Name: functionalization of atomic force microscope cantilevers with single-t cells or single-particle for immunological single-cell force spectroscopy
Uploaded: 2019-07-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy at JoVE.com

Diese Arbeit wird vom National Natural Science Foundation of China General Program (31370878), State Key Program (31630023) und Innovative Research Group Program (81621002) unterstützt.

Das Maus-Experiment-Protokoll folgt den Tierpflegerichtlinien der Tsinghua University
1. Auslegerfunktionalisierung mit einzelnen T-Zellen
<ol><li>Maus Milzzellen Vorbereitung<ol>
<li>Opfern Sie die Maus (8-16 Wochen alt (entweder Geschlecht); z.B. C57BL/6 Stamm) mit Kohlendioxid, gefolgt von Zervixdislokation.</li>
		<li>Reinigen Sie die Maus mit 75% Ethanol und machen Sie einen Mittellinien-Hautschnitt gefolgt von Splenektomie.</li>
		<li>Homogenisieren Sie die Milz in 4 ml PBS mit 2% feta...

<ol>
	<li>Benoit, M., Gabriel, D., Gerisch, G., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrete+interactions+in+cell+adhesion+measured+by+single-molecule+force+spectroscopy.">Discrete interactions in cell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy.</a> Nature Cell Biology. 2 (6), 313-317 (2000).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+adhesion+by+regulatory+T+cells+induces+dendritic+cell+cytoskeletal+polarization+and+contact-dependent+lethargy.">Strong adhesion by regulatory T cells induces dendritic cell cytoskeletal polarization and contact-dependent lethargy.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 327-338 (2017).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction-modulated+fibrotic+microniches+reveal+the+contribution+of+angiogenesis+in+liver+fibrosis.">Mechanotransduction-modulated fibrotic microniches reveal the contribution of angiogenesis in liver fibrosis.</a> Nature Materials. 16 (12), 1252-1261 (2017).</li><li>Mu, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phosphatidylinositol+4,5-bisphosphate+redistribution-based+sensing+mechanism+initiates+a+phagocytosis+programing.">A phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate redistribution-based sensing mechanism initiates a phagocytosis programing.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Qi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology-targeted+cell+delivery+via+injectable+micro-scaffold+capsule+mediated+by+endogenous+TGase.">Pathology-targeted cell delivery via injectable micro-scaffold capsule mediated by endogenous TGase.</a> Biomaterials. 126, 1-9 (2017).</li><li>Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+probing+surfaces+of+living+cells+to+molecular+resolution.">Force probing surfaces of living cells to molecular resolution.</a> Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).</li><li>Muller, D. J., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy:+a+nanoscopic+window+on+the+cell+surface.">Atomic force microscopy: a nanoscopic window on the cell surface.</a> Trends in Cell Biology. 21 (8), 461-469 (2011).</li><li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth.">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysics Journal. 103 (3), 386-394 (2012).</li><li>Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+probing+of+cell+elasticity.">Atomic force microscopy probing of cell elasticity.</a> Micron. 38 (8), 824-833 (2007).</li><li>Scheuring, S., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy:+probing+the+spatial+organization,+interactions+and+elasticity+of+microbial+cell+envelopes+at+molecular+resolution.">Atomic force microscopy: probing the spatial organization, interactions and elasticity of microbial cell envelopes at molecular resolution.</a> Molecular Microbiology. 75 (6), 1327-1336 (2010).</li><li>Berdyyeva, T. K., Woodworth, C. D., Sokolov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+epithelial+cells+increase+their+rigidity+with+ageing+in+vitro:+direct+measurements.">Human epithelial cells increase their rigidity with ageing in vitro: direct measurements.</a> Physics in Medicine and Biology. 50 (1), 81-92 (2005).</li><li>Sokolov, I., Dokukin, M. E., Guz, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+quantitative+measurements+of+the+elastic+modulus+of+biological+cells+in+AFM+indentation+experiments.">Method for quantitative measurements of the elastic modulus of biological cells in AFM indentation experiments.</a> Methods. 60 (2), 202-213 (2013).</li><li>Bozna, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+strength+and+dynamics+of+invariant+natural+killer+cell+T+cell+receptor/CD1d-glycosphingolipid+interaction+on+living+cells+by+single+molecule+force+spectroscopy.">Binding strength and dynamics of invariant natural killer cell T cell receptor/CD1d-glycosphingolipid interaction on living cells by single molecule force spectroscopy.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 15973-15979 (2011).</li><li>Flach, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alum+interaction+with+dendritic+cell+membrane+lipids+is+essential+for+its+adjuvanticity.">Alum interaction with dendritic cell membrane lipids is essential for its adjuvanticity.</a> Nature Medicine. 17 (4), 479-487 (2011).</li><li>Ng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-independent,+direct+membrane+binding+leads+to+cell-surface+lipid+sorting+and+Syk+kinase+activation+in+dendritic+cells.">Receptor-independent, direct membrane binding leads to cell-surface lipid sorting and Syk kinase activation in dendritic cells.</a> Immunity. 29 (5), 807-818 (2008).</li><li>Helenius, J., Heisenberg, C. P., Gaub, H. E., Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+force+spectroscopy.">Single-cell force spectroscopy.</a> Journal of Cell Science. 121 (11), 1785-1791 (2008).</li><li>Litvinov, R. I., Shuman, H., Bennett, J. S., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+strength+and+activation+state+of+single+fibrinogen-integrin+pairs+on+living+cells.">Binding strength and activation state of single fibrinogen-integrin pairs on living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7426-7431 (2002).</li><li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+Force+Technique+to+Probe+Molecular+Adhesion+and+Structural+Linkages+at+Biological+Interfaces.">Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces.</a> Biophysics Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).</li><li>Lamprecht, C., Hinterdorfer, P., Ebner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+biosensing+atomic+force+microscopy+in+monitoring+drug+and+nanoparticle+delivery.">Applications of biosensing atomic force microscopy in monitoring drug and nanoparticle delivery.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (8), 1237-1253 (2014).</li><li>Charras, G. T., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+mechanotransduction+and+its+modulation+analyzed+by+atomic+force+microscope+indentation.">Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation.</a> Biophysics Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).</li><li>Sun, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+membrane+tethers+probed+by+atomic+force+microscopy.">Multiple membrane tethers probed by atomic force microscopy.</a> Biophysics Journal. 89 (6), 4320-4329 (2005).</li><li>Yan, J. C., Liu, B., Shi, Y., Qi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class+II+MHC-independent+suppressive+adhesion+of+dendritic+cells+by+regulatory+T+cells+in+vivo.">Class II MHC-independent suppressive adhesion of dendritic cells by regulatory T cells in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 319-326 (2017).</li><li>Hao, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C-mediated+hydrolysis+of+PIP2+releases+ERM+proteins+from+lymphocyte+membrane.">Phospholipase C-mediated hydrolysis of PIP2 releases ERM proteins from lymphocyte membrane.</a> Journal of Cell Biology. 184 (3), 451-462 (2009).</li><li>Rodriguez, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte-T+Adhesion+to+Fibronectin+(Fn)+-+a+Possible+Mechanism+for+T-Cell+Accumulation+in+the+Rheumatoid+Joint.">Lymphocyte-T Adhesion to Fibronectin (Fn) - a Possible Mechanism for T-Cell Accumulation in the Rheumatoid Joint.</a> Clinical and Experimental Immunology. 89 (3), 439-445 (1992).</li><li>Kimura, A., Ersson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Lymphocytes-T+by+Lectins+and+Carbohydrate-Oxidizing+Reagents+Viewed+as+an+Immunological+Recognition+of+Cell-Surface+Modifications+Seen+in+the+Context+of+Self+Major+Histocompatibility+Complex+Antigens.">Activation of Lymphocytes-T by Lectins and Carbohydrate-Oxidizing Reagents Viewed as an Immunological Recognition of Cell-Surface Modifications Seen in the Context of Self Major Histocompatibility Complex Antigens.</a> European Journal of Immunology. 11 (6), 475-483 (1981).</li><li>Miller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Stimulation+of+Human+Lymphocyte-B+and+Lymphocyte-T+by+Various+Lectins.">The Stimulation of Human Lymphocyte-B and Lymphocyte-T by Various Lectins.</a> Immunobiology. 165 (2), 132-146 (1983).</li><li>Vitte, J., Pierres, A., Benoliel, A. M., Bongrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+quantification+of+the+modulation+of+interaction+between+cell-+or+surface-bound+LFA-1+and+ICAM-1.">Direct quantification of the modulation of interaction between cell- or surface-bound LFA-1 and ICAM-1.</a> Journal of Leukocyte Biology. 76 (3), 594-602 (2004).</li><li>Beaussart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+forces+guiding+microbial+cell+adhesion+using+single-cell+force+spectroscopy.">Quantifying the forces guiding microbial cell adhesion using single-cell force spectroscopy.</a> Nature Protocols. 9 (5), 1049-1055 (2014).</li><li>Shu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+Crystal-Mediated+Inflammation+Is+Driven+by+Plasma+Membrane+Destabilization.">Cholesterol Crystal-Mediated Inflammation Is Driven by Plasma Membrane Destabilization.</a> Frontiers in Immunology. 9, (2018).</li><li>Hosseini, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+synapse+formation+determines+interaction+forces+between+T+cells+and+antigen-presenting+cells+measured+by+atomic+force+microscopy.">Immune synapse formation determines interaction forces between T cells and antigen-presenting cells measured by atomic force microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17852-17857 (2009).</li></ol>

Die AFM-basierte Einzelkraftspektroskopie hat sich zu einem leistungsfähigen Werkzeug entwickelt, um die biophysikalischen Eigenschaften lebender Zellen zu adressieren. Für diese Anwendungen muss der Ausleger ordnungsgemäß funktionalisiert werden, um bestimmte Wechselwirkungen oder Eigenschaften auf den von Interesse wichtigen Zellen zu untersuchen. Hier werden die Methoden zur Kopplung einzelner T-Zellen und einzelner Mikron-Großer Perle an den spitzenlosen Ausleger beschrieben. Um eine einzelne T-Zelle am Ausleger...

Atomkraftmikroskopie (AFM), ein vielseitiges Werkzeug, hat viele Anwendungen in der Zellbiologie Forschunggefunden 1,2,3,4,5. Neben der hochauflösenden Bildgebungsfunktion ermöglicht die native Kraft-Probing-Funktion die direkte Untersuchung biophysikalischer Eigenschaften lebender Zellen direkt vor Ort auf der einzelzelligen Ebene6,7. Dazu gehören die Steifigkeiten subzellulärer Strukturen oder sogar ganzer Zellen8,9,10,11,12, spezifische Liganden/Rezeptor-Bindungsstärken an der Einzelmolekülebene auf der Zelloberfläche13, und Haftkräfte zwischen Einzelpaaren von Festen Partikeln und Zellen oder zwischen zwei Zellen1,2,14,15. Die beiden letztgenannten sind oft als einzellige Kraftspektroskopie (SCFS)16kategorisiert. Aufgrund der leicht verfügbaren Ausleger mit unterschiedlicher Federkonstante ist der für AFM zugängliche Kraftbereich von wenigen Piconewtons (pN) bis zu Mikronewtons (N) recht breit, was die gesamte Bandbreite der zellulären Ereignisse mit Kräften von wenigen Dutzenden angemessen abdeckt. pN, wie z. B. rezeptorbasierte Einzelmolekülbindung, an nN, wie z. B. phagozytische zelluläre Ereignisse15. Dieser große dynamische Kraftbereich macht AFM vorteilhaft gegenüber anderen Kraft-Probing-Techniken wie optischer/magnetischer Pinzette und einer Biomembran-Kraftsonde, da sie besser für Schwachkraftmessungen geeignet sind, mit einer Kraft von typischerweise weniger als 200 pN17. , 18. Darüber hinaus kann AFM als hochpräziser Manipulator fungieren, um verschiedene Reize auf einzelne Zellen in einer räumlich definierten Weise zu liefern4,19. Dies ist für die Einzelzellaktivierungsstudien in Echtzeit wünschenswert. In Kombination mit livezelliger Fluoreszenz-Bildgebung kann die nachfolgende zelluläre Reaktion auf den spezifischen Reiz gleichzeitig überwacht werden, wodurch AFM-basiertes SCFS als optische Bildgebung äußerst robust ist und ein praktisches Werkzeug zur Untersuchung der zellulären Signalisierung bietet. Zum Beispiel wurde AFM verwendet, um die Stämme zu bestimmen, die erforderlich sind, um Kalziumtransienten in Osteoblasten zu entlocken20. In dieser Arbeit wurden Kalziumtransienten fluoreszierend durch Kalzium-Ratiometrische Bildgebung nach der Anwendung lokalisierter Kräfte auf kultivierte Osteoblasten mit einer AFM-Spitze verfolgt. Kürzlich wurde AFM eingesetzt, um Kollagenfibrillen zu dehnen, auf denen hepatische Stellatzellen (HSC) angebaut wurden, und diese mechano-transdued HSC-Aktivierung wurde in Echtzeit von einem fluoreszierenden Src-Biosensor überwacht, dessen Phosphorylierung Fluoreszenzintensität des Biosensors korreliert mit HSC-Aktivierung3.
In AFM-basierten SCFS-Experimenten ist die richtige Funktionalisierung von AFM-Auslegern ein wichtiger Schritt zu erfolgreichen Messungen. Da sich unser Forschungsinteresse auf die Aktivierung von Immunzellen konzentriert, funktionalisieren wir routinemäßig Ausleger mit Partikeln wie einzelnen Feststoffpartikeln, die Phagozytose und/oder starke Immunantworten auslösen können4,14 , 15 und einzelne T-Zellen, die eine Immunsynapse mit Antigen-präsentierenden Zellen bilden können, wie aktivierte dendritische Zellen (DC)2. Einzelne Feststoffpartikel werden in der Regel über einen Epoxidkleber in der Luftumgebung an einen Ausleger gekoppelt, während einzelne T-Zellen aufgrund ihrer nicht klebenden Natur über einen biokompatiblen Klebstoff in Lösung zu einem Ausleger funktionalisiert werden. Hier beschreiben wir die Methoden, um diese beiden Arten von Freischwinger-Modifikationen durchzuführen und geben auch zwei zugehörige Anwendungen. Die erste Anwendung besteht darin, T-Zell-/DC-Wechselwirkungen mit AFM-SCFS zu untersuchen, um den Unterdrückungsmechanismus von regulatorischen T-Zellen aus der Sicht der Zellmechanik zu verstehen. Die zweite beinhaltet die Kombination von AFM mit Live-Zell-Fluoreszenz-Bildgebung, um die zelluläre Reaktion von Makrophagen auf ein festes Teilchen in Echtzeit zu überwachen, um den molekularen Mechanismus des rezeptorunabhängigen Phosphatidylinositols 4,5-Bisphosphat (PIP2)- Moesin vermittelte Phagozytose. Ziel dieses Protokolls ist es, interessierten Forschern einen Bezugsrahmen für die Konzeption und Umsetzung ihrer eigenen experimentellen Einstellungen mit AFM-basierter einzelliger Analyse für die immunologische Forschung zu bieten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;l pipette tip</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>104-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm diameter culture dish</td>
			<td>NALGENE nunc</td>
			<td>150462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plate</td>
			<td>JET</td>
			<td>TCP011006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Cantilever</td>
			<td>NanoWorld</td>
			<td>Arrow-TL1-50</td>
			<td>tipless cantilever</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocompatible glue</td>
			<td>BD Cell-Tak</td>
			<td>354240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4+ T cell isolation Cocktail</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>19852C.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC2.4 cell line</td>
			<td>A gift from K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-coated magnetic particles</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>GENEray</td>
			<td>Generay-E1101-500 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>ERGO</td>
			<td>7100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>twbio</td>
			<td>00019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Ex Cell Bio</td>
			<td>FSP500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR blocker</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>local vender (Hai Men Lian Sheng)</td>
			<td>HX-E37</td>
			<td>24mm diameter, 0.17mm thinckness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>JinTong department of laboratory and equipment management, Haimen&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>customized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2 (30%)</td>
			<td>Sino pharm</td>
			<td>10011218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Sino pharm</td>
			<td>80120892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh nylon strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>REF 352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moesin-EGFP</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>cloned in laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD25 Treg cell positive isolation kit</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18782</td>
			<td>Component: FcR Blocker,Regulatory T cell Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD4+ Tcell isolation kit</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>19852</td>
			<td>Component:CD4+T cell isolation Cocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rat Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Lanyi chemical products co., LTD&#65292; Beijing</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1022-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE selection cocktail</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLC&#948;-PH-mCherry</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>36075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microspheres 6.0&#956;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>07312-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polystyrene round bottom tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat serum</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>13551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7</td>
			<td>&#160;ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Interleukin-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>Peprotech, 200-02-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regulatory T cell positive selection cocktail</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18782C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Life</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample chamber</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-coated magnetic particles</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>50001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection kit</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25% EDTA</td>
			<td>Life</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>JD</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective NA 0.8</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>420650-9901</td>
			<td>Plan-Apochromat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force microscope</td>
			<td>JPK</td>
			<td>cellHesion200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>Allegra X-12R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence imaging</td>
			<td>home-made objective-type total internal reflection fluorescence microscop based on a Zeiss microscope stand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HERACELL 150i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Observer A1 manual</td>
			<td></td>
		</tr>
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functionalization of atomic force microscope cantilevers with single-t cells or single-particle for immunological single-cell force spectroscopy

Die auf Atomkraftmikroskopie basierende Einzelkraftspektroskopie (AFM-SCFS) ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung biophysikalischer Eigenschaften lebender Zellen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung von Wechselwirkungsstärken und -dynamiken auf einer lebenden Zellmembran, einschließlich der zwischen Zellen, Rezeptoren und Liganden, und neben vielen anderen Variationen. Es funktioniert auch als Mechanismus, um einen physikalischen oder biochemischen Stimulus auf einzelne Zellen in einer raumzeitlich kontrollierten Weise zu liefern, so dass bestimmte Zellaktivierung und nachfolgende zelluläre Ereignisse in Echtzeit überwacht werden können, in Kombination mit Live-Zell Fluoreszenz-Bildgebung. Der schlüsselfertige Schritt bei diesen AFM-SCFS-Messungen ist die AFM-Auslegerfunktionierung, oder mit anderen Worten, die Anfügung eines Interessenten an den Ausleger. Hier stellen wir Methoden zur Modisierung von AFM-Auslegern mit einer einzelnen T-Zelle bzw. einer einzelnen Polystyrolperle für immunologische Studien vor. Erstere beinhaltet einen biokompatiblen Klebstoff, der einzelne T-Zellen an die Spitze eines flachen Auslegers in einer Lösung koppelt, während letzterer auf einem Epoxidkleber für die Einzelperlenhaftung in der Luftumgebung beruht. Zwei immunologische Anwendungen, die mit jeder Auslegermodifikation verbunden sind, werden ebenfalls bereitgestellt. Die hier beschriebenen Methoden lassen sich leicht an verschiedene Zelltypen und Feststoffpartikel anpassen.

Abbildung 4A zeigt typische Kraft-Distanz-Kurven aus der Bindungsinteraktion zwischen Einzel-T-Zelle und Single-DC in einem Annäherungszyklus. Die hellrote Kurve ist die Verlängerungskurve und die dunkelrote die Rückzugskurve. Da die Verlängerungskurve typischerweise für Einzugoder Steifigkeitsanalysen verwendet wird, betrifft hier nur die Rückzugskurve die Zellhaftung. Der Mindestwert (der grüne Kreis) in der Kurve gibt ein Maß für die maximale Haft...

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Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Wir präsentieren ein Protokoll zur Funktionalisierung von AFM-Auslegern (Atomic Force Microscope) mit einer einzelnen T-Zelle und einem Perlenteilchen für immunologische Studien. Gezeigt werden Verfahren zur Untersuchung der Einzelpaar-T-Zell-dendritischen Zellbindung durch AFM und zur Überwachung der echtzeitzellulären Reaktion von Makrophagen auf ein einzelnes Feststoffteilchen durch AFM mit Fluoreszenzbildgebung.

Funktionalisierung von Atomkraftmikroskop-Auslegern mit Einzel-T-Zellen oder Einzelpartikeln für die immunologische Einzelkraftspektroskopie

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...

Dieses Protokoll beschreibt, wie die AFM-Ausleger am besten mithilfe einzelner T-Zellen und Feststoffpartikel funktionalisiert werden können. Diese Tipps können dann verwendet werden, um ein paar dendritische Zell-T-Zell-Wechselwirkungen zu untersuchen und zelluläre Reaktionen von wankelmütiger Größe zu überwachen. Ein Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie einen biokompatiblen Klebstoff für die Einzel-T-Zell-Funktionalisierung von Auslegern verwendet.Dieser Klebstoff ist inert zu eukaryotischen Zellen, so dass T-Zellen in ihrer Basisaktivierungsphase zu halten. Diese Methoden geben Einblick in die Aktivierung von Immunzellen und komplexe interzelluläre Ereignisse, wie z. B. die Immunsynapsebildung. Die Methoden können auch auf andere Systeme mit Zell-Zell- oder Zell-Oberflächen-Wechselwirkungen ausgedehnt werden.Für jemanden, der neu in dieser Technik ist, ist es wichtig, sicherzustellen, dass die T-Zellen in gutem Zustand vor der Verwendung sind und dass sie mit IL-2 über Nacht vorbehandelt werden. Darüber hinaus, bei der Verwendung der biokompatiblen Klebstoff, schnell bewegen, um es vor unnötiger Oxidation zu schützen. Bereiten Sie die einzelnen T-Zellen für die Mikroskopie vor, indem Sie das Textprotokoll folgen.Dann bereiten Sie Glasabdeckungen mit DC2.4-Zellen gesät, und bebrüten die Zellen über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius und 5%CO2. Reinigen Sie weiche, spitzenlose Ausleger mit einer niedrigen Federkonstante mit Piranha-Behandlung, Plasmareinigung oder UV-Ozonreinigung. Montieren Sie dann den gereinigten Ausleger am AFM-Scankopf.Als nächstes bereiten Sie eine saubere Probenkammer vor und füllen Sie sie mit reinem Wasser. Kalibrieren Sie den Ausleger in der Wasserlösung, indem Sie zunächst eine Kraftkurve auf dem Glassubstrat laufen lassen, um die Empfindlichkeit des Auslegers zu erhalten. Zeichnen Sie dann ein thermisches Geräuschspektrum auf, um die Federkonstante zu extrahieren.Wenn der Ausleger richtig kalibriert ist, entfernen Sie den AFM-Scankopf aus der Lösung. Waschen Sie den montierten Ausleger mit ein paar Tropfen reinem Ethanol und halten Sie den Ausleger trocken auf dem Scankopf. Ein Lebendzellen-Umgebungsgehäuse mit 5% CO2 auf 37 Grad Celsius vorheizen.Dann montieren Sie den mit DC2.4-Zellen gesäten Glasdeckel in die Probenkammerbaugruppe und fügen Sie der Kammer sofort 600 Mikroliter Medium B hinzu. Platzieren Sie die fertige Baugruppe auf der AFM-Beispielstufe. Fügen Sie menschliche IL-2-inkubierte CD4-positive T-Zellen in die Probenkammer ein.Warten Sie, bis die Ziel-T-Zellen vollständig auf der Unterseite des Coverslips abgerechnet sind, und bringen Sie die Zellen dann unter dem Mikroskop in das Sichtfeld. Fügen Sie nun einen zweiMikroliter Tropfen biokompatiblen Kleber mit einer Pipette auf das Ende des montierten Auslegers. Sobald der biokompatible Kleber auf den Ausleger aufgebracht wurde, müssen die nachfolgenden Schritte so schnell wie möglich abgeschlossen werden, um die Haftung zu maximieren.Legen Sie den Scankopf schnell auf die Probenbühne und tauchen Sie den mit Klebstoff beschichteten Ausleger in die Lösung ein. Verschieben Sie die Probephase, bis sich eine Integritätszelle T unter der Spitze des Auslegers befindet. Passen Sie dann ihre Position fein an, indem Sie den Scankopf bewegen.Als nächstes senken Sie den Ausleger manuell. Beginnen Sie mit einer 50-Mikron-Schrittgröße, und verringern Sie dann auf 10, fünf und zwei und schließlich 0,5 Mikrometer allmählich, wie durch die Schärfe des Auslegerbildes angezeigt. Halten Sie nun die Position der Schrittmotoren und passen Sie die Positionierung des Scankopfes an, um die Auslegerspitze und die Zelle besser auszurichten.Fahren Sie fort, bis ein fester Kontakt durch eine kleine Verschiebung der Position des Lasers angezeigt wird, was einer typischen Kraft von 0,5 bis 1,5 Nanonewton entspricht. Nach 30 Sekunden Kontakt den Ausleger zurückziehen. Wenn sich die Zelle mit dem Ausleger bewegt, war die Anlage erfolgreich.Wenn nicht, wiederholen Sie den Haftschritt bis zu dreimal, bevor Sie zu einem neuen Ausleger wechseln. Positionieren Sie die angeschlossene T-Zelle über einer DC2.4-Zelle, indem Sie die Probenstufe und den Scankopf bewegen. Führen Sie nach dem Einrichten der richtigen Parameter die Kraftspektroskopie über die Probe aus.Für eine neue Sondierungsrunde montieren Sie einen neuen, sauberen Ausleger. Kalibrieren Sie es in reinem Wasser, und gehen Sie dann zurück zu einem T-Zell-dendritischen Zellpaar und wiederholen Sie den Scan. Montieren Sie einen gereinigten Glasdeckel an der Probenkammerbaugruppe.Fügen Sie auf der linken Seite des Deckels einen Tropfen einer Ink.-Lösung hinzu, die in Ethanol verdünnt wurde und Polystyrolperlen mit sechs Mikrometern Durchmesser enthält. Sobald das Lösungsmittel verdampft, überprüfen Sie den Abstand der Perlen mit einem Hellfeldmikroskop, das mit einem 20-fachen Objektiv ausgestattet ist. Stellen Sie sicher, dass die einzelnen Perlen gut getrennt sind.Dann tauchen Sie eine Mikropipette-Spitze oder einen Zahnstocher in einen gut gemischten Epoxidkleber und übertragen Sie eine kleine Menge des Klebers an drei separate Stellen mit aufeinanderfolgenden sanften Berührungen auf der rechten Seite, aber in der Nähe der Mitte des Coverslips, wie hier gezeigt. Als nächstes montieren Sie einen gereinigten, spitzenlosen Ausleger am AFM-Scankopf und kalibrieren Sie ihn in Luft mit einer sauberen Oberfläche, um die Federkonstante zu erhalten. Positionieren Sie dann die Auslegerspitze über die linke Grenze des letzten Epoxid-Kleberflecks und bringen Sie den Ausleger langsam in die Nähe des Klebers mit kleinen Schrittgrößen auf den Schrittmotoren.Sobald der Kontakt mit dem Kleber hergestellt wurde, ziehen Sie den Ausleger schnell seitlich, indem Sie den AFM-Scankopf nach hinten bewegen. Entfernen Sie überschüssigen Kleber, indem Sie ihn gegen das Glas reiben, so dass nur eine winzige Menge des Klebers am Ende der Spitze übrig bleibt. Bewegen Sie nun die Auslegerspitze auf eine gut isolierte Perle.Nähern Sie sich der einzelnen Perle langsam, und machen Sie einen festen Kontakt mit ihm im Bereich von zwei bis fünf Nanonewton für etwa 10 Sekunden. Verwenden Sie beim Kontakt die Feinspitzeneinstellung, um die Perle ganz am Ende der Spitze zu positionieren. Ziehen Sie die Spitze am Ende des Kontakts ein.Wenn die Perle von der ursprünglichen Brennebene verschwindet, ist ein erfolgreiches Haftungsereignis aufgetreten. Schließlich den perlenmodifizierten Ausleger sorgfältig abmontieren und in einer Auslegerbox über Nacht aufbewahren, damit das Epoxid vollständig aushärtet. Hier sind typische Kraft-Distanz-Kurven aus der Bindungsinteraktion zwischen einer einzelnen T-Zelle und einer einzelnen dendritischen Zelle im Laufe eines Annäherungs-Rückzugs-Zyklus.Die hellrote Kurve ist die Verlängerungskurve, und die dunkelrote kurve ist die Rückzugskurve. Der Mindestwert in der Kurve gibt ein Maß für die maximale Haftkraft zwischen der T-Zelle und der dendritischen Zelle an, und der Bereich unter der Kurve stellt die Arbeit dar, die erforderlich ist, um sie zu trennen. Die scharfen und stufenweisen Bruchereignisse können als Membranbinden interpretiert werden, die aufgrund der starken Bindung an der Zell-Zell-Schnittstelle von der Zelloberfläche herausgezogen werden und dann diskret unter dem kontinuierlichen Ziehen brechen.Hier wird die konventionelle T-Zellbindung an dendritische Zellen in Grau und die regulatorische T-Zellbindung an dendritische Zellen blau dargestellt. Die Haftkräfte zwischen einer konventionellen T-Zelle und einer regulatorischen T-Zelle erkennen Peptid-Antigene, die von Antigen-präsentierenden Zellen präsentiert werden, während regulatorische T-Zellen Suppressor-T-Zellen sind, die die konventionelle T-Zell-vermittelte Immunität gegen Ende einer Immunreaktion herunterfahren. Dieser Schaltplan einer fluoreszierend beschrifteten, phagozytischen RAW264.7-Zelle zeigt, wie die Zelle mit einem einzigen nackten, sechsMikron-Durchmesser, der Polystyrolperle, angegangen wird.Beim Eingreifen der Perle wird Membran PIP2 an der Kontaktstelle in der Nähe von b sortiert, was dann die Rekrutierung von Moesin durch Membran induziert, was zu einem phagozytischen Ereignis führt. Zusätzlich zu dem hier beschriebenen Verfahren kann die AFM-basierte Einzelkraftspektroskopie zusammen mit Fluoreszenz-Bildgebung verwendet werden, um die Immunzellaktivierung in Echtzeit auf einzelzelliger Ebene zu untersuchen. Kombinierte Fluoreszenztechniken, diese Methode ermöglicht die Adressierung komplexerer zellulärer Prozesse in Echtzeit, wie die Bildung einer Immunsynapse zwischen dendritischen Zellen und T-Zellpaar.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

Erleichterung der Analyse der immunologischen Daten mit Visual analytischen Techniken

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Einzel-Zell-Analyse Bacillus subtilis Biofilme mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Ein Endothelial Planar Zellmodell für Imaging immunologischen Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Kortikalen Aktin Fluss in T-Zellen durch Raum-zeitliche Bildkorrelationsspektroskopie von Structured Illumination Microscopy Daten Quantifizierte

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell des Barrier Menschliches Blut-Hirn

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Induktion der zellulären Differenzierung und Einzelzell - Bildgebung von<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Schwimmer und Swarmer Cells

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Opsonophagocytic Tötung Assay Immunreaktionen gegen bakterielle Krankheitserreger zu bewerten

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Anwendung konsistenter massageähnlicher Störungen an Mauskälbern und Überwachung der daraus resultierenden intramuskulären Druckänderungen

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...