Name: functionalization of atomic force microscope cantilevers with single-t cells or single-particle for immunological single-cell force spectroscopy
Uploaded: 2019-07-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין התוכנית הכללית (31370878), תוכנית מפתח המדינה (31630023) ותוכנית קבוצת מחקר חדשנית (81621002).

פרוטוקול ניסוי העכבר עוקב אחר ההנחיות לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת טסינחואה
1. פונקציונליזציה של זיז עם תאי T בודדים
<ol><li>בתאי הטחול של העכבר הכנה<ol>
<li>להקריב את העכבר (8-16 שבועות של גיל (או סקס); למשל, C57BL/6 זן) באמצעות פחמן דו חמצני, ואחריו פריקה צוואר הרחם.</li>
		<li>לנקות את העכ...

<ol>
	<li>Benoit, M., Gabriel, D., Gerisch, G., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrete+interactions+in+cell+adhesion+measured+by+single-molecule+force+spectroscopy.">Discrete interactions in cell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy.</a> Nature Cell Biology. 2 (6), 313-317 (2000).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+adhesion+by+regulatory+T+cells+induces+dendritic+cell+cytoskeletal+polarization+and+contact-dependent+lethargy.">Strong adhesion by regulatory T cells induces dendritic cell cytoskeletal polarization and contact-dependent lethargy.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 327-338 (2017).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction-modulated+fibrotic+microniches+reveal+the+contribution+of+angiogenesis+in+liver+fibrosis.">Mechanotransduction-modulated fibrotic microniches reveal the contribution of angiogenesis in liver fibrosis.</a> Nature Materials. 16 (12), 1252-1261 (2017).</li><li>Mu, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phosphatidylinositol+4,5-bisphosphate+redistribution-based+sensing+mechanism+initiates+a+phagocytosis+programing.">A phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate redistribution-based sensing mechanism initiates a phagocytosis programing.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Qi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology-targeted+cell+delivery+via+injectable+micro-scaffold+capsule+mediated+by+endogenous+TGase.">Pathology-targeted cell delivery via injectable micro-scaffold capsule mediated by endogenous TGase.</a> Biomaterials. 126, 1-9 (2017).</li><li>Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+probing+surfaces+of+living+cells+to+molecular+resolution.">Force probing surfaces of living cells to molecular resolution.</a> Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).</li><li>Muller, D. J., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy:+a+nanoscopic+window+on+the+cell+surface.">Atomic force microscopy: a nanoscopic window on the cell surface.</a> Trends in Cell Biology. 21 (8), 461-469 (2011).</li><li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth.">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysics Journal. 103 (3), 386-394 (2012).</li><li>Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+probing+of+cell+elasticity.">Atomic force microscopy probing of cell elasticity.</a> Micron. 38 (8), 824-833 (2007).</li><li>Scheuring, S., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy:+probing+the+spatial+organization,+interactions+and+elasticity+of+microbial+cell+envelopes+at+molecular+resolution.">Atomic force microscopy: probing the spatial organization, interactions and elasticity of microbial cell envelopes at molecular resolution.</a> Molecular Microbiology. 75 (6), 1327-1336 (2010).</li><li>Berdyyeva, T. K., Woodworth, C. D., Sokolov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+epithelial+cells+increase+their+rigidity+with+ageing+in+vitro:+direct+measurements.">Human epithelial cells increase their rigidity with ageing in vitro: direct measurements.</a> Physics in Medicine and Biology. 50 (1), 81-92 (2005).</li><li>Sokolov, I., Dokukin, M. E., Guz, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+quantitative+measurements+of+the+elastic+modulus+of+biological+cells+in+AFM+indentation+experiments.">Method for quantitative measurements of the elastic modulus of biological cells in AFM indentation experiments.</a> Methods. 60 (2), 202-213 (2013).</li><li>Bozna, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+strength+and+dynamics+of+invariant+natural+killer+cell+T+cell+receptor/CD1d-glycosphingolipid+interaction+on+living+cells+by+single+molecule+force+spectroscopy.">Binding strength and dynamics of invariant natural killer cell T cell receptor/CD1d-glycosphingolipid interaction on living cells by single molecule force spectroscopy.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 15973-15979 (2011).</li><li>Flach, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alum+interaction+with+dendritic+cell+membrane+lipids+is+essential+for+its+adjuvanticity.">Alum interaction with dendritic cell membrane lipids is essential for its adjuvanticity.</a> Nature Medicine. 17 (4), 479-487 (2011).</li><li>Ng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-independent,+direct+membrane+binding+leads+to+cell-surface+lipid+sorting+and+Syk+kinase+activation+in+dendritic+cells.">Receptor-independent, direct membrane binding leads to cell-surface lipid sorting and Syk kinase activation in dendritic cells.</a> Immunity. 29 (5), 807-818 (2008).</li><li>Helenius, J., Heisenberg, C. P., Gaub, H. E., Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+force+spectroscopy.">Single-cell force spectroscopy.</a> Journal of Cell Science. 121 (11), 1785-1791 (2008).</li><li>Litvinov, R. I., Shuman, H., Bennett, J. S., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+strength+and+activation+state+of+single+fibrinogen-integrin+pairs+on+living+cells.">Binding strength and activation state of single fibrinogen-integrin pairs on living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7426-7431 (2002).</li><li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+Force+Technique+to+Probe+Molecular+Adhesion+and+Structural+Linkages+at+Biological+Interfaces.">Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces.</a> Biophysics Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).</li><li>Lamprecht, C., Hinterdorfer, P., Ebner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+biosensing+atomic+force+microscopy+in+monitoring+drug+and+nanoparticle+delivery.">Applications of biosensing atomic force microscopy in monitoring drug and nanoparticle delivery.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (8), 1237-1253 (2014).</li><li>Charras, G. T., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+mechanotransduction+and+its+modulation+analyzed+by+atomic+force+microscope+indentation.">Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation.</a> Biophysics Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).</li><li>Sun, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+membrane+tethers+probed+by+atomic+force+microscopy.">Multiple membrane tethers probed by atomic force microscopy.</a> Biophysics Journal. 89 (6), 4320-4329 (2005).</li><li>Yan, J. C., Liu, B., Shi, Y., Qi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class+II+MHC-independent+suppressive+adhesion+of+dendritic+cells+by+regulatory+T+cells+in+vivo.">Class II MHC-independent suppressive adhesion of dendritic cells by regulatory T cells in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 319-326 (2017).</li><li>Hao, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C-mediated+hydrolysis+of+PIP2+releases+ERM+proteins+from+lymphocyte+membrane.">Phospholipase C-mediated hydrolysis of PIP2 releases ERM proteins from lymphocyte membrane.</a> Journal of Cell Biology. 184 (3), 451-462 (2009).</li><li>Rodriguez, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte-T+Adhesion+to+Fibronectin+(Fn)+-+a+Possible+Mechanism+for+T-Cell+Accumulation+in+the+Rheumatoid+Joint.">Lymphocyte-T Adhesion to Fibronectin (Fn) - a Possible Mechanism for T-Cell Accumulation in the Rheumatoid Joint.</a> Clinical and Experimental Immunology. 89 (3), 439-445 (1992).</li><li>Kimura, A., Ersson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Lymphocytes-T+by+Lectins+and+Carbohydrate-Oxidizing+Reagents+Viewed+as+an+Immunological+Recognition+of+Cell-Surface+Modifications+Seen+in+the+Context+of+Self+Major+Histocompatibility+Complex+Antigens.">Activation of Lymphocytes-T by Lectins and Carbohydrate-Oxidizing Reagents Viewed as an Immunological Recognition of Cell-Surface Modifications Seen in the Context of Self Major Histocompatibility Complex Antigens.</a> European Journal of Immunology. 11 (6), 475-483 (1981).</li><li>Miller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Stimulation+of+Human+Lymphocyte-B+and+Lymphocyte-T+by+Various+Lectins.">The Stimulation of Human Lymphocyte-B and Lymphocyte-T by Various Lectins.</a> Immunobiology. 165 (2), 132-146 (1983).</li><li>Vitte, J., Pierres, A., Benoliel, A. M., Bongrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+quantification+of+the+modulation+of+interaction+between+cell-+or+surface-bound+LFA-1+and+ICAM-1.">Direct quantification of the modulation of interaction between cell- or surface-bound LFA-1 and ICAM-1.</a> Journal of Leukocyte Biology. 76 (3), 594-602 (2004).</li><li>Beaussart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+forces+guiding+microbial+cell+adhesion+using+single-cell+force+spectroscopy.">Quantifying the forces guiding microbial cell adhesion using single-cell force spectroscopy.</a> Nature Protocols. 9 (5), 1049-1055 (2014).</li><li>Shu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+Crystal-Mediated+Inflammation+Is+Driven+by+Plasma+Membrane+Destabilization.">Cholesterol Crystal-Mediated Inflammation Is Driven by Plasma Membrane Destabilization.</a> Frontiers in Immunology. 9, (2018).</li><li>Hosseini, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+synapse+formation+determines+interaction+forces+between+T+cells+and+antigen-presenting+cells+measured+by+atomic+force+microscopy.">Immune synapse formation determines interaction forces between T cells and antigen-presenting cells measured by atomic force microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17852-17857 (2009).</li></ol>

AFM מבוססי תא בודד ספקטרוסקופיית התפתח להיות כלי רב עוצמה כדי לטפל במאפיינים הביופיסיים של תאים חיים. עבור יישומים אלה, הזיז צריך להיות מתפקד כראוי על מנת לחקור אינטראקציות או מאפיינים ספציפיים על תאי העניין. כאן, השיטות לצימוד תא T יחיד וחרוז מיקרון בגודל יחיד לזיז הפחות-טיפ מתוארים בהתאמה....

מיקרוסקופ כוח אטומי (afm), כלי רב-תכליתי, מצא יישומים רבים במחקר ביולוגיה תא1,2,3,4,5. מלבד יכולת הדימות שלה ברזולוציה גבוהה, התכונה הטבעית בודק כוח מאפשר ביופיזיקלי מאפיינים של תאים חיים להיחקר ישירות באתרו בתא יחיד ברמה6,7. אלה כוללים את מרכיבי הרוח של מבנים subcellular או אפילו תאים שלמים8,9,10,11,12, מסוימים מחייב ליגפני/קולטן החוזקות ב רמת מולקולה בודדת על פני השטח של התא13, וכוחות הדבקה בין זוגות בודדים של חלקיקים מוצקים ותאים או בין שני תאים1,2,14,15. שני האחרונים מסווגים בדרך כלל כספקטרוסקופיית כוח בודד (SCFS)16. בשל מנוף התלויה זמין עם קבוע באביב שונים, טווח הכוח נגיש AFM הוא רחב למדי מכמה piconewtons (pN) כדי מיקרוונטונים (μN), אשר מכסה כראוי את כל מגוון של אירועים סלולריים מעורבים כוחות מכמה עשרות של pN, כגון כריכת מולקולה בודדת מבוססת-קולטן, ל-nN, כגון אירועים סלולריים phagocytic15. זה טווח כוח דינאמי גדול עושה יתרון AFM על טכניקות אחרות כוח לחטט כגון מלקחיים אופטיים/מגנטיים ו biomembrane כוח בדיקה, כפי שהם מתאימים יותר מדידות כוח חלש, עם כוח בדרך כלל פחות מ 200 pN17 , 18. בנוסף, afm יכול לתפקד כמו מניפולטור בדיוק גבוהה כדי לספק גירויים שונים על תאים בודדים באופן מוגדר בצורה מוגדרת4,19. הדבר רצוי עבור לימודי הפעלה בזמן אמת של תא יחיד. בשילוב עם הדמיה לחיות בתאים הפלואורסצנטית, את התגובה התאית הבאה לגירוי מסוים ניתן לנטר בו, ובכך לבצע SCFS מבוססי מאוד חזק כמו דימות אופטי מתן כלי מעשי לחקור איתות סלולרי. למשל, AFM שימש כדי לקבוע את הזנים הדרושים כדי לעורר ארעיות סידן באוסטאואורך20. בעבודה זו, מעבר סידן מסומנים פלואורומטרים באמצעות הדמיה מטימטרי סידן לאחר היישום של כוחות מותאמים לשפות אחרות על האוסטאופיה מתורבת עם טיפ AFM. לאחרונה, afm הועסק מתיחה סיבים קולגן על אשר תאים stellate הכבד (hsc) גדלו ואת זה מכונאי הפעלה hsc ההפעלה היתה בזמן אמת מפוקח על ידי פלורסנט Src ביוסנסור, אשר זירחון כפי שמיוצג על ידי האינטנסיביות הפלואורסצנטית של ביוסנסור מתואם עם hsc הפעלה3.
בניסויי SCFS מבוססי AFM, הפונקציונליזציה הנכונה של מנופים של AFM התלויה הוא צעד מפתח לקראת מדידות מוצלחות. מאז אינטרס המחקר שלנו מתמקד הפעלה של תאים חיסוניים, אנחנו באופן שגרתי מנופים התלויים עם חומר חלקיקי כגון חלקיקים מוצק אחד שיכול להפעיל phagocyציטוזה ו/או תגובות החיסון חזק4,14 , 15 ותאי T בודדים שיכולים ליצור סינפסה החיסונית עם הצגת התאים אנטיגן, כגון תאים דנדריטים המופעל (DC)2. חלקיקים מוצקים בודדים מצמידים בדרך כלל לזיז באמצעות דבק אפוקסי בסביבה האוויר, ואילו תאים T בודדים, בשל האופי שלהם שאינם דבקים, הם פונקציונל באמצעות דבק ביולוגי בפתרון. כאן, אנו מתארים את השיטות לבצע שני סוגים אלה של שינוי זיז ולתת שני יישומים משויכים גם. האפליקציה הראשונה היא לחקור אינטראקציות T cell/DC עם AFM-SCFS כדי להבין את המנגנון המדכא של תאי T הרגולציה מנקודת המבט של מכניקת התא. השני כולל שילוב של AFM עם הדמיה לחיות בתאים פלואורסצנט כדי לפקח על התגובה התאית של מקרופאג כדי חלקיק מוצק בזמן אמת כדי לחשוף את המנגנון המולקולרי של הקולטן פוספולידיליליניום 4, 5-ביספושוונאים (PIP2)- . מוסין מתווכת הפייגוציטוזה מטרת פרוטוקול זה היא לספק מסגרת התייחסות לחוקרים מעוניינים לעצב וליישם הגדרות הניסוי שלהם עם מבוססי AFM ניתוח תא בודד עבור מחקר אימונולוגיים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;l pipette tip</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>104-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm diameter culture dish</td>
			<td>NALGENE nunc</td>
			<td>150462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plate</td>
			<td>JET</td>
			<td>TCP011006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Cantilever</td>
			<td>NanoWorld</td>
			<td>Arrow-TL1-50</td>
			<td>tipless cantilever</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocompatible glue</td>
			<td>BD Cell-Tak</td>
			<td>354240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4+ T cell isolation Cocktail</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>19852C.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC2.4 cell line</td>
			<td>A gift from K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-coated magnetic particles</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>GENEray</td>
			<td>Generay-E1101-500 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>ERGO</td>
			<td>7100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>twbio</td>
			<td>00019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Ex Cell Bio</td>
			<td>FSP500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR blocker</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>local vender (Hai Men Lian Sheng)</td>
			<td>HX-E37</td>
			<td>24mm diameter, 0.17mm thinckness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>JinTong department of laboratory and equipment management, Haimen&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>customized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2 (30%)</td>
			<td>Sino pharm</td>
			<td>10011218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Sino pharm</td>
			<td>80120892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh nylon strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>REF 352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moesin-EGFP</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>cloned in laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD25 Treg cell positive isolation kit</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18782</td>
			<td>Component: FcR Blocker,Regulatory T cell Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD4+ Tcell isolation kit</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>19852</td>
			<td>Component:CD4+T cell isolation Cocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rat Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Lanyi chemical products co., LTD&#65292; Beijing</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1022-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE selection cocktail</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLC&#948;-PH-mCherry</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>36075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microspheres 6.0&#956;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>07312-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polystyrene round bottom tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat serum</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>13551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7</td>
			<td>&#160;ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Interleukin-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>Peprotech, 200-02-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regulatory T cell positive selection cocktail</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18782C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Life</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample chamber</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-coated magnetic particles</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>50001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection kit</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25% EDTA</td>
			<td>Life</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>JD</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective NA 0.8</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>420650-9901</td>
			<td>Plan-Apochromat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force microscope</td>
			<td>JPK</td>
			<td>cellHesion200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>Allegra X-12R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence imaging</td>
			<td>home-made objective-type total internal reflection fluorescence microscop based on a Zeiss microscope stand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HERACELL 150i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Observer A1 manual</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functionalization of atomic force microscope cantilevers with single-t cells or single-particle for immunological single-cell force spectroscopy

מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM-SCFS) הוא כלי רב עוצמה ללימוד תכונות ביופיזיקלי של תאים חיים. טכניקה זו מאפשרת הידברות בדיקה ודינמיקה על קרום התא חי, כולל אלה בין תאים, קולטן וליגטים, לצד וריאציות רבות אחרות. זה גם עובד כמנגנון לספק גירוי פיסי או ביוכימיים על תאים בודדים בצורה מבוקרת spatioזמניות, ובכך לאפשר הפעלה תא ספציפית ואירועים סלולריים הבאים להיות מנוטרים בזמן אמת בשילוב עם לחיות תא הדמיה פלואורסצנטית. הצעד העיקרי במידות ה-AFM-SCFS הוא הפונקציונליזציה של ה-AFM-זיז, או במילים אחרות, ומצרף נושא מעניין לזיז. כאן, אנו מציגים שיטות כדי לשנות את מנוף AFM עם תא T אחד ו פוליסטירן בודד חרוז בהתאמה למחקרים אימונולוגיים. הראשון כרוך דבק ביולוגי תואם זוגות תאים T יחיד לקצה של זיז שטוח בפתרון, בעוד האחרון מסתמך על דבק אפוקסי על הדבקה אחת חרוז בסביבה האוויר. שני יישומים אימונולוגיים הקשורים לכל שינוי שלוחה מסופקים גם כן. השיטות המתוארות כאן יכולות להתאים בקלות לסוגי תאים שונים ולחלקיקים מוצקים.

איור 4A מציג עקומות מרחק כוח אופייני מתוך האינטראקציה הbinding בין תא בודד-T לבין SINGLE-DC במחזור אחד של מחזור גישה. העקומה האדומה הקלה היא עקומת ההרחבה והאדום הכהה הוא עקומת הנסיגה. כיוון שעקומת ההארכה משמשת בדרך כלל לכניסות או לניתוחי קשיחות, כאן רק עקומת הנסיגה...

Watch this Scientific Journal Video about Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy at JoVE.com

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

אנו מציגים פרוטוקול לפונקציונליזציה של מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) התלויה מנופים עם תא T יחיד וחלקיק חרוז למחקרים אימונולוגיים. הליכים לחקור בודד זוג תא תא דנדריטי כריכה על ידי AFM ולפקח על התגובה התאית בזמן אמת של מקרופאגים לחלקיק אחיד אחד על ידי AFM עם הדמיה פלואורסצנטית מוצגים.

הפונקציונליזציה של מיקרוסקופ כוח אטומי מנופים עם תאים חד-טי או חלקיק יחיד לספקטרוסקופיית של כוח בודד אימונולוגיים

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...

פרוטוקול זה מתאר את הדרך הטובה ביותר לתפקד על-ידי ה- AFM באמצעות תאי T בודדים וחלקיקים מוצקים. לאחר מכן ניתן להשתמש בטיפים אלה כדי לחקור אינטראקציות תא-T דנדריטיות של זוג יחיד ולנטר תגובות תאיות בגודל הפכפך, בהתאמה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת דבק תואם ביולוגית עבור פונקציונליזציה תא T יחיד של cantilevers.דבק זה אינו פעיל לתאים אוקריוטיים, ובכך שומר על תאי T בשלב ההפעלה הבסיסי שלהם. שיטות אלה מספקות תובנה על הפעלת תאים חיסוניים ואירועים בין תאיים מורכבים, כגון היווצרות סינפסה חיסונית. ניתן גם להאריך את השיטות למערכות אחרות המערבות אינטראקציות בין תאים לתאים או פני תאים.עבור מישהו חדש בטכניקה זו, חשוב לוודא כי תאי T נמצאים במצב טוב לפני השימוש, כי הם מטופלים מראש עם IL-2 לילה. בנוסף, בעת שימוש בדבק biocompatible, לנוע במהירות כדי להגן עליו מפני חמצון מיותר. כדי להתחיל בהליך זה, הכן את תאי ה- T הבודדים למיקרוסקופיה על-ידי ביצוע פעולה זו בפרוטוקול הטקסט.לאחר מכן, הכינו כיסויי זכוכית עם תאי DC2.4, והדגירה את התאים בן לילה בתא לח ב-37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2. יש לנקות את ה- cantilevers רכים וחסרי קצה עם קבוע קפיץ נמוך באמצעות טיפול פיראנה, ניקוי פלזמה או ניקוי UV-ozone. לאחר מכן, הר את ה- cantilever הנקי לראש הסריקה של AFM.לאחר מכן, הכינו תא דגימה נקי, ומלאו אותו במים טהורים. כייל את ה- cantilever בתסיכת המים על ידי הפעלת עקומת כוח על מצע הזכוכית כדי לקבל את הרגישות של cantilever. לאחר מכן, להקליט ספקטרום רעש תרמי כדי לחלץ את קבוע האביב.כאשר ה- cantilever מכויל כראוי, הסר את ראש הסריקה של AFM מהפתרון. לשטוף את cantilever רכוב עם כמה טיפות של אתנול טהור, ולשמור את cantilever יבש על ראש הסריקה. מחממים מארז סביבת תאים חיים ל-37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2.לאחר מכן, הר את כיסוי הזכוכית עם תאי DC2.4 למכלול התא לדוגמה, ומיד להוסיף 600 microliters של בינוני B לתא. מקם את ההרכבה שהושלמה על שלב הדגימה של AFM. הוסף תאי CD4 חיוביים דמויי IL-2 לתאי T חיוביים לתא הדגימה.המתן עד שתאי T של הפילוח ייוחסו במלואם בתחתית הכיסוי ולאחר מכן הבא את התאים לשדה התצוגה מתחת למיקרוסקופ. עכשיו, תוסיף טיפה של שני מיקרוליטר של דבק תואם ביולוגית לקצה התבלין הרכוב עם פיפטה. לאחר הדבק biocompatible הוחל על cantilever, השלבים הבאים צריכים להסתיים בהקדם האפשרי על מנת למקסם את ההידבקות.מניחים במהירות את ראש הסריקה על במת הדגימה, טובלים את ה-cantilever מצופה הדבק בתסרון. הזז את שלב הדגימה עד שתא T בריאותי ימוקם מתחת לקצה ה- cantilever. לאחר מכן, התאם גם את מיקומו על-ידי הזזת ראש הסריקה.לאחר מכן, הורידו את ה-cantilever ידנית. התחל עם גודל צעד 50 מיקרון, ולאחר מכן להקטין ל 10, חמש, ושניים ולבסוף 0.5 מיקרון בהדרגה, כפי שצוין על ידי החדות של התמונה cantilever. עכשיו, להחזיק את המיקום של מנועי צעד, ולהתאים את המיקום של ראש הסריקה כדי ליישר טוב יותר את קצה cantilever ואת התא.המשך עד מגע המשרד מסומן על ידי תזוזה קטנה של המיקום של הלייזר, המתאים כוח טיפוסי של 0.5 כדי 1.5 nanonewtons. לאחר 30 שניות של מגע, לסגת cantilever. אם התא זז עם ה- cantilever, הקובץ המצורף הצליח.אם לא, חזור על צעד ההיתוך עד שלוש פעמים לפני המעבר ל- cantilever חדש. מקם את תא ה- T המחובר מעל תא DC2.4 על-ידי הזזת שלב הדגימה וראש הסריקה. לאחר הגדרת פרמטרים מתאימים, הפעל ספקטרוסקופיית כוח מעל המדגם.לסיבוב חדש של בירור, הר cantilever חדש, נקי. כייל אותו במים טהורים, ולאחר מכן חזור לצמד תאים דנדריטיים של תאי T וחזור על הסריקה. הר כיסוי זכוכית ניקה למכלול התא לדוגמה.בצד שמאל של הכיסוי, מוסיפים טיפה של תותב חרוזים כי כבר מדולל באתנול ומכיל 6 מיקרון קוטר גם גם פוליסטירן. לאחר הממס מתאדה, לבדוק את המרווח של חרוזים באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר מצויד מטרה 20x. ודא כי חרוזים בודדים מופרדים היטב.לאחר מכן, טובלים טיפ מיקרופיפטי או קיסם בדבק אפוקסי מעורב היטב, ומעבירים כמות קטנה של הדבק לשלוש נקודות נפרדות עם נגיעות עדינות רצופות בצד ימין אך קרוב למרכז העטיפה, כפי שמוצג כאן. לאחר מכן, הרם מנקה, cantilever חסר קצה לראש סריקת AFM, וכייל אותו באוויר עם משטח נקי כדי לקבל את קבוע האביב. לאחר מכן, למקם את קצה cantilever מעל הגבול השמאלי של נקודת דבק אפוקסי האחרון, ולאט לאט להביא את cantilever קרוב הדבק באמצעות גדלי צעד קטנים על מנועי צעד.לאחר מגע נעשה עם הדבק, במהירות למשוך את cantilever באופן צדדי על ידי הזזת ראש סריקת AFM לאחור. הסר כל דבק עודף על ידי שפשוף אותו על הזכוכית, משאיר רק כמות זעירה של הדבק ממש בקצה הקצה. עכשיו, תזיז את קצה הזיזים על גבי חרוז מבודד היטב.לגשת חרוז יחיד לאט, ותיצור קשר איתם במגע איתם בטווח של שניים עד חמישה nanonewtons במשך כ 10 שניות. בעת יצירת מגע, השתמשו בהתאמות עדין כדי למקם את חרוז בקצה הקצה. חזור בך מהטיפ בסוף איש הקשר.אם חרוז נעלם ממישור המוקד המקורי, אירוע הידבקות מוצלח התרחש. לבסוף, דרגו את ה-cantilever שעבר שינוי חרוזים בזהירות, ואחסנו אותו בקופסת קנטיליוור בן לילה כדי שהאפוקסי ירפא במלואו. להלן עקומות טיפוסיות במרחק כוח מהאינטראקציה המחייבת בין תא T יחיד לתא דנדריטי יחיד במהלך מחזור נסיגה אחד.העקומה האדומה הקלה היא עקומת ההרחבה, והעיקול האדום הכהה הוא עקומת הנסיגה. הערך המינימלי בעקומה נותן מידה של כוח ההיתוך המרבי בין תא T לתא דנדריטי, ואת האזור מתחת לעקומה מייצג את העבודה הנדרשת כדי להפריד ביניהם. ניתן לפרש את אירועי הקרע החדים והצעדיים כטייסים של קרום שנשלפים מפני השטח של התא בשל הכריכה החזקה בממשק התא-תא ולאחר מכן שבירה דיסקרטית תחת משיכה רציפה.כאן, איגוד תא T קונבנציונלי לתאים דנדריטיים מוצג באפור, ו איגוד תאי T רגולטורי לתאים דנדריטיים מוצג בכחול. כוחות ההיתוך בין תא T קונבנציונלי לתא T רגולטורי מזהים אנטיגנים פפטיד שהוצגו על ידי תאים מציגי אנטיגן, ואילו תאי T רגולטוריים הם תאי T מדכאים כי לסגור חסינות תאי T קונבנציונליים לקראת סוף התגובה החיסונית. סכמטי זה של תא phagocytic RAW264.7 המסוקרן באופן פלואורסצנטי מראה את התא מתקרב עם עירום אחד, קוטר שישה מיקרון, חרוז פוליסטירן.עם עיסוק חרוז, ממברנה PIP2 ממוין באתר הקשר, ליד b, אשר לאחר מכן גורם גיוס קרום של moesin, וכתוצאה מכך אירוע phagocytic. בנוסף להליך המתואר כאן, ספקטרוסקופיית כוח חד-תאי מבוסס AFM יכולה לשמש יחד עם הדמיה פלואורסצנטית כדי לחקור את הפעלת התא החיסוני בזמן אמת ברמת התא הבודד. בשילוב טכניקות פלואורסצנטיות, שיטה זו מאפשרת טיפול בתהליכים תאיים מורכבים יותר בזמן אמת, כגון היווצרות סינפסה חיסונית בין תאים דנדריטיים לבין זוג תאי T.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

להקל על ניתוח נתונים החיסוני עם טכניקות Analytic חזותית

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

מתא בודד ניתוח בצילוס subtilis Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימה

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

דגם תא האנדותל מישורי הדמיה החיסוני סינפסה Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

קליפת המוח אקטין זרימה בתאי T לכמת ידי מתאם תמונת ספקטרוסקופיה מרחב ובזמן של תאורה מיקרוסקופית נתונים מובנים

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

אינדוקציה של דיפרנציאציה נייד תא הדמיה אחת של<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; שחיין ותאי נחיל

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Opsonophagocytic הריגה הנועד להעריך תגובות אימונולוגי נגד פתוגנים חיידקיים

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

יישום של רטבאליות העיסוי העקבי של העכבר וניטור השינויים הנובעים בלחץ שרירי

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...