Name: functionalization of atomic force microscope cantilevers with single-t cells or single-particle for immunological single-cell force spectroscopy
Uploaded: 2019-07-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy at JoVE.com

이 작품은 중국 일반 프로그램의 국립 자연 과학 재단 (31370878), 국가 키 프로그램 (31630023) 및 혁신적인 연구 그룹 프로그램 (81621002)에 의해 지원됩니다.

마우스 실험 프로토콜은 칭화대학의 동물 관리 지침을 따릅니다.
1. 단일 T 셀로 캔틸레버 기능화
<ol><li>마우스 비장 세포 준비<ol>
<li>마우스를 희생 (나이의 8-16 주 (어느 섹스); 예를 들어, C57BL/6 변형) 이산화탄소를 사용 하 여, 자궁 경 부 탈구 다음.</li>
		<li>75% 에탄올로 마우스를 청소하고 비장 절제술 에 이어 중간 선 피부 절개를합니다.</li>
		<li>유리 슬라이드를 사용하여 ...

<ol>
	<li>Benoit, M., Gabriel, D., Gerisch, G., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrete+interactions+in+cell+adhesion+measured+by+single-molecule+force+spectroscopy.">Discrete interactions in cell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy.</a> Nature Cell Biology. 2 (6), 313-317 (2000).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+adhesion+by+regulatory+T+cells+induces+dendritic+cell+cytoskeletal+polarization+and+contact-dependent+lethargy.">Strong adhesion by regulatory T cells induces dendritic cell cytoskeletal polarization and contact-dependent lethargy.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 327-338 (2017).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction-modulated+fibrotic+microniches+reveal+the+contribution+of+angiogenesis+in+liver+fibrosis.">Mechanotransduction-modulated fibrotic microniches reveal the contribution of angiogenesis in liver fibrosis.</a> Nature Materials. 16 (12), 1252-1261 (2017).</li><li>Mu, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phosphatidylinositol+4,5-bisphosphate+redistribution-based+sensing+mechanism+initiates+a+phagocytosis+programing.">A phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate redistribution-based sensing mechanism initiates a phagocytosis programing.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Qi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology-targeted+cell+delivery+via+injectable+micro-scaffold+capsule+mediated+by+endogenous+TGase.">Pathology-targeted cell delivery via injectable micro-scaffold capsule mediated by endogenous TGase.</a> Biomaterials. 126, 1-9 (2017).</li><li>Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+probing+surfaces+of+living+cells+to+molecular+resolution.">Force probing surfaces of living cells to molecular resolution.</a> Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).</li><li>Muller, D. J., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy:+a+nanoscopic+window+on+the+cell+surface.">Atomic force microscopy: a nanoscopic window on the cell surface.</a> Trends in Cell Biology. 21 (8), 461-469 (2011).</li><li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth.">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysics Journal. 103 (3), 386-394 (2012).</li><li>Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+probing+of+cell+elasticity.">Atomic force microscopy probing of cell elasticity.</a> Micron. 38 (8), 824-833 (2007).</li><li>Scheuring, S., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy:+probing+the+spatial+organization,+interactions+and+elasticity+of+microbial+cell+envelopes+at+molecular+resolution.">Atomic force microscopy: probing the spatial organization, interactions and elasticity of microbial cell envelopes at molecular resolution.</a> Molecular Microbiology. 75 (6), 1327-1336 (2010).</li><li>Berdyyeva, T. K., Woodworth, C. D., Sokolov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+epithelial+cells+increase+their+rigidity+with+ageing+in+vitro:+direct+measurements.">Human epithelial cells increase their rigidity with ageing in vitro: direct measurements.</a> Physics in Medicine and Biology. 50 (1), 81-92 (2005).</li><li>Sokolov, I., Dokukin, M. E., Guz, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+quantitative+measurements+of+the+elastic+modulus+of+biological+cells+in+AFM+indentation+experiments.">Method for quantitative measurements of the elastic modulus of biological cells in AFM indentation experiments.</a> Methods. 60 (2), 202-213 (2013).</li><li>Bozna, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+strength+and+dynamics+of+invariant+natural+killer+cell+T+cell+receptor/CD1d-glycosphingolipid+interaction+on+living+cells+by+single+molecule+force+spectroscopy.">Binding strength and dynamics of invariant natural killer cell T cell receptor/CD1d-glycosphingolipid interaction on living cells by single molecule force spectroscopy.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 15973-15979 (2011).</li><li>Flach, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alum+interaction+with+dendritic+cell+membrane+lipids+is+essential+for+its+adjuvanticity.">Alum interaction with dendritic cell membrane lipids is essential for its adjuvanticity.</a> Nature Medicine. 17 (4), 479-487 (2011).</li><li>Ng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-independent,+direct+membrane+binding+leads+to+cell-surface+lipid+sorting+and+Syk+kinase+activation+in+dendritic+cells.">Receptor-independent, direct membrane binding leads to cell-surface lipid sorting and Syk kinase activation in dendritic cells.</a> Immunity. 29 (5), 807-818 (2008).</li><li>Helenius, J., Heisenberg, C. P., Gaub, H. E., Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+force+spectroscopy.">Single-cell force spectroscopy.</a> Journal of Cell Science. 121 (11), 1785-1791 (2008).</li><li>Litvinov, R. I., Shuman, H., Bennett, J. S., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+strength+and+activation+state+of+single+fibrinogen-integrin+pairs+on+living+cells.">Binding strength and activation state of single fibrinogen-integrin pairs on living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7426-7431 (2002).</li><li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+Force+Technique+to+Probe+Molecular+Adhesion+and+Structural+Linkages+at+Biological+Interfaces.">Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces.</a> Biophysics Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).</li><li>Lamprecht, C., Hinterdorfer, P., Ebner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+biosensing+atomic+force+microscopy+in+monitoring+drug+and+nanoparticle+delivery.">Applications of biosensing atomic force microscopy in monitoring drug and nanoparticle delivery.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (8), 1237-1253 (2014).</li><li>Charras, G. T., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+mechanotransduction+and+its+modulation+analyzed+by+atomic+force+microscope+indentation.">Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation.</a> Biophysics Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).</li><li>Sun, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+membrane+tethers+probed+by+atomic+force+microscopy.">Multiple membrane tethers probed by atomic force microscopy.</a> Biophysics Journal. 89 (6), 4320-4329 (2005).</li><li>Yan, J. C., Liu, B., Shi, Y., Qi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class+II+MHC-independent+suppressive+adhesion+of+dendritic+cells+by+regulatory+T+cells+in+vivo.">Class II MHC-independent suppressive adhesion of dendritic cells by regulatory T cells in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 319-326 (2017).</li><li>Hao, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C-mediated+hydrolysis+of+PIP2+releases+ERM+proteins+from+lymphocyte+membrane.">Phospholipase C-mediated hydrolysis of PIP2 releases ERM proteins from lymphocyte membrane.</a> Journal of Cell Biology. 184 (3), 451-462 (2009).</li><li>Rodriguez, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte-T+Adhesion+to+Fibronectin+(Fn)+-+a+Possible+Mechanism+for+T-Cell+Accumulation+in+the+Rheumatoid+Joint.">Lymphocyte-T Adhesion to Fibronectin (Fn) - a Possible Mechanism for T-Cell Accumulation in the Rheumatoid Joint.</a> Clinical and Experimental Immunology. 89 (3), 439-445 (1992).</li><li>Kimura, A., Ersson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Lymphocytes-T+by+Lectins+and+Carbohydrate-Oxidizing+Reagents+Viewed+as+an+Immunological+Recognition+of+Cell-Surface+Modifications+Seen+in+the+Context+of+Self+Major+Histocompatibility+Complex+Antigens.">Activation of Lymphocytes-T by Lectins and Carbohydrate-Oxidizing Reagents Viewed as an Immunological Recognition of Cell-Surface Modifications Seen in the Context of Self Major Histocompatibility Complex Antigens.</a> European Journal of Immunology. 11 (6), 475-483 (1981).</li><li>Miller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Stimulation+of+Human+Lymphocyte-B+and+Lymphocyte-T+by+Various+Lectins.">The Stimulation of Human Lymphocyte-B and Lymphocyte-T by Various Lectins.</a> Immunobiology. 165 (2), 132-146 (1983).</li><li>Vitte, J., Pierres, A., Benoliel, A. M., Bongrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+quantification+of+the+modulation+of+interaction+between+cell-+or+surface-bound+LFA-1+and+ICAM-1.">Direct quantification of the modulation of interaction between cell- or surface-bound LFA-1 and ICAM-1.</a> Journal of Leukocyte Biology. 76 (3), 594-602 (2004).</li><li>Beaussart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+forces+guiding+microbial+cell+adhesion+using+single-cell+force+spectroscopy.">Quantifying the forces guiding microbial cell adhesion using single-cell force spectroscopy.</a> Nature Protocols. 9 (5), 1049-1055 (2014).</li><li>Shu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+Crystal-Mediated+Inflammation+Is+Driven+by+Plasma+Membrane+Destabilization.">Cholesterol Crystal-Mediated Inflammation Is Driven by Plasma Membrane Destabilization.</a> Frontiers in Immunology. 9, (2018).</li><li>Hosseini, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+synapse+formation+determines+interaction+forces+between+T+cells+and+antigen-presenting+cells+measured+by+atomic+force+microscopy.">Immune synapse formation determines interaction forces between T cells and antigen-presenting cells measured by atomic force microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17852-17857 (2009).</li></ol>

AFM 기반 단세포 힘 분광법은 살아있는 세포의 생물물리학적 특성을 해결하는 강력한 도구로 발전했습니다. 이러한 응용 프로그램의 경우, 캔틸레버는 관심 있는 세포에 대한 특정 상호 작용 또는 특성을 조사하기 위해 제대로 기능화되어야 합니다. 여기서, 단일 T 세포와 단일 미크로넨 크기의 비드를 팁리스 캔틸레버에 결합하는 방법이 각각 기재되어 있다. 단일 T 세포를 캔틸레버에 부착하기 ?...

원자력 현미경 검사법 (AFM), 다재 다능한 도구는세포 생물학 연구 1, 2,3,4,5에서많은 응용 프로그램을 발견했습니다. 고해상도 이미징 기능 외에도, 네이티브 포스 프로빙 기능은 살아있는 세포의 생물 물리학적 특성을 단일 세포 수준6,7에서현장에서 직접 조사 할 수 있게합니다. 이들은 세포내 세포 구조 또는 전체 세포 8,9,10,11,12,특정 리간드/수용체 결합 강도의 강성을 포함합니다. 세포 표면(13)에대한 단일 분자 수준, 고체 입자와 세포의 단일 쌍 또는 두 세포 사이 또는 1,2,14,15사이의 접착력. 후자의 두 가지는 종종 단세포 힘 분광법 (SCFS)16으로분류됩니다. 다양한 스프링 상수와 쉽게 사용할 수있는 캔틸레버로 인해 AFM에 액세스 할 수있는 힘 범위는 몇 피코 뉴턴 (pN)에서 마이크로 뉴턴 (μN)까지 다소 광범위하며, 이는 수십 개의 힘을 포함하는 세포 이벤트의 전체 범위를 적절하게 커버합니다. pN의, 예컨대 수용체 계 단일 분자 결합, nN, 예컨대 식세포이벤트(15). 이 큰 동적 힘 범위는 AFM을 광학/자기 핀셋 및 생체 막 힘 프로브와 같은 다른 힘 프로빙 기술에 비해 유리하게 만들며, 일반적으로 200 pN17 미만의 힘으로 약한 힘 측정에 더 적합합니다. , 18. 또한, AFM은 spatiotempoy 정의 된 방식으로 단일 세포에 다양한 자극을 전달하는 고정밀 조작기로서 기능 할 수있다4,19. 이는 실시간 단세포 활성화 연구에 바람직하다. 살아있는 세포 형광 화상 진찰과 결합된, 특정 자극에 대한 후속 세포 반응은 동시에 감시될 수 있습니다, 따라서 AFM 기지를 둔 SCFS는 세포 신호를 탐사하는 실용적인 공구를 제공하는 광학 화상 진찰로 대단히 견고하게 만듭니다. 예를 들면, AFM은 조골 세포20에있는 칼슘 과도를 이끌어 내는 것을 요구되는 긴장을 결정하기 위하여 이용되었습니다. 이 작품에서, 칼슘 과도는 AFM 팁으로 배양 된 조골 세포에 국한 된 힘을 적용 한 후 칼슘 비율 측정 이미징을 통해 형광으로 추적되었습니다. 최근, AFM은 간 성세포(HSC)가 성장한 콜라겐 섬유를 스트레칭하는 데 사용되었으며, 이러한 메카노-트랜스듀싱 HSC 활성화는 형광 Src 바이오센서에 의해 실시간 모니터링되었으며, 그 인산화는 바이오 센서의 형광 강도는 HSC 활성화3과상관관계가 있습니다.
AFM 기반 SCFS 실험에서 AFM 캔틸레버의 적절한 기능화는 성공적인 측정을 향한 핵심 단계입니다. 우리의 연구 관심은 면역 세포 활성화에 초점을 맞추고 있기 때문에, 우리는 일상적으로 식세포증 및 / 또는 강한 면역 반응을 유발할 수있는단일 고체 입자와 같은 미립자 물질로 캔틸레버를 기능화4,14 , 15 및 활성 수지상 세포(DC)와 같은 항원 제시 세포로 면역 시냅스를형성할 수 있는 단일 T 세포 2. 단일 고체 입자는 일반적으로 공기 환경에서 에폭시 접착제를 통해 캔틸레버에 결합되는 반면, 단일 T 세포는 비 접착 성질로 인해 용액의 생체 적합성 접착제를 통해 캔틸레버로 기능화됩니다. 여기서는 이러한 두 가지 유형의 캔틸레버 수정을 수행하고 두 개의 관련 응용 프로그램을 제공하는 방법에 대해 설명합니다. 첫번째 응용은 세포 역학 관점에서 규정하는 T 세포의 억제 기계장치를 이해하기 위하여 AFM-SCFS를 가진 T 세포/DC 상호 작용을 탐구하는 것입니다. 두 번째는 수용체 독립적 인 포스 파티딜리노시톨 4,5-비스포스페이트 (PIP2)의 분자 메커니즘을 밝히기 위해 실시간으로 고체 입자에 대한 대식세포의 세포 반응을 모니터링하기 위해 살아있는 세포 형광 이미징과 AFM을 결합하는 것을 포함합니다. 모에신은 식세포증을 매개했다. 이 프로토콜의 목적은 면역 학적 연구를위한 AFM 기반 단일 세포 분석을 통해 자신의 실험 설정을 설계하고 구현하기 위해 관심있는 연구자들이 참조 프레임 워크를 제공하는 것입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;l pipette tip</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>104-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm diameter culture dish</td>
			<td>NALGENE nunc</td>
			<td>150462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plate</td>
			<td>JET</td>
			<td>TCP011006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Cantilever</td>
			<td>NanoWorld</td>
			<td>Arrow-TL1-50</td>
			<td>tipless cantilever</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocompatible glue</td>
			<td>BD Cell-Tak</td>
			<td>354240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4+ T cell isolation Cocktail</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>19852C.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC2.4 cell line</td>
			<td>A gift from K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-coated magnetic particles</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>GENEray</td>
			<td>Generay-E1101-500 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>ERGO</td>
			<td>7100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>twbio</td>
			<td>00019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Ex Cell Bio</td>
			<td>FSP500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR blocker</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>local vender (Hai Men Lian Sheng)</td>
			<td>HX-E37</td>
			<td>24mm diameter, 0.17mm thinckness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>JinTong department of laboratory and equipment management, Haimen&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>customized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2 (30%)</td>
			<td>Sino pharm</td>
			<td>10011218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Sino pharm</td>
			<td>80120892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh nylon strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>REF 352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moesin-EGFP</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>cloned in laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD25 Treg cell positive isolation kit</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18782</td>
			<td>Component: FcR Blocker,Regulatory T cell Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD4+ Tcell isolation kit</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>19852</td>
			<td>Component:CD4+T cell isolation Cocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rat Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Lanyi chemical products co., LTD&#65292; Beijing</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1022-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE selection cocktail</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLC&#948;-PH-mCherry</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>36075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microspheres 6.0&#956;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>07312-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polystyrene round bottom tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat serum</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>13551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7</td>
			<td>&#160;ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Interleukin-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>Peprotech, 200-02-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regulatory T cell positive selection cocktail</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18782C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Life</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample chamber</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-coated magnetic particles</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>50001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection kit</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25% EDTA</td>
			<td>Life</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>JD</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective NA 0.8</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>420650-9901</td>
			<td>Plan-Apochromat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force microscope</td>
			<td>JPK</td>
			<td>cellHesion200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>Allegra X-12R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence imaging</td>
			<td>home-made objective-type total internal reflection fluorescence microscop based on a Zeiss microscope stand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HERACELL 150i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Observer A1 manual</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functionalization of atomic force microscope cantilevers with single-t cells or single-particle for immunological single-cell force spectroscopy

원자력 현미경 검사법 기반 단일 세포 힘 분광법 (AFM-SCFS)은 살아있는 세포의 생물 물리학적 특성을 연구하기위한 강력한 도구입니다. 이 기술은 세포, 수용체 및 리간드 사이, 그리고 많은 그밖 변이와 더불어 그(것)들을 포함하여 살아있는 세포막에 상호 작용 힘 그리고 역학을 탐구하는 것을 허용합니다. 그것은 또한 spatiotemporally 통제된 방식으로 단 하나 세포에 물리적 또는 생화확적인 자극을 전달하는 기계장치로 작동합니다, 따라서 살아있는 세포와 결합될 때 특정 세포 활성화 및 후속 세포 사건을 실시간으로 감시될 수 있게 합니다 형광 이미징. 이러한 AFM-SCFS 측정의 핵심 단계는 AFM-캔틸레버 기능화 또는 즉, 관심 있는 주제를 캔틸레버에 부착하는 것입니다. 여기에서, 우리는 면역학 연구를 위한 단 하나 T 세포 및 단 하나 폴리스티렌 비드를 각각 가진 AFM 캔틸레버를 수정하는 방법을 제시합니다. 전자는 단일 T 세포를 용액의 평평한 캔틸레버 끝에 결합하는 생체 적합성 접착제를 포함하고, 후자는 공기 환경에서 단일 비드 접착을 위해 에폭시 접착제에 의존합니다. 각 캔틸레버 수정과 관련된 두 가지 면역 학적 응용 분야도 제공됩니다. 여기서 설명한 방법은 다양한 세포 유형 및 고체 입자에 쉽게 적응할 수 있습니다.

그림 4A는 단일 T 셀과 단일 DC 간의 결합 상호 작용으로부터의 일반적인 힘 거리 곡선을 하나의 접근-리트랙트 사이클에서 보여줍니다. 연한 빨간색 곡선은 확장 곡선이고 진한 빨간색 곡선은 후퇴 곡선입니다. 확장 곡선은 일반적으로 들여쓰기 또는 강성 분석에 사용되므로 여기서는 후퇴 곡선만 셀 접착에 대해 우려됩니다. 곡선의 최소값(녹색 원)?...

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Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

우리는 면역학적 연구를 위한 단 하나 T 세포 및 비드 입자를 가진 원자력 현미경 (AFM) 캔틸레버를 기능화하는 프로토콜을 제시합니다. AFM에 의해 단일 쌍 T 세포 수지상 세포 결합을 조사하고 형광 이미징을 통해 AFM에 의해 단일 고체 입자에 대한 대식세포의 실시간 세포 반응을 모니터링하는 절차가 도시된다.

단일 T 세포또는 면역 학적 단세포 힘 분광학을 위한 단입자를 가진 원자력 현미경 캔틸레버의 기능화

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...

이 프로토콜은 단일 T 셀및 고체 입자를 사용하여 AFM 캔틸레버를 작동하는 가장 좋은 방법을 설명합니다. 이러한 팁은 단일 쌍 수지상 세포-T 세포 상호 작용을 조사하고 각각 변덕스러운 크기의 세포 반응을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 캔틸레버의 단일 T 세포 기능화를 위해 생체 적합성 접착제를 사용한다는 것입니다.이 접착제는 진핵 세포에 불활성, 따라서 그들의 기준선 활성화 단계에 T 세포를 유지. 이 방법은 면역 세포 활성화 및 면역 시 냅 스 형성 등 복잡 한 세포 간 이벤트에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 방법은 또한 세포 세포 또는 세포 표면 상호 작용을 관련시키는 그밖 시스템으로 확장될 수 있습니다.이 기술에 새로운 누군가를 위해, T 세포가 사용하기 전에 양호한 상태에 있고 하룻밤 IL-2로 전처리된다는 것을 확인하는 것이 중요합니다. 또한 생체 적합성 접착제를 사용할 때는 불필요한 산화로부터 보호하기 위해 신속하게 움직입니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜을 따라 다음하여 현미경 검사법에 대한 단일 T 셀을 준비합니다.그런 다음 DC2.4 셀로 시드된 유리 커버립을 준비하고, 37°C와 5%CO2에서 가습 챔버에서 밤새 세포를 배양한다. 피라냐 처리, 플라즈마 청소 또는 UV 오존 청소를 사용하여 낮은 스프링 상수로 부드럽고 팁없는 캔틸레버를 청소하십시오. 그런 다음 청소된 캔틸레버를 AFM 스캐닝 헤드에 장착합니다.다음으로 깨끗한 샘플 챔버를 준비하고 순수한 물로 채웁니다. 캔틸레버의 감도를 얻기 위해 먼저 유리 기판에 힘 곡선을 실행하여 물 용액에서 캔틸레버를 보정합니다. 그런 다음 열 잡음 스펙트럼을 기록하여 스프링 상수를 추출합니다.캔틸레버가 제대로 보정되면 솔루션에서 AFM 스캐닝 헤드를 제거합니다. 장착된 캔틸레버를 순수 에탄올 몇 방울로 씻고 캔틸레버를 스캐닝 헤드에 건조하게 유지합니다. 살아있는 세포 환경 인클로저를 섭씨 37도로 예열하여 5%의 CO2로 예열합니다.이어서, DC2.4 셀로 시드된 유리 커버슬립을 샘플 챔버 어셈블리에 장착하고, 즉시 600마이크로리터의 중간 B를 챔버에 첨가한다. 완성된 어셈블리를 AFM 샘플 스테이지에 배치합니다. 인간 IL-2-인큐베이션CD4 양성 T 세포를 샘플 챔버에 추가합니다.표적 T 세포가 표지 슬립의 바닥에 완전히 정착 될 때까지 기다린 다음 현미경아래 시야로 세포를 가져옵니다. 이제 파이펫으로 장착 된 캔틸레버의 끝에 생체 호환 접착제 2 마이크로 리터 드롭을 추가하십시오. 생체 적합성 접착제가 캔틸레버에 적용되면 접착력을 최대화하기 위해 가능한 한 빨리 후속 단계를 완료해야 합니다.스캐닝 헤드를 샘플 단계에 빠르게 배치하여 접착제 코팅 캔틸레버를 솔루션에 담급니다. 상태 T 셀이 캔틸레버 의 끝 아래에 위치할 때까지 샘플 스테이지를 이동합니다. 그런 다음 스캐닝 헤드를 이동하여 위치를 미세하게 조정합니다.다음으로 캔틸레버를 수동으로 낮춥춥습니다. 50 미크론 스텝 크기로 시작한 다음 캔틸레버 이미지의 선명도에 의해 표시된 대로 10, 5 및 2로 감소하고 마침내 0.5 미크론을 점진적으로 감소시다. 이제 스테퍼 모터의 위치를 잡고 스캔 헤드의 위치를 조정하여 캔틸레버 팁과 셀을 더 잘 정렬합니다.0.5 ~ 1.5 나노 뉴턴의 전형적인 힘에 대응하는 레이저 위치의 작은 변위에 의해 확고한 접촉이 표시 될 때까지 계속하십시오. 접촉 30초 후 캔틸레버를 철회합니다. 셀이 캔틸레버로 이동하는 경우 첨부 파일이 성공했습니다.그렇지 않은 경우 새 캔틸레버로 전환하기 전에 접착 단계를 최대 3배까지 반복합니다. 샘플 단계와 스캐닝 헤드를 이동하여 부착된 T 셀을 DC2.4 셀 위에 배치합니다. 적절한 매개 변수를 설정한 후 샘플 위에 힘 분광법을 실행합니다.새로운 프로빙을 위해 새롭고 깨끗한 캔틸레버를 장착하십시오. 순수한 물에서 교정한 다음 T 세포 수지상 세포 쌍으로 돌아가 스캔을 반복합니다. 시료 챔버 어셈블리에 청소 유리 커버 슬립을 마운트합니다.커버슬립의 왼쪽에 에탄올에 희석되고 6미크로른 직경의 폴리스티렌 구슬이 들어 있는 비드 용액 한 방울을 추가합니다. 용매가 증발하면 20배 의 목표를 갖춘 밝은 필드 현미경을 사용하여 구슬의 간격을 확인하십시오. 개별 구슬이 잘 분리되어 있는지 확인합니다.그런 다음, 마이크로피펫 팁이나 이쑤시개를 잘 혼합된 에폭시 접착제에 담그고, 소량의 접착제를 오른쪽에 연속적인 부드러운 터치로 3개의 별도 반점으로 옮기지만, 표지슬립의 중앙에 가깝습니다. 다음으로, 깨끗하고 팁이 없는 캔틸레버를 AFM 스캐닝 헤드에 장착하고 깨끗한 표면으로 공기 중으로 보정하여 스프링 상수를 얻습니다. 그런 다음, 마지막 에폭시 접착제 스팟의 왼쪽 경계 위에 캔틸레버 팁을 배치하고 스테퍼 모터의 작은 스텝 크기를 사용하여 캔틸레버를 접착제에 가깝게 천천히 놓습니다.접착제와 접촉하면 AFM 스캐닝 헤드를 뒤로 이동하여 캔틸레버를 측면으로 빠르게 당깁니다. 유리에 문지르면 여분의 접착제를 제거하고 끝 끝에 소량의 접착제만 남깁니다. 이제 캔틸레버 팁을 잘 분리된 비드 위에 넣습니다.단일 비드에 천천히 접근하여 약 10초 동안 2~5나노뉴턴 범위에서 단단히 접촉한다. 접촉하는 동안 미세 팁 조정을 사용하여 팁의 맨 끝에 비드를 배치합니다. 접촉 끝에 있는 팁을 철회합니다.구슬이 원래 초점 평면에서 사라지면 성공적인 접착 이벤트가 발생했습니다. 마지막으로, 비드 수정 캔틸레버를 조심스럽게 탈착하고, 에폭시가 완전히 치료할 수 있도록 하룻밤 동안 캔틸레버 상자에 보관합니다. 다음은 하나의 접근 방식-리트랙트 주기 동안 단일 T 셀과 단일 수지상 셀 간의 결합 상호 작용에서 얻은 일반적인 힘 거리 곡선입니다.밝은 빨간색 곡선은 연장 곡선이고 어두운 빨간색 곡선은 철회 곡선입니다. 곡선의 최소 값은 T 셀과 수지상 셀 사이의 최대 접착력을 측정하고 곡선 아래 영역은 이를 분리하는 데 필요한 작업을 나타냅니다. 날카롭고 단계적인 파열 이벤트는 세포-세포 계면에서 강한 결합으로 인해 세포 표면에서 막 밧줄이 꺼낸 다음 연속 당기는 하에서 이산적으로 깨는 것으로 해석될 수 있다.여기서, 종래의 T 세포결합은 수지상 세포에 대한 회색으로 나타내고, 수지상 세포에 결합하는 조절T 세포는 파란색으로 도시된다. 기존의 T 세포와 조절T 세포 사이의 접착력은 항원 제시 세포에 의해 제시된 펩티드 항원들을 인식하는 반면, 조절T 세포는 면역 반응의 끝으로 기존의 T 세포 매개 면역을 차단하는 억제제 T 세포이다. 형광 표지, phagocytic RAW264.7 세포의 이 회로도는 단일 벌거 벗은, 6 미크론 직경, 폴리스티렌 구슬로 접근하는 세포를 보여줍니다.구슬을 참여시막 PIP2는 b 근처의 접촉 부위에서 정렬되어 모에신의 막 모집을 유도하여 식세포 이벤트가 발생합니다. 여기에 설명된 절차 이외에, AFM 계 단일 세포 힘 분광법은 단일 세포 수준에서 실시간으로 면역 세포 활성화를 연구하기 위해 형광 영상과 함께 사용될 수 있다. 결합된 형광 기술, 이 방법은 수지상 세포와 T 세포 쌍 사이 면역 시냅스의 형성과 같은 더 복잡한 세포 프로세스를 실시간으로 해결하는 것을 허용합니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

비주얼 분석 기법과 면역 데이터 분석을 촉진

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the ...

연구

면역학 및 감염병학

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

의 단일 세포 분석 바실러스 subtilis</em형광 현미경 및 유동세포계측법 사용> Biofilms

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

이미징 면역 시냅스 역학에 대한 내피 평면 셀 모델

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

구조화 조명 현미경 데이터의 시공간적 이미지 상관 분광학에 의해 정량화 T 세포에서 대뇌 피질 굴지 흐름

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 모델

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

세포 분화 및 단일 세포 이미징의 유도<em&gt; 비브리오 균 (Vibrio parahaemolyticus)</em&gt; Swimmer and Swarmer Cells

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Opsonophagocytic 살해 분석 결과 세균성 병원 체에 대 한 면역학 응답을 평가 하

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

마우스 종아리에 일관된 마사지와 같은 섭동을 적용하고 근육 내 압력 변화를 모니터링

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...