Name: scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing
Uploaded: 2019-09-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing at JoVE.com

Dr. Petra Weissgerber'e ve Tıp Fakültesi'nin SPF hayvan tesisinin Transgen Birimi'ne (SFB 894'ün P2 projesi) ve Homburg'daki Saarland Üniversitesi Tıp Fakültesi Klinik ve Deneysel Cerrahi Enstitüsü'ndeki hayvan tesisine teşekkür ederiz. Dr. Andreas Beck'e el yazmasının eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, Proje A3 a.B. ve V.F. tarafından finanse edilmiştir.

Tüm deneysel prosedürler etik düzenlemelere ve Saarland ve Saarland Üniversitesi hayvan refahı komitelerine uygun olarak onaylandı ve gerçekleştirildi.
1 Birincil hücre kültürü ve siRNA transfeksiyonu
NOT: Açıklanan yöntemde primer fibroblastlar kullanılır. Bu hücreler yara iyileşmesi ve doku remodeling önemli bir rol oynamaktadır11. Bu deneyde, yüksek gerilim kapılı kalsiyum kanalları12 Cavβ3 a...

<ol>
	<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li><li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing--aiming+for+perfect+skin+regeneration.">Wound healing--aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276, 75-81 (1997).</li><li>Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+actin+cytoskeleton+during+early+endothelial+regeneration+in+vitro.">Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro.</a> Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).</li><li>Belkacemi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP3+Receptor-Dependent+Cytoplasmic+Ca(2+)+Signals+Are+Tightly+Controlled+by+Cavbeta3.">IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3.</a> Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).</li><li>Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healing+of+partial+thickness+porcine+skin+wounds+in+a+liquid+environment.">Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment.</a> Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).</li><li>Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+wounds+in+the+MRL/MPJ+mouse+heal+with+scar.">Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar.</a> Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).</li><li>Vagesjo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+in+mice+by+on-site+production+and+delivery+of+CXCL12+by+transformed+lactic+acid+bacteria.">Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria.</a> Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).</li><li>Eming, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+closure+in+mice+deficient+for+interleukin-10.">Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10.</a> American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).</li><li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber.">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).</li><li>Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dorsal+skinfold+chamber:+window+into+the+dynamic+interaction+of+biomaterials+with+their+surrounding+host+tissue.">The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue.</a> European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).</li><li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration.">Cell migration.</a> Comprehensive Physiology. 2, 2369-2392 (2012).</li><li>Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Alternative+Functions+for+the+Auxiliary+Subunits+of+the+Voltage-Gated+Calcium+Channels.">Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels.</a> Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+4.1G+Regulates+Cell+Adhesion,+Spreading,+and+Migration+of+Mouse+Embryonic+Fibroblasts+through+the+beta1+Integrin+Pathway.">Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).</li><li>Dewor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+migration+inhibitory+factor+(MIF)+promotes+fibroblast+migration+in+scratch-wounded+monolayers+in+vitro.">Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro.</a> FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).</li><li>Handly, L. N., Wollman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound-induced+Ca(2+)+wave+propagates+through+a+simple+release+and+diffusion+mechanism.">Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism.</a> Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).</li><li>Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+In+Vitro+Wound+Healing+Assay+to+Evaluate+Cell+Migration.">A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), 56825 (2018).</li><li>Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular+and+Affordable+Time-Lapse+Imaging+and+Incubation+System+Based+on+3D-Printed+Parts,+a+Smartphone,+and+Off-The-Shelf+Electronics.">A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics.</a> PLoS One. 11, 0167583 (2016).</li><li>Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+adhesion+and+migration.">Endothelial cell adhesion and migration.</a> Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).</li><li>Treloar, K. K., Simpson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+of+edge+detection+methods+for+quantifying+cell+migration+assays.">Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays.</a> PLoS One. 8, 67389 (2013).</li><li>Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+starvation:+caveat+emptor.">Serum starvation: caveat emptor.</a> American Journal of Physiology-Cell Physioliology. 301, 272-279 (2011).</li><li>Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+access+chamber+for+the+rat+dorsal+skin+fold.">A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold.</a> Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).</li><li>Deoliveira, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ear+punch+model+for+studying+the+effect+of+radiation+on+wound+healing.">An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing.</a> International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).</li><li>Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+excisional+wound+model:+Contraction+revisited.">The murine excisional wound model: Contraction revisited.</a> Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).</li><li>Dunn, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+wound+healing.">Murine model of wound healing.</a> Journal of Visualized Experiment. (75), e50265 (2013).</li><li>Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juglone+ameliorates+skin+wound+healing+by+promoting+skin+cell+migration+through+Rac1/Cdc42/PAK+pathway.">Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway.</a> Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).</li></ol>

Bu yazıda in vitro ve in vivo yara iyileşmesi tahsinini açıklar ve elde edilen sonuçları ilişkilendiriz. In vitro tsay için, biz yara iyileşmesi ve doku remodeling önemli bir rol oynayan birincil fare fibroblastlar4,14,15 kullanılır11. Monolayers olarak büyüyen diğer yapışık hücre tipleri (örn. epitel hücreleri, endotel hücreleri, keratinositler) de kullanılabilir. Uygun ve sağlık...

Cildin bütünlüğünü geri getirmek ve organizmayı enfeksiyonlardan korumak için cilt yaralanmasından hemen sonra cilt yaraiyileşmesi başlar. Yara iyileşme süreci dört örtüşen aşamadan geçer; koagülasyon, inflamasyon, yeni doku oluşumu ve doku remodeling1. Hücre göçü bu evrelerde çok önemlidir. İnflamatuar hücreler, bağışıklık hücreleri, keratinositler, endotel hücreleri ve fibroblastlar farklı zaman noktalarında aktive edilir ve yara bölgesini istila eder2. İn vitro ve in vivo yara iyileşmesini araştırma yöntemleri sadece altta yatan mekanizmaları anlamak için değil, aynı zamanda yeni ilaçları test etmek ve cilt yara iyileşmesini iyileştirmeyi ve hızlandırmayı amaçlayan yeni stratejiler geliştirmek için de büyük ilgi görmektedir.
Hücre geçişini izlemek ve analiz etmek için, sıfırdan geçiş titremi kullanılabilir. Genellikle in vitro yara iyileşmesi tsay olarak adlandırılır. Bu yöntem bir hücre kültür tesisi3gerektirir. Bu basit bir işlemdir, high-end ekipman gerek yoktur ve test çoğu hücre biyolojisi laboratuvarlarında yapılabilir. Bu teşpte, hücresiz bir alan, tercihen epitel veya endotel benzeri hücreler veya fibroblastlar, konfluent hücre monolayer mekanik bozulma tarafından oluşturulur. Çiziğin kenarındaki hücreler, oluşturulan boşluğu yeniden doldurmak için göç eder. Zaman içinde azalan hücresiz alanın niceliği geçiş hızına benzer ve hücrelerin boşluğu kapatmak için ihtiyaç duydukları zamanı gösterir. Bu amaçla, araştırmacılar ya WT fareler veya fareler ilgi4bir gen yoksun akut izole hücreleri kullanabilirsiniz , ya da güvenilir hücre depolarından kullanılabilir ölümsüzleştirilmiş hücreler. Çizik tsay farmakolojik olarak aktif bileşiklerin etkisi veya hücre göçü üzerinde transfected cDNA veya siRNA etkisi incelenmesi sağlar.
In vivo, yara iyileşmesi keratinositler, inflamatuar hücreler, fibroblastlar, bağışıklık hücreleri ve endotel hücreleri de dahil olmak üzere farklı hücre tipleri gerektiren karmaşık bir fizyolojik süreçtir mümkün olduğunca hızlı cildin fiziksel bütünlüğünü geri yüklemek için1 . In vivo yara iyileşmesi nde farklı yöntemler geliştirilmiş ve son5,6,7,8. Bu makalede açıklanan dorsal deri odası daha önce yara iyileşmesi tahlilleri için kullanılmıştır9. Bu fareler için modifiye dorsal skinfold oda hazırlığı olarak kullanılır. Modifiye skinfold oda modeli çeşitli avantajları vardır. 1) Yaranın iyileşme sürecini engelleyen ve farelerde yara onarımını etkileyebilecek cilt daralmasını en aza indirir. 2) Bu oda, yaranın cam bir kapak fişi ile kaplanması, doku enfeksiyonlarının azaltılması ve kurutunma, iyileşme sürecini geciktirebilir kullanır. 3) Kan akışı ve vaskülarizasyon doğrudan izlenebilir. 4) Bu yara tedavi etmek ve iyileşme yi hızlandırmak için farmakolojik olarak aktif bileşikler ve reaktifler tekrarlayan topikal uygulama sağlar9,10.
Yüksek gerilim kapılı kalsiyum kanallarının (Cavβ3) β3 alt ünitesini, iki bağımsız protokol, yani in vitro çizik göçü tetkik ve in vivo dorsal skinfold oda modeli ile cilt yara iyileşmesini etkileyebilecek potansiyel bir hedef molekül olarak tanımladık. İn vitro tetkik için, birincil fibroblastlar kullandık, bu hücreler Cavβ3 proteinini kodlayan Cacnb3 genini ifade eder, ancak depolarizasyona bağlı Ca2+ akını veya voltaj bağımlı Ca2+ akımları yoktur. Bu fibroblastlarda Cavβ3'ün yeni bir işlevini tanımladık: Cavβ3 inositol 1,4,5-trisfosfat reseptörüne (IP3R) bağlanır ve endoplazmik retikulumdan kalsiyum salınımını kısıtlar. Farelerde Cacnb3 geninin silinmesi IP3R IP3R artan duyarlılık yol açar, gelişmiş hücre göçü ve artan deri yara onarımı 4.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9 % NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Kai Industries</td>
			<td>48201</td>
			<td>2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297)</td>
			<td>Origene</td>
			<td>SR415626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilation cream</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any depilation cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>3400935940179.00</td>
			<td>(BEPANTHEN)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine)</td>
			<td>Bayer Health Care</td>
			<td></td>
			<td>Rompun 2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagon full nut</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>KETASET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Keyence, Osaka, Japan</td>
			<td>BZ-8000</td>
			<td>Similar microscopes might be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse restrainer</td>
			<td>Home-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>plan apo 10x/0.45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene sutures</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwdriver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin disinfectant (octeniderm)</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH</td>
			<td>118212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted cheese head screw</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap ring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap ring plier</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope with camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica M651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium frames for the skinfold chamber</td>
			<td>IROLA</td>
			<td>160001</td>
			<td>Halteblech M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire piler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing

Bozulmuş kutanöz yara iyileşmesi diyabet hastaları ve yaşlılar için önemli bir endişe kaynağıdır ve etkili bir tedaviye ihtiyaç vardır. Uygun in vitro ve in vivo yaklaşımlar cilt yara iyileşme sürecini iyileştirmek için ilaç tedavileri için yeni hedef moleküllerin belirlenmesi için gereklidir. Voltaj kapılı kalsiyum kanallarının β3 alt birimini (Cavβ3) iki bağımsız tahlilde yara iyileşmesini etkileyebilecek potansiyel bir hedef molekül olarak belirledik, yani in vitro çizik göçü tahlilleri ve in vivo dorsal skinfold oda modeli. Birincil fare embriyonik fibroblastlar (MEFs) akut yabani tip (WT) ve Cavβ3-eksik fareler (Cavβ3 KO) veya fibroblastlar akut WT fareler siRNA ile tedavi izole aşağı-Cacnb3 genin ekspresyonunu düzenlemek için izole , Cavβ3 kodlama, kullanılmıştır. Bir çizik bir confluent hücre monolayer üzerine uygulandı ve boşluk kapatma göç eden hücreler tarafından boşluğun tam yeniden popülasyonkadar tanımlanan zaman noktalarında mikroskobik görüntüler alarak izledi. Bu görüntüler analiz edildi ve her durum için hücre geçiş hızı belirlendi. İn vivo bir testte, WT ve Cavβ3 KO farelere bir sırt derisi kalıbı yerleştirdik, 2 mm çapında tanımlanmış dairesel bir yara uyguladık, yarayı enfeksiyonlardan ve kurutunmaya karşı korumak için cam bir kapak kaymasıyla kapladık ve makroskopik yara nın kapanmasını izledik. zaman içinde. Cacnb3-gen eksikliği olan farelerde yara kapanması önemli ölçüde daha hızlıydı. In vivo ve in vitro tahlilsonuçları iyi korelasyon nedeniyle, in vitro tahlil in vivo yara iyileşme modeli ile in vitro isabet doğrulamadan önce yüksek iş itme taraması için yararlı olabilir. Burada yabani tip ve Cavβ3-eksik fareler veya hücreler için gösterdikleri Cavβ3 dışındaki belirli moleküller için de uygulanabilir.

Çizik telbette, yabani tip ve β3-eksik MEF'lerin(Şekil 1c)etkili bir hücre monotabakasıüzerinde yapıldı. 200 μL'lik pipet ucu kullanılarak "çizik" yaptıktan sonra, her iki genotipten hücreler çizilme alanına göç eder ve boşluğu kapatır. Görüntüler 6, 10 ve 30 saat sonraalınmıştır(Şekil 1a ). Hücre geçişi yüzde (%) olarak ölçüldü çizik yaptıktan 6 saat sonra göç eden hücreler tarafından y...

Watch this Scientific Journal Video about Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing at JoVE.com

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Burada, primer fibroblastlar kullanarak in vitro çizik testve farelerde in vivo deri yara iyileşmesi test için bir protokol salıyoruz. Her iki tahliller in vitro ve in vivo yara iyileşmesini değerlendirmek için basit yöntemlerdir.

In Vitro ve In Vivo In Vivo Analizi Yara İyileşmesi için Scratch Migration Tahlil ve Dorsal Skinfold Odası

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

Asilerin deri yaralarının tedavisine ihtiyacı var. İlaç tedavileri için hedef moleküllerinizi belirlemek için in vitro ve in vivo test sistemleri gereklidir. Uygun sistemler in vitro çizik teşp, ve in vivo dorsal cilt kat odası vardır.Her ikisi de farmakolojik olarak aktif bileşiklerin yokluğunda ve varlığında hücre göçünü ve deri yara iyileşmesini izlemek için doğrudan ileri prosedürlerdir. Her iki teknik de doğrudan olmasına rağmen, araştırmacılar çizik uygulaması uygulamalıdır. Ve sırt derisi kat oda implantasyonu, ve güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için yaralanma.Prosedürlerin gösterimi, klinik ve deneysel cerrahi enstitüsünden cerrah ve profesör Dr. Matthias Laschke tarafından yapılacaktır. İşleme başlamadan önce, her kültür için çizilme bölgesini çizgilemek için her kuyunun altında yatay bir çizgi ile hücre tipi başına bir altı iyi plaka işaretlemek için ultra ince bir kalıcı işaretçi kullanın. Sonraki plaka birincil lif patlamalar vahşi tip ve beta 3 eksik fareler izole, bir altı kuyu plaka 5 kez 10 iyi konsantrasyon başına beşinci lif patlamaları.DMEM'in 2mL'sinde %10 fetal büyükbaş serum uymaktadır. Plakaları hücre tipi, genotip ve tarih ile etiketle. Ve plakaları 24 saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.Ertesi sabah ilgi her lipid tabanlı transfeksiyon reaktif 9 mikro litre ekleyin, tüp başına azaltılmış serum orta 150 mikro litre içeren bireysel mikro santrifüj tüpler. Tüp başına 150 mikro litre azaltılmış serum ortamı içeren transfeksiyon reaktifi başına ikinci bir mikro santrifüj tüpüne 1,5 mikro litre siRNA ekleyin. Ve transfeksiyon reaktif çözeltisi tek bir tüp ile her siRNA çözeltisi karıştırın.Kısa bir süre girdap sonra 5 dakika boyunca 21 derece santigrat de karışımları yerleştirin. Kuluçka sırasında dikkatle her kuyuda supernate değiştirin. Kuyuların yan aşağı taze kültür orta 2.25mL ile.Kuluçka sonunda uygun siRNA transfeksiyon reaktif karışımı 250 mikro litre ekleyin, hücrelerin her karşılık gelen kuyu içine akıllıca bırakın. Ve plakaları 72 saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine geri ver. Hücreler %100 biraraya geldiğinde, her kuyudan kültür supernatant atın.Ve 200 mikro litrelik pipet ucu confluent hücre monolayer çizik oluşturmak için kullanın. Her kuyunun altındaki işaretli yatay çizgiye dikey. Daha sonra her yaralıyı yıkama başına 2mL PPS ile 2 kez dikkatlice durulayın.Hasarlı hücrelerden, gevşek hücrelerden veya çizik alandan enkaz dan serbest bırakılan faktörleri kaldırmak için. İkinci yıkamadan sonra her kuyuya yüzde 1 veya 10 serum ile takviye taze hücre kültürü orta 2mL ekleyin. Ve ışık mikroskobundaki her tabaktaki yaraların görüntülerini yakalayın.10X büyütmede tırmalamadan hemen sonra. Sonra plakayı hücre kültürü kuluçka makinesine geri ver. Önümüzdeki 30 saat için uygun deneysel zaman noktalarında görüntüleri yakalamaya devam.Deneyin sonunda kültür 6, 10 ve 30 saat sonra ilk hücre serbest alan ve kalan alanı ölçmek. İlk çizilme alanına göre göç eden hücreler tarafından yeniden doldurulan çizilme alanının yüzdesini belirlemek için. Parmak tutam yanıt eksikliği doğruladıktan sonra, vahşi türü veya beta üç nakavt C57 siyah altı fare, dikkatle dorsum tıraş.Ve hayvanın gözlerine merhem uygulayın. Kalan tüyleri ortadan kaldırmak için tüy dökücü krem uygulayın. 10 dakika sonra krem çıkarmadan.Titanyum haznesini hazırlamak için, simetrik titanyum oda çerçevesinin bir kısmını, somunlarla bağlantı vidaları ile sabitleyin. Haznenin iki simetrik parçası arasında 400 ila 500 mikrometre korumak. Deride kan vezikülleri sıkıştırma önlemek için.Maruz kalan cildi %70 etanol ile dezenfekte edin. Ve bir ışık kaynağının önünde bir deri kıvrımı kavramak. Derinin çift tabakasının orta çizgisini titanyum haznesinin implante edileceği yere yerleştirin.Ve kranially ve caudally bir polipropilen sütür ile cilt kıvrım düzeltmek. Katlanmış cildi kaldırmak için sütür diğer tarafını metal bir rafüzerinde sıkın. Ve farenin rahatça oturmasını sağlamak için rafın yüksekliğini ayarlayın.Dorsal deri kıvrımının arkasına üstün kenarı polipropilen dikişler ile titanyum haznesinin ilk çerçevedikiş. Sedasyon yeniden doğruladıktan sonra deride küçük kesiler yapmak için ince makas kullanın. Ve titanyum haznesinin ilk yarısına bağlı iki bağlantı vidasını deri kıvrımının tabanından geçirin.Fareyi raftan çıkarın ve hayvanı yanal bir konuma yerleştirin. Titanyum haznesinin ikinci ücretsiz yarısını 3 bağlantı vidasının üzerine yerleştirin. Ve el ile titanyum çerçevenin ikinci yarısından bu vidageçmek için hafif basınç uygulayın.Katlanmış deri tabakası şimdi titanyum çerçevenin iki simetrik yarısı arasında sıkışmış. Sonra paslanmaz çelik fındık ile her iki simetrik parçaları düzeltmek. Standart 2mL çapında biyopsi yumruğu kullanarak, deri kıvrım odasının gözlem penceresi içinde, derinin merkezindeki yara alanını işaretleyin.Ve işareti içinde tüm epidermis ve dermis kaldırmak için ince çerkes ve makas kullanın. Dairesel bir yara yaratmak için. 3,5 ila 4 buçuk milometre karelik yarayı 0,5 mL steril tuzlu su yla temizleyin.Yarayı cam kapaklı bir kapakla kapatın. Yerine kapak düzeltmek için titanyum odasında snap ring plier kullanın. Ve hemen fareyi bir stereomikroskobun görüntüleme aşamasına aktarın.Sonra yarayı 40X büyütmede görüntüle. Tam kurtarma kadar izleme ile bir kafesiçine fare yerleştirmeden önce. Gösterildiği gibi 200 mikro litrelik pipet ucu kullanılarak bir çizik oluşturduktan sonra, bu temsili deneyde, her iki genotipten hücreler çizilme alanına göç etti ve boşluğu kapattı.Hücre geçişi daha sonra çizik yapıldıktan 6 saat sonra göç eden hücreler tarafından yeniden doldurulan çizilme alanı yüzdesi olarak ölçüldü. Örneğin bu deneyde Cav beta 3 eksik lif patlamaları göç vahşi tip farelerden lif patlamaları önemli ölçüde daha erken çizik alanı kapattı. Cav beta 3'ün eksik lif patlamalarında gözlenen Cav beta 3 bağımlı etkisini doğrulamak için, yabani tip lif patlamaları Cav beta 3 proteinini aşağı doğru lamak için siRNA ile transfected edildi.Cav beta 3 spesifik siRNA'larla tedavi edilen fiber patlamalar beta 3 eksik lif patlamaları gibi davrandı. Her iki genotip arasında deri yara iyileşmesi karşılaştırmak için, deri kıvrım odasında yara alanı doğrudan yaradan sonra fotoğraflandı. Ve yara sonraki 2 hafta içinde görüntülendi.Görüntülerde yaraların boyutları ölçüldü ve yara alanı, belirli bir günde ilk yara alanının yüzdesi olarak ifade edildi. Beklendiği gibi cav beta 3 eksik farelerde yara kapatma oranı yabani tip kontrollere göre artırıldı. Her çizik için pipet ucuna eşit basınç uyguladığından ve çizikleri plakanın altındaki işaretli çizgilerle mümkün olduğunca yakından eşleştirdiğinden emin olun.Dorsal deri kıvrım odasının gözlem penceresi iyileşme sürecinde her zaman açılabilir. Farmakolojik olarak aktif bileşiklerin topikal uygulamasına izin vermek. Ayrıca iyileşme sürecinin farklı aşamalarında yaralı bölgeyi çıkarmak da mümkündür.Moleküler protein biyokimyasal veya histolojik analizi için.

Research

JoVE Journal

Medicine

Murine Model of Wound Healing

Yara Şifa murin Modeli

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murin için Endoskop<em&gt; In Vivo</em&gt; Karsinojenez ve bağırsak Değerlendirilmesi Multimodaller Görüntüleme Yara İyileşmesi ve İltihap

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Ischemic Tissue Injury in the Dorsal Skinfold Chamber of the Mouse: A Skin Flap Model to Investigate Acute Persistent Ischemia

Mouse Dorsal Skinfold Odası&#39;nda İskemik Doku Yaralanması: Bir Cilt Flap Model Akut Kalıcı iskemisi Araştırma

Despite profound expertise and advanced surgical techniques, ischemia-induced complications ranging from wound breakdown to extensive tissue necrosis are ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Farelerde Taksanlar Farmakokinetik ve Farmakodinamik Analiz Karotis Arter İnfüzyonlar

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

İnsan Tümör ksenogratflarının gelen Fare Hücrelerinin tükenmesi Anlamlı Hedef Hücre Alt Analizi geliştirir

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

Pulpa Değerlendirilmesi için Doğrudan Selüloz-kapatma Modelinin Geliştirilmesi Yara İyileşmesi ve Farelerde Onarım dentin oluşumu

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Optimize Analizi<em&gt; İn Vivo</em&gt; ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Karaciğer Steatoz

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

Mikroskopi Vitro yara iyileşmesi sırasında epitel hücre göç değerlendirilmesi için yöntemleri temel

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Kornea epitel aşınma oküler Burr ile bir Model olarak kornea için yara iyileşme

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...