Name: functionalization of atomic force microscope cantilevers with single-t cells or single-particle for immunological single-cell force spectroscopy
Uploaded: 2019-07-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy at JoVE.com

ويدعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31370878)، وبرنامج مفتاح الدولة (31630023)، وبرنامج مجموعة البحوث المبتكرة (81621002).

بروتوكول تجربة الماوس يتبع المبادئ التوجيهية لرعاية الحيوانات من جامعة تسينغهوا
1. Cantilever functionalization مع خلايا T واحدة
<ol><li>إعداد خلايا الطحال الماوس<ol>
<li>التضحية الماوس (8-16 أسابيع من العمر (أي من الجنسين)؛ على سبيل المثال، C57BL/6 سلالة) باستخدام ثاني أكسيد الكربون، تليها خلع عنق ...

<ol>
	<li>Benoit, M., Gabriel, D., Gerisch, G., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrete+interactions+in+cell+adhesion+measured+by+single-molecule+force+spectroscopy.">Discrete interactions in cell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy.</a> Nature Cell Biology. 2 (6), 313-317 (2000).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+adhesion+by+regulatory+T+cells+induces+dendritic+cell+cytoskeletal+polarization+and+contact-dependent+lethargy.">Strong adhesion by regulatory T cells induces dendritic cell cytoskeletal polarization and contact-dependent lethargy.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 327-338 (2017).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction-modulated+fibrotic+microniches+reveal+the+contribution+of+angiogenesis+in+liver+fibrosis.">Mechanotransduction-modulated fibrotic microniches reveal the contribution of angiogenesis in liver fibrosis.</a> Nature Materials. 16 (12), 1252-1261 (2017).</li><li>Mu, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phosphatidylinositol+4,5-bisphosphate+redistribution-based+sensing+mechanism+initiates+a+phagocytosis+programing.">A phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate redistribution-based sensing mechanism initiates a phagocytosis programing.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Qi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology-targeted+cell+delivery+via+injectable+micro-scaffold+capsule+mediated+by+endogenous+TGase.">Pathology-targeted cell delivery via injectable micro-scaffold capsule mediated by endogenous TGase.</a> Biomaterials. 126, 1-9 (2017).</li><li>Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+probing+surfaces+of+living+cells+to+molecular+resolution.">Force probing surfaces of living cells to molecular resolution.</a> Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).</li><li>Muller, D. J., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy:+a+nanoscopic+window+on+the+cell+surface.">Atomic force microscopy: a nanoscopic window on the cell surface.</a> Trends in Cell Biology. 21 (8), 461-469 (2011).</li><li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth.">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysics Journal. 103 (3), 386-394 (2012).</li><li>Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+probing+of+cell+elasticity.">Atomic force microscopy probing of cell elasticity.</a> Micron. 38 (8), 824-833 (2007).</li><li>Scheuring, S., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy:+probing+the+spatial+organization,+interactions+and+elasticity+of+microbial+cell+envelopes+at+molecular+resolution.">Atomic force microscopy: probing the spatial organization, interactions and elasticity of microbial cell envelopes at molecular resolution.</a> Molecular Microbiology. 75 (6), 1327-1336 (2010).</li><li>Berdyyeva, T. K., Woodworth, C. D., Sokolov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+epithelial+cells+increase+their+rigidity+with+ageing+in+vitro:+direct+measurements.">Human epithelial cells increase their rigidity with ageing in vitro: direct measurements.</a> Physics in Medicine and Biology. 50 (1), 81-92 (2005).</li><li>Sokolov, I., Dokukin, M. E., Guz, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+quantitative+measurements+of+the+elastic+modulus+of+biological+cells+in+AFM+indentation+experiments.">Method for quantitative measurements of the elastic modulus of biological cells in AFM indentation experiments.</a> Methods. 60 (2), 202-213 (2013).</li><li>Bozna, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+strength+and+dynamics+of+invariant+natural+killer+cell+T+cell+receptor/CD1d-glycosphingolipid+interaction+on+living+cells+by+single+molecule+force+spectroscopy.">Binding strength and dynamics of invariant natural killer cell T cell receptor/CD1d-glycosphingolipid interaction on living cells by single molecule force spectroscopy.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 15973-15979 (2011).</li><li>Flach, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alum+interaction+with+dendritic+cell+membrane+lipids+is+essential+for+its+adjuvanticity.">Alum interaction with dendritic cell membrane lipids is essential for its adjuvanticity.</a> Nature Medicine. 17 (4), 479-487 (2011).</li><li>Ng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-independent,+direct+membrane+binding+leads+to+cell-surface+lipid+sorting+and+Syk+kinase+activation+in+dendritic+cells.">Receptor-independent, direct membrane binding leads to cell-surface lipid sorting and Syk kinase activation in dendritic cells.</a> Immunity. 29 (5), 807-818 (2008).</li><li>Helenius, J., Heisenberg, C. P., Gaub, H. E., Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+force+spectroscopy.">Single-cell force spectroscopy.</a> Journal of Cell Science. 121 (11), 1785-1791 (2008).</li><li>Litvinov, R. I., Shuman, H., Bennett, J. S., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+strength+and+activation+state+of+single+fibrinogen-integrin+pairs+on+living+cells.">Binding strength and activation state of single fibrinogen-integrin pairs on living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7426-7431 (2002).</li><li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+Force+Technique+to+Probe+Molecular+Adhesion+and+Structural+Linkages+at+Biological+Interfaces.">Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces.</a> Biophysics Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).</li><li>Lamprecht, C., Hinterdorfer, P., Ebner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+biosensing+atomic+force+microscopy+in+monitoring+drug+and+nanoparticle+delivery.">Applications of biosensing atomic force microscopy in monitoring drug and nanoparticle delivery.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (8), 1237-1253 (2014).</li><li>Charras, G. T., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+mechanotransduction+and+its+modulation+analyzed+by+atomic+force+microscope+indentation.">Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation.</a> Biophysics Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).</li><li>Sun, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+membrane+tethers+probed+by+atomic+force+microscopy.">Multiple membrane tethers probed by atomic force microscopy.</a> Biophysics Journal. 89 (6), 4320-4329 (2005).</li><li>Yan, J. C., Liu, B., Shi, Y., Qi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class+II+MHC-independent+suppressive+adhesion+of+dendritic+cells+by+regulatory+T+cells+in+vivo.">Class II MHC-independent suppressive adhesion of dendritic cells by regulatory T cells in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 319-326 (2017).</li><li>Hao, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C-mediated+hydrolysis+of+PIP2+releases+ERM+proteins+from+lymphocyte+membrane.">Phospholipase C-mediated hydrolysis of PIP2 releases ERM proteins from lymphocyte membrane.</a> Journal of Cell Biology. 184 (3), 451-462 (2009).</li><li>Rodriguez, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte-T+Adhesion+to+Fibronectin+(Fn)+-+a+Possible+Mechanism+for+T-Cell+Accumulation+in+the+Rheumatoid+Joint.">Lymphocyte-T Adhesion to Fibronectin (Fn) - a Possible Mechanism for T-Cell Accumulation in the Rheumatoid Joint.</a> Clinical and Experimental Immunology. 89 (3), 439-445 (1992).</li><li>Kimura, A., Ersson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Lymphocytes-T+by+Lectins+and+Carbohydrate-Oxidizing+Reagents+Viewed+as+an+Immunological+Recognition+of+Cell-Surface+Modifications+Seen+in+the+Context+of+Self+Major+Histocompatibility+Complex+Antigens.">Activation of Lymphocytes-T by Lectins and Carbohydrate-Oxidizing Reagents Viewed as an Immunological Recognition of Cell-Surface Modifications Seen in the Context of Self Major Histocompatibility Complex Antigens.</a> European Journal of Immunology. 11 (6), 475-483 (1981).</li><li>Miller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Stimulation+of+Human+Lymphocyte-B+and+Lymphocyte-T+by+Various+Lectins.">The Stimulation of Human Lymphocyte-B and Lymphocyte-T by Various Lectins.</a> Immunobiology. 165 (2), 132-146 (1983).</li><li>Vitte, J., Pierres, A., Benoliel, A. M., Bongrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+quantification+of+the+modulation+of+interaction+between+cell-+or+surface-bound+LFA-1+and+ICAM-1.">Direct quantification of the modulation of interaction between cell- or surface-bound LFA-1 and ICAM-1.</a> Journal of Leukocyte Biology. 76 (3), 594-602 (2004).</li><li>Beaussart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+forces+guiding+microbial+cell+adhesion+using+single-cell+force+spectroscopy.">Quantifying the forces guiding microbial cell adhesion using single-cell force spectroscopy.</a> Nature Protocols. 9 (5), 1049-1055 (2014).</li><li>Shu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+Crystal-Mediated+Inflammation+Is+Driven+by+Plasma+Membrane+Destabilization.">Cholesterol Crystal-Mediated Inflammation Is Driven by Plasma Membrane Destabilization.</a> Frontiers in Immunology. 9, (2018).</li><li>Hosseini, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+synapse+formation+determines+interaction+forces+between+T+cells+and+antigen-presenting+cells+measured+by+atomic+force+microscopy.">Immune synapse formation determines interaction forces between T cells and antigen-presenting cells measured by atomic force microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17852-17857 (2009).</li></ol>

وقد تطور التحليل الطيفي لقوة الخلية الواحدة القائم على AFM ليكون أداة قوية لمعالجة الخصائص الفيزيائية الحيوية للخلايا الحية. وبالنسبة لتلك التطبيقات، تحتاج العلبة إلى أن تعمل بشكل صحيح من أجل سبر تفاعلات أو خصائص محددة على خلايا الاهتمام. هنا، يتم وصف أساليب لاقتران خلية T واحدة وحبة واحدة...

وقد وجدت مجهرية القوة الذرية (AFM)، أداةمتعددة الاستخدامات، العديد من التطبيقات في أبحاث بيولوجيا الخلايا 1،2،3،4،5. وبصرف النظر عن قدرتها على التصوير عالية الدقة، تسمح ميزة سبر القوة الأصلية بالخصائص البيوفيزيائية للخلايا الحية للتحقيق مباشرة في الموقع على مستوى الخلية الواحدة6و7. وتشمل هذه صلابة الهياكل دون الخلوية أو حتى الخلايا الكاملة8،9،10،11،12، محددة ligand / مستقبلات نقاط القوة ملزمة في مستوى جزيء واحد على سطح الخلية13، وقوات التصاق بين أزواج واحدة من الجسيمات الصلبة والخلايا أو بين خليتين1،2،14،15. وغالبا ما تصنف هذه الأخيرة على أنها مطياف قوة خلية واحدة (SCFS)16. نظرا ً للوجود اتّصاليّة متاحة بسهولة مع ثابت ة ربيعية مختلفة، فإن نطاق القوة الذي يمكن الوصول إليه من قبل AFM واسع نوعاً ما من عدد قليل من البيكونيوتن (pN) إلى ميكرونيوتن (μN)، الذي يغطي بشكل كافًا المجموعة الكاملة من الأحداث الخلوية التي تشمل قوى من بضع عشرات من pN، مثل مستقبلات القائم على واحد جزيء ملزمة، إلى nN، مثل الأحداث الخلوية phagocytic15. هذا النطاق قوة ديناميكية كبيرة يجعل AFM مفيدة على غيرها من تقنيات القوة التحقيق مثل ملاقط البصرية / المغناطيسية ومسبار قوة الغشاء الحيوي، كما أنها أكثر ملاءمة لقياسات قوة ضعيفة، مع قوة عادة أقل من 200 pN17 , 18.وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تعمل AFM كمتلاعب عالية الدقة لتقديم مختلف المحفزات على خلايا واحدة بطريقة محددة زمنيا4،19. هذا أمر مرغوب فيه لدراسات تنشيط خلية واحدة في الوقت الحقيقي. جنبا إلى جنب مع التصوير الفلورة الخلية الحية، يمكن رصد الاستجابة الخلوية اللاحقة للتحفيز محددة في وقت واحد، مما يجعل SCFS المستندة إلى AFM قوية للغاية كما التصوير البصري توفير أداة عملية للتحقيق الإشارات الخلوية. على سبيل المثال، تم استخدام AFM لتحديد السلالات اللازمة للحصول على عابرات الكالسيوم في osteoblasts20. في هذا العمل، تم تعقب عابري الكالسيوم بشكل فلوري من خلال التصوير الكالسيوم نسبة متري بعد تطبيق القوى المترجمة على osteoblasts المستزرعة مع طرف AFM. في الآونة الأخيرة، تم استخدام AFM لتمتد fibrils الكولاجين التي نمت خلايا الستيلات الكبد (HSC) وهذا التنشيط HSC التي يسببها المشانو تم رصدها في الوقت الحقيقي من قبل جهاز استشعار حيوي SRC الفلورسنت، الذي الفسفورية كما يمثلها ويرتبط كثافة الفلورة من جهاز الاستشعارالحيوي مع تفعيل HSC 3.
في تجارب SCFS المستندة إلى AFM، يعتبر إضفاء الطابع الوظيفي السليم على cantilevers AFM خطوة رئيسية نحو القياسات الناجحة. منذ اهتمامنا البحثي يركز على تنشيط الخلايا المناعية، ونحن تعمل بشكل روتيني cantilevers مع المسائل الجسيمات مثل الجسيمات الصلبة واحدة التي يمكن أن تؤدي إلى phagocytosis و / أو استجابات المناعة القوية4،14 , 15 وخلايا T واحدة التي يمكن أن تشكل متشابك المناعة مع مستضد تقديم الخلايا، مثل الخلايا الجذعية المنشطة (DC)2. وعادة ما تقترن الجسيمات الصلبة واحدة إلى cantilever عن طريق الغراء الايبوكسي في بيئة الهواء، في حين أن خلايا T واحدة، بسبب طبيعتها غير لاصقة، هي functionalized إلى cantilever عن طريق الغراء متوافق بيولوجيا في الحل. هنا، ونحن نوصف أساليب لتنفيذ هذين النوعين من تعديل cantilever وإعطاء اثنين من التطبيقات المرتبطة بها كذلك. التطبيق الأول هو التحقيق T خلية / DC التفاعلات مع AFM-SCFS لفهم الآلية القمعية للخلايا T التنظيمية من وجهة نظر ميكانيكا الخلية. والثاني ينطوي على الجمع بين AFM مع التصوير الفلوري الخلايا الحية لرصد الاستجابة الخلوية للماكروفاج إلى الجسيمات الصلبة في الوقت الحقيقي للكشف عن الآلية الجزيئية للفوسفاتيديلينسيتول مستقل مستقبلات 4,5-بيسفوسفات (PIP2)- [موسين] يتوسط [فغوستسس]. والهدف من هذا البروتوكول هو توفير إطار مرجعي للباحثين المهتمين لتصميم وتنفيذ الإعدادات التجريبية الخاصة بهم مع تحليل الخلايا الواحدة القائم على AFM للبحوث المناعية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;l pipette tip</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>104-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm diameter culture dish</td>
			<td>NALGENE nunc</td>
			<td>150462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plate</td>
			<td>JET</td>
			<td>TCP011006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Cantilever</td>
			<td>NanoWorld</td>
			<td>Arrow-TL1-50</td>
			<td>tipless cantilever</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocompatible glue</td>
			<td>BD Cell-Tak</td>
			<td>354240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4+ T cell isolation Cocktail</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>19852C.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC2.4 cell line</td>
			<td>A gift from K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-coated magnetic particles</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>GENEray</td>
			<td>Generay-E1101-500 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>ERGO</td>
			<td>7100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>twbio</td>
			<td>00019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Ex Cell Bio</td>
			<td>FSP500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR blocker</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>local vender (Hai Men Lian Sheng)</td>
			<td>HX-E37</td>
			<td>24mm diameter, 0.17mm thinckness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>JinTong department of laboratory and equipment management, Haimen&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>customized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2 (30%)</td>
			<td>Sino pharm</td>
			<td>10011218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Sino pharm</td>
			<td>80120892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh nylon strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>REF 352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moesin-EGFP</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>cloned in laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD25 Treg cell positive isolation kit</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18782</td>
			<td>Component: FcR Blocker,Regulatory T cell Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD4+ Tcell isolation kit</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>19852</td>
			<td>Component:CD4+T cell isolation Cocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rat Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Lanyi chemical products co., LTD&#65292; Beijing</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1022-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE selection cocktail</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLC&#948;-PH-mCherry</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>36075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microspheres 6.0&#956;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>07312-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polystyrene round bottom tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat serum</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>13551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7</td>
			<td>&#160;ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Interleukin-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>Peprotech, 200-02-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regulatory T cell positive selection cocktail</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18782C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Life</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample chamber</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-coated magnetic particles</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>50001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection kit</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25% EDTA</td>
			<td>Life</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>JD</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective NA 0.8</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>420650-9901</td>
			<td>Plan-Apochromat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force microscope</td>
			<td>JPK</td>
			<td>cellHesion200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>Allegra X-12R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence imaging</td>
			<td>home-made objective-type total internal reflection fluorescence microscop based on a Zeiss microscope stand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HERACELL 150i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Observer A1 manual</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functionalization of atomic force microscope cantilevers with single-t cells or single-particle for immunological single-cell force spectroscopy

التحليل المجهري للقوة الذرية القائم على قوة الخلية الواحدة (AFM-SCFS) هو أداة قوية لدراسة الخصائص البيوفيزيائية للخلايا الحية. تسمح هذه التقنية للتحقق من نقاط القوة والديناميات التفاعل على غشاء الخلية الحية, بما في ذلك تلك التي بين الخلايا, مستقبلات وligands, وجنبا إلى جنب مع العديد من الاختلافات الأخرى. كما أنها تعمل كآلية لتقديم التحفيز الفيزيائي أو البيوكيميائي على الخلايا المفردة بطريقة محكومة زمنياً، مما يسمح بمراقبة تنشيط الخلايا المحددة والأحداث الخلوية اللاحقة في الوقت الحقيقي عندما يتم دمجها مع الخلية الحية التصوير الفلوري. الخطوة الرئيسية في تلك القياسات AFM-SCFS هي AFM-cantilever functionalization، أو بعبارة أخرى، إرفاق موضوع من الفائدة على cantilever. هنا، نقدم أساليب لتعديل cantilevers AFM مع خلية T واحدة وحبة البوليسترين واحدة على التوالي للدراسات المناعية. الأول ينطوي على الغراء متوافق بيولوجيا أن الأزواج خلايا T واحدة إلى غيض من cantilever شقة في حل، في حين أن هذا الأخير يعتمد على الغراء الايبوكسي لالتصاق حبة واحدة في بيئة الهواء. كما يتم توفير تطبيقين مناعيين مرتبطين بكل تعديل في الكانتيلفين. الطرق الموصوفة هنا يمكن تكييفها بسهولة لأنواع الخلايا المختلفة والجسيمات الصلبة.

ويبين الشكل 4A منحنيات المسافة الفردية من التفاعل الملزم بين الخلية أحادية T ووحدة البيانات أحادية في دورة واحدة للسحب من النهج. منحنى أحمر فاتح هو منحنى التمديد والأحمر الداكن هو منحنى التراجع. منذ يتم استخدام منحنى التمديد عادة للمسافة البادئة أو صلابة ?...

Watch this Scientific Journal Video about Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy at JoVE.com

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

نقدم بروتوكولا ً لتجسيد مجهر القوة الذرية (AFM) مع خلية T واحدة وجسيمات الخرزة للدراسات المناعية. وتظهر إجراءات التحقيق في خلية T خلية واحدة ملزمة من قبل AFM ورصد الاستجابة الخلوية في الوقت الحقيقي من الضامة إلى الجسيمات الصلبة واحدة من قبل AFM مع التصوير الفلوري.

وظيفية من القوة الذرية مجهر Cantilevers مع خلايا واحدة تي أو الجسيمات واحدة لالمناعية أحادية الخلية قوة مطيافية

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...

يصف هذا البروتوكول أفضل طريقة لإضفاء الطابع الوظيفي على الـ AFM باستخدام خلايا T واحدة وجزيئات صلبة. ويمكن بعد ذلك استخدام هذه النصائح للتحقيق في زوج واحد تفاعلات خلية تيتشاندريتي الخلية T ورصد الاستجابات الخلوية من حجم متقلب، على التوالي. ومن المزايا الرئيسية لهذه التقنية أنه يستخدم الغراء compatible لوظيفية خلية T واحدة من cantilevers.هذا الغراء هو خامل للخلايا eukaryotic، وبالتالي الحفاظ على الخلايا التائية في مرحلة التنشيط خط الأساس. توفر هذه الطرق نظرة ثاقبة لتنشيط الخلايا المناعية والأحداث المعقدة بين الخلايا، مثل تشكيل المشبك المناعي. ويمكن أيضاً توسيع نطاق هذه الأساليب لتشمل أنظمة أخرى تشمل تفاعلات خلايا الخلية أو سطح الخلية.بالنسبة لشخص جديد على هذه التقنية، من المهم التأكد من أن الخلايا T في حالة جيدة قبل الاستخدام ومن أن يتم المعالجة المسبقة مع IL-2 بين عشية وضحاها. بالإضافة إلى ذلك، عند استخدام الغراء الحيوي، والتحرك بسرعة لحمايته من الأكسدة غير الضرورية. لبدء هذا الإجراء، قم بإعداد الخلايا T واحدة للمجهر عن طريق اتباع جنبا إلى جنب في بروتوكول النص.ثم، إعداد أغطية الزجاج بذر مع الخلايا DC2.4، واحتضان الخلايا بين عشية وضحاها في غرفة مرطبة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تنظيف لينة، cantilevers تلميح مع ثابت الربيع منخفضة باستخدام علاج البيرانا، تنظيف البلازما، أو تنظيف الأوزون فوق البنفسجية. ثم، قم بتركيب الـ cantilever المنظف إلى رأس المسح الضوئي لـ AFM.المقبل، وإعداد غرفة عينة نظيفة، وملء ذلك بالماء النقي. معايرة كانتليفر في محلول المياه عن طريق تشغيل أول منحنى قوة على الركيزة الزجاجية للحصول على حساسية من cantilever. ثم، تسجيل طيف الضوضاء الحرارية لاستخراج ثابت الربيع.عندما يتم معايرة cantilever بشكل صحيح، إزالة رئيس مسح AFM من الحل. اغسل الـ cantilever المثبت ببضع قطرات من الإيثانول النقي، وأبقِ الـ cantilever جافًا على رأس المسح. سخني حاوية بيئة الخلايا الحية إلى 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.ثم، جبل الزجاج coverlip البذور مع الخلايا DC2.4 إلى الجمعية عينة الغرفة، وعلى الفور إضافة 600 ميكرولترات من B المتوسطة إلى الغرفة. ضع التجميع المكتمل على مرحلة عينة AFM. إضافة خلايا T CD4-محتضنة في غرفة العينة IL-2-المحتضنة.انتظر حتى يتم تسوية الخلايا التائية المستهدفة بشكل كامل على الجزء السفلي من الغطاء ، ثم إحضار الخلايا في مجال الرؤية تحت المجهر. الآن، إضافة قطرة اثنين microliter من الغراء compatible على نهاية cantilever شنت مع ماصة. مرة واحدة وقد تم تطبيق الغراء compatible بيولوجيا إلى cantilever، الخطوات اللاحقة يجب أن تنتهي في أقرب وقت ممكن من أجل تعظيم التصاق.ضع بسرعة رأس المسح الضوئي على مرحلة العينة ، وغمر الـ cantilever المغلفة بالغراء في الحل. نقل مرحلة العينة حتى يتم وضع خلية T الصحة تحت غيض من cantilever. ثم، ضبط بدقة موقفها عن طريق تحريك رئيس المسح الضوئي.بعد ذلك، خفض كانتليفر يدويا. تبدأ مع حجم خطوة 50 ميكرون، ثم تنخفض إلى 10، خمسة، واثنين، وأخيرا 0.5 ميكرون تدريجيا، كما هو مبين من حدة الصورة cantilever. الآن، عقد موقف المحركات السائر، وضبط وضعية رئيس المسح الضوئي لمحاذاة أفضل تلميح cantilever والخلية.استمر حتى يتم الإشارة إلى الاتصال الثابت عن طريق إزاحة صغيرة من موضع الليزر ، يقابل قوة نموذجية من 0.5 إلى 1.5 نانوتونات. بعد 30 ثانية من الاتصال، تراجع عن المكنة. إذا تحركت الخلية مع cantilever، كان المرفق بنجاح.إذا لم يكن كذلك، كرر خطوة التصاق تصل إلى ثلاث مرات قبل التحول إلى كانتليفر جديدة. ضع الخلية T المرفقة فوق خلية DC2.4 بتحريك مرحلة العينة ورأس المسح الضوئي. بعد إعداد المعلمات المناسبة، تشغيل الطيفية قوة عبر العينة.لجولة جديدة من التحقيق، جبل جديدة، cantilever نظيفة. معايرته في الماء النقي، ثم العودة إلى زوج خلية T-dendritic وكرر المسح الضوئي. جبل أغطية الزجاج تنظيفها إلى الجمعية غرفة عينة.إلى الجانب الأيسر من الغطاء، إضافة قطرة من محلول الخرز التي تم تخفيفها في الإيثانول ويحتوي على حبات البوليسترين قطرها ستة ميكرون. بمجرد أن يتبخر المذيب ، تحقق من تباعد الخرز باستخدام مجهر حقل مشرق مجهز بهدف 20x. تأكد من أن يتم فصل الخرز الفردية بشكل جيد.ثم، تراجع تلميح micropipette أو مسواك في الغراء الايبوكسي مختلطة جيدا، ونقل كمية صغيرة من الغراء إلى ثلاث بقع منفصلة مع اللمسات لطيف المتعاقبة على الجانب الأيمن ولكن على مقربة من وسط الأغطية، كما هو مبين هنا. بعد ذلك، قم بتركيب علبة نظيفة، غير طرف إلى رأس المسح الضوئي لـ AFM، ومعايرتها في الهواء بسطح نظيف للحصول على ثابت الربيع. ثم، موقف تلميح cantilever على الحدود اليسرى من بقعة الغراء الايبوكسي الماضي، وجلب ببطء cantilever قريبة من الغراء باستخدام أحجام خطوة صغيرة على المحركات السائر.مرة واحدة وقد تم الاتصال مع الغراء، وسحب بسرعة cantilever بشكل كبير عن طريق تحريك رئيس المسح AFM إلى الوراء. إزالة أي الغراء الزائد عن طريق فرك تشغيله ضد الزجاج، وترك سوى كمية صغيرة من الغراء في نهاية الحافة. الآن، نقل تلميح cantilever على رأس حبة معزولة بشكل جيد.الاقتراب من حبة واحدة ببطء، وجعل اتصال ثابت معها في حدود اثنين إلى خمسة نانوتونات لمدة 10 ثانية تقريبا. أثناء إجراء الاتصال، استخدم ضبط البقشيش الدقيق لوضع الخرزة في نهاية الطرف. سحب الطرف في نهاية جهة الاتصال.إذا اختفى الخرز من الطائرة البؤرية الأصلية، حدث حدث التصاق ناجح. وأخيرا ، demount cantilever تعديل حبة بعناية ، وتخزينها في مربع cantilever بين عشية وضحاها لايبوكسي لعلاج تماما. هنا منحنيات المسافة القوة النموذجية من تفاعل الربط بين خلية T واحدة و خلية تسخين واحدة على مدى دورة واحدة من نهج التراجع.المنحنى الأحمر الفاتح هو منحنى التمديد، والأحمر الداكن هو منحنى التراجع. القيمة الدنيا في المنحنى تعطي قياس قوة التصاق الحد الأقصى بين الخلية T وخلية التسخين، وتمثل المساحة تحت المنحنى العمل المطلوب لفصلها. ويمكن تفسير أحداث تمزق حاد وتدبقية كما الحبال غشاء يجري سحبها من سطح الخلية بسبب الربط قوية في واجهة الخلية الخلية ومن ثم كسر بشكل منفصل تحت سحب المستمر.هنا، يتم إظهار ربط الخلية T التقليدية إلى خلايا dendritic باللون الرمادي، ويتم عرض ربط خلية T التنظيمية إلى خلايا dendritic باللون الأزرق. قوى الالتصاق بين خلية T التقليدية والخلايا T التنظيمية تعترف مستضدات الببتيد التي تقدمها الخلايا المستضدية، في حين أن الخلايا T التنظيمية هي الخلايا التائية القامع التي تغلق مناعة الخلايا التائية التقليدية بوساطة الخلايا نحو نهاية رد فعل مناعي. هذا التخطيطي من الخلايا الفلورية المسماة، الفراتوسية الخام 264.7 يظهر الخلية التي اقترب مع واحد عارية، قطر ستة ميكرون، حبة البوليسترين.عند إشراك الخرزة ، يتم فرز غشاء PIP2 في موقع الاتصال ، بالقرب من b ، مما يحفز بعد ذلك التوظيف الغشائي للموريسين ، مما يؤدي إلى حدث بَلَمَي. بالإضافة إلى الإجراء الموضح هنا، يمكن استخدام التحليل الطيفي للقوة أحادية الخلية المستندة إلى AFM مع تصوير الفلوريس لدراسة تنشيط الخلايا المناعية في الوقت الحقيقي على مستوى الخلية الواحدة. تقنيات الفلوريسنس المشتركة، وهذا الأسلوب يسمح لمعالجة العمليات الخلوية أكثر تعقيدا في الوقت الحقيقي، مثل تشكيل المشبك المناعي بين خلية التشجر والخلايا T زوج.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

تيسير تحليل البيانات مناعية مع التقنيات التحليلية البصرية

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

وحيد الخلية تحليل<emالعصوية الرقيقة> الأغشية الحيوية باستخدام المجهر الإسفار والتدفق الخلوي

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

الكمية عالي الإنتاجية الفحص السمسة وحيدة الخلية لخلايا T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

نموذج الخلايا البطانية مستو التصوير المناعية سنبس حيوية

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

القشرية أكتين تدفق في خلايا T كميا بواسطة المكانية والزمانية صورة الارتباط الطيفي للهيكلة الإضاءة المجهر البيانات

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

تحليل الخلايا الليمفاوية التسرب باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من الدم في الدماغ الإنسان الحاجز

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

تحريض التمايز الخلوي والتصوير خلية واحدة من<em&gt; فيبرايو بارايموليتيكوس</em&gt; السباح و سوارمر الخلايا

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

التحديد الكمي افيروسيتوسيس بالفحص المجهري Fluorescence خلية واحدة

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

أوبسونوفاجوسيتيك قتل المقايسة لتقييم الاستجابات المناعية ضد مسببات الأمراض البكتيرية

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

تطبيق اضطرابات متناسقة تشبه التدليك على عجول الماوس ومراقبة التغيرات الناتجة عن الضغط العضلي العضلي

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...