk Tissue Skada i Dorsal skinfold avdelning Mus: En Skin Flap modell för att undersöka Akut Ihållande Ischemi

Despite profound expertise and advanced surgical techniques, ischemia-induced complications ranging from wound breakdown to extensive tissue necrosis are ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Halspulsådern Tinkturer för farmakokinetiska och farmakodynamiska Analys av taxaner i möss

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Utarmning av musceller från humana tumörxenotransplantat avsevärt förbättrar Nedströms analys av målceller

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

Utveckling av en direkt Pulp-tak modell för utvärdering av pulpa sårläkning och Reparativ Dentin bildning hos möss

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Optimerad Analys av<em&gt; In Vivo</em&gt; och<em&gt; In Vitro</em&gt; Leversteatos

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

Mikroskopi datorbaserade metoder för bedömning av epitelial cellmigration under In Vitro sårläkning

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Hornhinnans epitel nötning med okulär Burr som modell för hornhinnan sårläkning

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...