Name: functionalization of atomic force microscope cantilevers with single-t cells or single-particle for immunological single-cell force spectroscopy
Uploaded: 2019-07-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Doğal Bilim Vakfı Çin genel programı (31370878), devlet anahtar programı (31630023) ve yenilikçi araştırma grubu programı (81621002) tarafından desteklenmektedir.

Fare deney Protokolü Tsinghua Üniversitesi hayvan bakım kurallarını takip
1. tek T hücreleri ile konsol functionalization
<ol><li>Fare dalak hücreleri hazırlama<ol>
<li>Karbon dioksit kullanarak fare (8-16 yaş (ya seks); Örneğin, C57BL/6 strain) feda, servikal dislocation izledi.</li>
		<li>75% etanol ile fareyi temizleyin ve splenektomi takiben orta çizgi cilt kesi yapın.</li>
		<li>Cam kaydırakları kullanarak% 2 fetal sığır serumu (FBS) içeren 4 mL PBS 'de dalağı homoj...

<ol>
	<li>Benoit, M., Gabriel, D., Gerisch, G., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrete+interactions+in+cell+adhesion+measured+by+single-molecule+force+spectroscopy.">Discrete interactions in cell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy.</a> Nature Cell Biology. 2 (6), 313-317 (2000).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+adhesion+by+regulatory+T+cells+induces+dendritic+cell+cytoskeletal+polarization+and+contact-dependent+lethargy.">Strong adhesion by regulatory T cells induces dendritic cell cytoskeletal polarization and contact-dependent lethargy.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 327-338 (2017).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction-modulated+fibrotic+microniches+reveal+the+contribution+of+angiogenesis+in+liver+fibrosis.">Mechanotransduction-modulated fibrotic microniches reveal the contribution of angiogenesis in liver fibrosis.</a> Nature Materials. 16 (12), 1252-1261 (2017).</li><li>Mu, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phosphatidylinositol+4,5-bisphosphate+redistribution-based+sensing+mechanism+initiates+a+phagocytosis+programing.">A phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate redistribution-based sensing mechanism initiates a phagocytosis programing.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Qi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology-targeted+cell+delivery+via+injectable+micro-scaffold+capsule+mediated+by+endogenous+TGase.">Pathology-targeted cell delivery via injectable micro-scaffold capsule mediated by endogenous TGase.</a> Biomaterials. 126, 1-9 (2017).</li><li>Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+probing+surfaces+of+living+cells+to+molecular+resolution.">Force probing surfaces of living cells to molecular resolution.</a> Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).</li><li>Muller, D. J., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy:+a+nanoscopic+window+on+the+cell+surface.">Atomic force microscopy: a nanoscopic window on the cell surface.</a> Trends in Cell Biology. 21 (8), 461-469 (2011).</li><li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth.">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysics Journal. 103 (3), 386-394 (2012).</li><li>Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+probing+of+cell+elasticity.">Atomic force microscopy probing of cell elasticity.</a> Micron. 38 (8), 824-833 (2007).</li><li>Scheuring, S., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy:+probing+the+spatial+organization,+interactions+and+elasticity+of+microbial+cell+envelopes+at+molecular+resolution.">Atomic force microscopy: probing the spatial organization, interactions and elasticity of microbial cell envelopes at molecular resolution.</a> Molecular Microbiology. 75 (6), 1327-1336 (2010).</li><li>Berdyyeva, T. K., Woodworth, C. D., Sokolov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+epithelial+cells+increase+their+rigidity+with+ageing+in+vitro:+direct+measurements.">Human epithelial cells increase their rigidity with ageing in vitro: direct measurements.</a> Physics in Medicine and Biology. 50 (1), 81-92 (2005).</li><li>Sokolov, I., Dokukin, M. E., Guz, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+quantitative+measurements+of+the+elastic+modulus+of+biological+cells+in+AFM+indentation+experiments.">Method for quantitative measurements of the elastic modulus of biological cells in AFM indentation experiments.</a> Methods. 60 (2), 202-213 (2013).</li><li>Bozna, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+strength+and+dynamics+of+invariant+natural+killer+cell+T+cell+receptor/CD1d-glycosphingolipid+interaction+on+living+cells+by+single+molecule+force+spectroscopy.">Binding strength and dynamics of invariant natural killer cell T cell receptor/CD1d-glycosphingolipid interaction on living cells by single molecule force spectroscopy.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 15973-15979 (2011).</li><li>Flach, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alum+interaction+with+dendritic+cell+membrane+lipids+is+essential+for+its+adjuvanticity.">Alum interaction with dendritic cell membrane lipids is essential for its adjuvanticity.</a> Nature Medicine. 17 (4), 479-487 (2011).</li><li>Ng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-independent,+direct+membrane+binding+leads+to+cell-surface+lipid+sorting+and+Syk+kinase+activation+in+dendritic+cells.">Receptor-independent, direct membrane binding leads to cell-surface lipid sorting and Syk kinase activation in dendritic cells.</a> Immunity. 29 (5), 807-818 (2008).</li><li>Helenius, J., Heisenberg, C. P., Gaub, H. E., Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+force+spectroscopy.">Single-cell force spectroscopy.</a> Journal of Cell Science. 121 (11), 1785-1791 (2008).</li><li>Litvinov, R. I., Shuman, H., Bennett, J. S., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+strength+and+activation+state+of+single+fibrinogen-integrin+pairs+on+living+cells.">Binding strength and activation state of single fibrinogen-integrin pairs on living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7426-7431 (2002).</li><li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+Force+Technique+to+Probe+Molecular+Adhesion+and+Structural+Linkages+at+Biological+Interfaces.">Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces.</a> Biophysics Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).</li><li>Lamprecht, C., Hinterdorfer, P., Ebner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+biosensing+atomic+force+microscopy+in+monitoring+drug+and+nanoparticle+delivery.">Applications of biosensing atomic force microscopy in monitoring drug and nanoparticle delivery.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (8), 1237-1253 (2014).</li><li>Charras, G. T., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+mechanotransduction+and+its+modulation+analyzed+by+atomic+force+microscope+indentation.">Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation.</a> Biophysics Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).</li><li>Sun, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+membrane+tethers+probed+by+atomic+force+microscopy.">Multiple membrane tethers probed by atomic force microscopy.</a> Biophysics Journal. 89 (6), 4320-4329 (2005).</li><li>Yan, J. C., Liu, B., Shi, Y., Qi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class+II+MHC-independent+suppressive+adhesion+of+dendritic+cells+by+regulatory+T+cells+in+vivo.">Class II MHC-independent suppressive adhesion of dendritic cells by regulatory T cells in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 319-326 (2017).</li><li>Hao, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C-mediated+hydrolysis+of+PIP2+releases+ERM+proteins+from+lymphocyte+membrane.">Phospholipase C-mediated hydrolysis of PIP2 releases ERM proteins from lymphocyte membrane.</a> Journal of Cell Biology. 184 (3), 451-462 (2009).</li><li>Rodriguez, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte-T+Adhesion+to+Fibronectin+(Fn)+-+a+Possible+Mechanism+for+T-Cell+Accumulation+in+the+Rheumatoid+Joint.">Lymphocyte-T Adhesion to Fibronectin (Fn) - a Possible Mechanism for T-Cell Accumulation in the Rheumatoid Joint.</a> Clinical and Experimental Immunology. 89 (3), 439-445 (1992).</li><li>Kimura, A., Ersson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Lymphocytes-T+by+Lectins+and+Carbohydrate-Oxidizing+Reagents+Viewed+as+an+Immunological+Recognition+of+Cell-Surface+Modifications+Seen+in+the+Context+of+Self+Major+Histocompatibility+Complex+Antigens.">Activation of Lymphocytes-T by Lectins and Carbohydrate-Oxidizing Reagents Viewed as an Immunological Recognition of Cell-Surface Modifications Seen in the Context of Self Major Histocompatibility Complex Antigens.</a> European Journal of Immunology. 11 (6), 475-483 (1981).</li><li>Miller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Stimulation+of+Human+Lymphocyte-B+and+Lymphocyte-T+by+Various+Lectins.">The Stimulation of Human Lymphocyte-B and Lymphocyte-T by Various Lectins.</a> Immunobiology. 165 (2), 132-146 (1983).</li><li>Vitte, J., Pierres, A., Benoliel, A. M., Bongrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+quantification+of+the+modulation+of+interaction+between+cell-+or+surface-bound+LFA-1+and+ICAM-1.">Direct quantification of the modulation of interaction between cell- or surface-bound LFA-1 and ICAM-1.</a> Journal of Leukocyte Biology. 76 (3), 594-602 (2004).</li><li>Beaussart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+forces+guiding+microbial+cell+adhesion+using+single-cell+force+spectroscopy.">Quantifying the forces guiding microbial cell adhesion using single-cell force spectroscopy.</a> Nature Protocols. 9 (5), 1049-1055 (2014).</li><li>Shu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+Crystal-Mediated+Inflammation+Is+Driven+by+Plasma+Membrane+Destabilization.">Cholesterol Crystal-Mediated Inflammation Is Driven by Plasma Membrane Destabilization.</a> Frontiers in Immunology. 9, (2018).</li><li>Hosseini, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+synapse+formation+determines+interaction+forces+between+T+cells+and+antigen-presenting+cells+measured+by+atomic+force+microscopy.">Immune synapse formation determines interaction forces between T cells and antigen-presenting cells measured by atomic force microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17852-17857 (2009).</li></ol>

AFM tabanlı tek hücreli kuvvet spektroskopisi, yaşayan hücrelerin Biyofizik özelliklerini ele almak için güçlü bir araç olarak gelişti. Bu uygulamalar için, konsol ilgi hücrelerinde belirli etkileşimleri veya özellikleri araştırma için düzgün işlevselleştirilmiş olması gerekir. Burada, tek T hücresi ve tek mikron büyüklüğünde boncuk için ucu-Less konsol bağlama yöntemleri sırasıyla açıklanmıştır. Tek bir T hücresi eklemek için, hücre yapıştırıcı olarak biyouyumlu bir tutkal...

Atomic Force microkopi (AFM), çok yönlü bir araç, hücre Biyoloji araştırma1,2,3,4,5birçok uygulama buldu. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme özelliğinden farklı olarak, doğal kuvvet yoklama özelliği, yaşam hücrelerinin Biyofizik özelliklerinin, tek hücreli6,7' de doğrudan situ 'da araştırılmasını sağlar. Bunlar, alt hücreli yapıların sertlik ve hatta tüm hücreler8,9,10,11,12, spesifik ligand/reseptör bağlama güçlü içerir tek molekül seviyesi hücre yüzeyi13, ve tek çiftleri arasında katı parçacıklar ve hücreler veya iki hücre arasında yapışma güçleri1,2,14,15. İkinci iki genellikle tek hücreli kuvvet spektroskopisi (SCFS)16olarak sınıflandırılır. Çeşitli bahar sabiti ile kolayca kullanılabilir atölyeler sayesinde, AFM erişilebilir kuvvet aralığı oldukça birkaç piconewtons (PN) mikronewtons (μn), hangi yeterli hücresel olayların tüm aralığı kapsar birkaç onlarca güçler içeren geniş pN, reseptör tabanlı tek molekül bağlama gibi, nN için, gibi phagositik hücresel olaylar15. Bu büyük dinamik kuvvet aralığı, AFM 'ye, optik/manyetik cımbız ve Biomembran kuvvet sondası gibi diğer kuvvet prob teknikleri üzerinde avantajlı hale getirir, çünkü zayıf kuvvet ölçümleri için daha uygundur, genellikle 200 pN17 ' den az kuvvet ile , 18. Buna ek olarak, AFM, tek hücrelere çeşitli uyaranlara teslim etmek için yüksek hassasiyetli manipülatör olarak işlev verebilir bir spatiotemporally tanımlanan şekilde4,19. Bu gerçek zamanlı tek hücreli aktivasyon çalışmaları için arzu edilir. Canlı hücreli floresan görüntüleme ile birlikte, spesifik uyarıcı için sonraki hücresel yanıt aynı anda izlenebilir, böylece AFM tabanlı scfs son derece sağlam optik görüntüleme olarak hücresel sinyal prob için pratik bir araç sağlayan güçlü hale. Örneğin, osteoblastlar20' de kalsiyum geçişler için gerekli suşları belirlemek için AFM kullanılmıştır. Bu çalışmamızda, lokalize kuvvetlerin bir AFM ucu ile kültürlü osteoblastlar üzerinde uygulanması sonrasında kalsiyum onay görüntülemesi ile floresan kalsiyum geçitleri izlenen. Son zamanlarda, AFM hangi hepatik stellat hücreler (HSC) büyüdü ve bu mechano-dönüştürücü HSC aktivasyon gerçek zamanlı bir floresan src biosensor tarafından izlenen olan fosforilasyon tarafından temsil edilen kollajen fibriller germe için istihdam edildi biosensörün floresan yoğunluğu HSC aktivasyonu ile ilişkilidir3.
AFM tabanlı scfs deneylerinde, AFM atölyeler uygun functionalization başarılı ölçümler doğru önemli bir adımdır. Araştırmalarımız bağışıklık hücrelerinin aktivasyonuna odaklandığı için, biz rutin olarak fagositoz ve/veya güçlü immün tepkiler tetikleyebilir tek katı parçacıklar gibi partikül konuları ile konsol functionalize4,14 , 15 ve tek T hücreleri bu aktif dendritik hücreler (DC)2gibi antijen sunan hücreler, bir bağışıklık sinaps oluşturabilir. Tek katı parçacıklar normal olarak bir konsol ile hava ortamında bir epoksi tutkal ile birleştiğinde, tek T hücreleri, onların yapışkan olmayan doğası nedeniyle, çözüm bir biyouyumlu tutkal aracılığıyla bir konsol functionalized. Burada, bu iki tür konsol değişikliğini gerçekleştirmek ve aynı zamanda iki ilişkili uygulama vermek için yöntemleri tarif ediyoruz. İlk uygulama, T Cell/DC etkileşimlerini AFM-SCFS ile araştırmanın hücre mekaniği açısından düzenleyici T hücrelerinin bastırıcı mekanizmasını anlamak içindir. İkincisi, reseptör bağımsız fosfatidilositol 4, 5-bisfosfat (PIP2) molekül mekanizmasını ortaya çıkarmak için gerçek zamanlı olarak makro Phage sağlam bir parçacık için hücresel tepkisi izlemek için canlı hücreli floresan görüntüleme ile AFM birleştirerek içerir- Moesin aracılı fagositoz. Bu protokolün amacı, ilgili araştırmacıların immünolojik araştırmalar için AFM tabanlı tek hücreli analizlerle kendi deneysel ayarlarını tasarlayıp uygulamalarına yönelik bir referans çerçevesi sağlamaktır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;l pipette tip</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>104-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm diameter culture dish</td>
			<td>NALGENE nunc</td>
			<td>150462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plate</td>
			<td>JET</td>
			<td>TCP011006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Cantilever</td>
			<td>NanoWorld</td>
			<td>Arrow-TL1-50</td>
			<td>tipless cantilever</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocompatible glue</td>
			<td>BD Cell-Tak</td>
			<td>354240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4+ T cell isolation Cocktail</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>19852C.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC2.4 cell line</td>
			<td>A gift from K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-coated magnetic particles</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>GENEray</td>
			<td>Generay-E1101-500 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>ERGO</td>
			<td>7100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>twbio</td>
			<td>00019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Ex Cell Bio</td>
			<td>FSP500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR blocker</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>local vender (Hai Men Lian Sheng)</td>
			<td>HX-E37</td>
			<td>24mm diameter, 0.17mm thinckness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>JinTong department of laboratory and equipment management, Haimen&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>customized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2 (30%)</td>
			<td>Sino pharm</td>
			<td>10011218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Sino pharm</td>
			<td>80120892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh nylon strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>REF 352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moesin-EGFP</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>cloned in laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD25 Treg cell positive isolation kit</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18782</td>
			<td>Component: FcR Blocker,Regulatory T cell Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD4+ Tcell isolation kit</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>19852</td>
			<td>Component:CD4+T cell isolation Cocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rat Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Lanyi chemical products co., LTD&#65292; Beijing</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1022-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE selection cocktail</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLC&#948;-PH-mCherry</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>36075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microspheres 6.0&#956;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>07312-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polystyrene round bottom tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat serum</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>13551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7</td>
			<td>&#160;ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Interleukin-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>Peprotech, 200-02-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regulatory T cell positive selection cocktail</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>18782C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Life</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample chamber</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-coated magnetic particles</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>50001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection kit</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25% EDTA</td>
			<td>Life</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>JD</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective NA 0.8</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>420650-9901</td>
			<td>Plan-Apochromat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force microscope</td>
			<td>JPK</td>
			<td>cellHesion200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>Allegra X-12R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence imaging</td>
			<td>home-made objective-type total internal reflection fluorescence microscop based on a Zeiss microscope stand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HERACELL 150i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Observer A1 manual</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functionalization of atomic force microscope cantilevers with single-t cells or single-particle for immunological single-cell force spectroscopy

Atomik kuvvet mikroskopisi bazlı tek hücreli kuvvet spektroskopisi (AFM-SCFS), yaşam hücrelerinin Biyofizik özelliklerini incelemek için güçlü bir araçtır. Bu teknik, hücreler, reseptör ve ligler arasında ve diğer birçok varyasyonların yanı sıra, canlı bir hücre membranında etkileşim kuvvetlerini ve dinamiklerini araştırarak sağlar. Ayrıca, belirli hücre aktivasyonu ve sonraki hücresel olayların canlı hücre ile kombine edildiğinde gerçek zamanlı olarak izlenmesi için izin, böylece bir spatiotemporally kontrollü bir şekilde tek hücrelerde fiziksel veya biyokimyasal uyarıcı teslim etmek için bir mekanizma olarak çalışır floresans görüntüleme. Bu AFM-SCFS ölçümlerinde anahtar adım AFM-Cantilever functionalization, ya da başka bir deyişle, konsol için ilgi bir konu iliştirmek. Burada, immünolojik çalışmalar için sırasıyla tek bir T hücresi ve tek bir polistiren boncuk ile AFM atölyeler değiştirmek için yöntemler sunuyoruz. Eski bir çözelti içinde düz bir konsol ucunu çiftler tek T hücreleri bir biyouyumlu tutkal içerir, ikincisi hava ortamında tek boncuk yapışma için bir epoksi tutkal dayanır iken. Her bir konsol modifikasyonu ile ilişkili iki immünolojik uygulama da sağlanır. Burada açıklanan yöntemler, farklı hücre türlerine ve katı parçacıklara kolayca adapte edilebilir.

Şekil 4A , tek T hücresi Ile tek DC arasındaki bağlama etkileşiminden tipik kuvvet uzaklığı eğrilerini bir yaklaşım geri çekilme döngüsünde gösterir. Açık kırmızı eğrisi uzatma eğrisidir ve koyu kırmızı olan geri çekme eğrisidir. Uzantı eğrisi genellikle girintileme veya rijitlik analizi için kullanılındığı için, burada yalnızca geri çekme eğrisi hücre yapışma için ilgilidir. Eğrinin minimum değeri (yeşil daire) ...

Watch this Scientific Journal Video about Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy at JoVE.com

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Biz immunolojik çalışmalar için tek bir T hücresi ve boncuk parçacık ile Atomic Force mikroskop (AFM) konsol functionalize bir protokol sunuyoruz. AFM tarafından tek çifti T hücreli dendritik hücre bağlayıcılığı araştırması ve makrofajların gerçek zamanlı hücresel tepkisi ile AFM tarafından floresans görüntüleme ile tek bir katı parçacığın izlenmesi için prosedürler gösterilmektedir.

Tek-T hücreleri veya tek parçacık Immünolojik tek hücreli kuvvet spektroskopisi ile Atomic Force mikroskop Cantilevers functionalization

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...

Bu protokol, tek T hücreleri ve katı parçacıklar kullanarak AFM kantilevers işlevselleştirmek için en iyi nasıl açıklanır. Bu ipuçları daha sonra tek çift dendritik hücre-T hücre etkileşimlerini araştırmak ve sırasıyla değişken boyuttaki hücresel yanıtları izlemek için kullanılabilir. Bu tekniğin en önemli avantajı, tek T hücreli fonksiyonelleştirme için biyouyumlu bir tutkal kullanmasıdır.Bu tutkal ökaryotik hücrelere inert, böylece onların temel aktivasyon aşamasında T hücreleri tutmak. Bu yöntemler, bağışıklık hücresi aktivasyonu ve immün sinaps oluşumu gibi karmaşık hücreler arası olaylar hakkında bilgi sağlar. Yöntemler, hücre hücresi veya hücre-yüzey etkileşimlerini içeren diğer sistemlere de genişletilebilir.Bu teknik için yeni olan biri için, T hücrelerinin kullanmadan önce iyi durumda olduğundan ve bir gecede IL-2 ile ön işlem den önce olduğundan emin olmak önemlidir. Ayrıca, biyouyumlu tutkal kullanırken, gereksiz oksidasyon onu korumak için hızlı hareket. Bu yordamı başlatmak için, metin protokolü ile birlikte izleyerek mikroskopi için tek T hücreleri hazırlayın.Daha sonra DC2.4 hücreleri ile tohumlanmış cam kapaklar hazırlayın ve hücreleri bir gecede 37 santigrat derece ve %5 CO2'de nemli bir odada kuluçkaya yatırın. Piranha tedavisi, plazma temizliği veya UV-ozon temizliği kullanarak düşük yay sabiti ile yumuşak, tüysüz kantilleri temizleyin. Ardından, temizlenmiş kantili AFM tarama kafasına monte edin.Sonra, temiz bir örnek odası hazırlamak ve saf su ile doldurun. Kantilever hassasiyetini elde etmek için ilk cam substrat üzerinde bir kuvvet eğrisi çalıştırarak su çözeltisi içinde kantili kalibre. Daha sonra, bahar sabitini çıkarmak için termal gürültü spektrumu kaydedin.Kantili düzgün kalibre edildiğinde, AFM tarama kafasını çözümden çıkarın. Monte edilmiş kantili birkaç damla saf etanolle yıkayın ve kantili tarama başlığında kuru tutun. Canlı bir hücre ortamını %5 CO2 ile 37 dereceye ısıtın.Daha sonra, dc2.4 hücreleri ile tohumlu cam kapaklı monte örnek oda montaj, ve hemen hazne orta B 600 mikrolitre ekleyin. Tamamlanmış montajı AFM örnek aşamasına yerleştirin. Örnek haznesine insan IL-2-inkübül CD4-pozitif T hücreleri ekleyin.Hedefleme eden T hücreleri kapağın altına tamamen yerleşene kadar bekleyin ve sonra hücreleri mikroskop altında görüş alanına getirin. Şimdi, bir pipet ile monte kantilever sonuna biyouyumlu tutkal iki mikrolitre damla ekleyin. Biyouyumlu tutkal kantilever uygulandıktan sonra, yapışmaen en üst düzeye çıkarmak için sonraki adımları mümkün olan en kısa sürede tamamlanması gerekir.Tarama kafasını hızlı bir şekilde örnek aşamasına yerleştirin ve tutkal kaplı kantiliyi çözeltiye batırın. Bir sağlık T hücresi cantilever ucu altında bulunana kadar örnek aşamasını taşıyın. Daha sonra, tarama kafasını hareket ettirerek konumunu hassas bir şekilde ayarlayın.Ardından, kantilever'i el ile indirin. 50 mikronluk bir adım boyutuyla başlayın ve ardından cantilever görüntüsünün keskinliğinde belirtildiği gibi kademeli olarak 10, beş ve iki ve son olarak 0,5 mikrona düşürün. Şimdi, step motorların konumunu tutun ve tarama kafasının konumunu daha iyi kantilever ucu ve hücre hizalamak için ayarlayın.0,5 ila 1,5 nanonewton'luk tipik bir kuvvete karşılık gelen lazerin konumunun küçük bir yer değiştirmesi ile sağlam temas gösterilene kadar devam edin. 30 saniye lik temastan sonra, kantiligeri çekilin. Hücre cantilever ile hareket ederse, eki başarılı oldu.Değilse, yeni bir kantilever geçmeden önce üç kez yapışma adım tekrarlayın. Ekli T hücresini, örnek aşamayı ve tarama kafasını hareket ettirerek DC2.4 hücresinin üzerine yerleştirin. Uygun parametreleri ayarladıktan sonra, numune üzerinde kuvvet spektroskopisi çalıştırın.Yeni bir sonlama turu için, yeni, temiz bir kantilever monte edin. Saf suda kalibre edin ve sonra T hücre-dendritik hücre çiftine geri dön ve tkanı tekrarlayın. Temizlenmiş bir cam kapak slip'i numune odası montajına monte edin.Kapağın sol tarafına, etanol le seyreltilmiş ve altı mikron çapında polistiren boncuklar içeren bir damla boncuk çözeltisi ekleyin. Çözücü buharlaştıktan sonra, 20 x hedefiyle donatılmış parlak alanlı bir mikroskop kullanarak boncukların aralıklarını kontrol edin. Tek tek boncukların iyi bir şekilde ayrıldığından emin olun.Daha sonra, iyi karışık epoksi tutkal içine bir mikropipet ucu veya kürdan daldırma ve sağ tarafta ardışık nazik dokunuşlar ile üç ayrı noktalar tutkal küçük bir miktar aktarın ama kapak merkezine yakın, burada gösterildiği gibi. Daha sonra, Temizlenmiş, tüysüz bir kantiliyi AFM tarama kafasına monte edin ve yay sabitini elde etmek için temiz bir yüzeyle havada kalibre edin. Daha sonra, son epoksi tutkal noktanın sol sınırı üzerinde cantilever ucu konumlandırın ve yavaş yavaş step motorlarda küçük adım boyutları kullanarak tutkal yakın cantilever getirmek.Tutkalla temas yapıldıktan sonra, AFM tarama kafasını geriye doğru hareket ettirerek kantili yanal olarak hızlıca çekin. Ucun sonunda tutkal sadece küçük bir miktar bırakarak, cama sürtünerek herhangi bir aşırı tutkal çıkarın. Şimdi, iyi izole edilmiş bir kabın üzerine kantilever ucunu hareket ettirin.Tek boncuk yavaş yavaş yaklaşın ve yaklaşık 10 saniye boyunca iki ila beş nanonewton aralığında onunla sağlam bir temas kurun. Temas ederken, kabı ucun en ucunda konumlandırmak için ince uç ayarı kullanın. İlgili temasın sonundaki ucu geri çekin.Boncuk orijinal odak düzleminden kaybolursa, başarılı bir yapışma olayı meydana gelmiştir. Son olarak, boncuk modifiye cantilever dikkatle demount ve epoksi tam tedavi için bir gecede bir cantilever kutusunda saklayın. Burada, tek bir T hücresi ile tek bir dendritik hücre arasındaki bağlama etkileşiminden tipik kuvvet-uzaklık eğrileri bir yaklaşım-geri çekme döngüsü boyunca dır.Açık kırmızı eğri uzatma eğrisi, koyu kırmızı eğri ise geri çekme eğrisidir. Eğrideki minimum değer, T hücresi ile dendritik hücre arasındaki maksimum yapışma kuvvetinin ölçüsünü verir ve eğrinin altındaki alan onları ayırmak için gereken işi temsil eder. Keskin ve adım adım yırtMa olayları, hücre-hücre arabirimindeki güçlü bağlanma nedeniyle hücre yüzeyinden çıkarılan ve sürekli çekme nin altında ayrı ayrı kırılan membran teterrler olarak yorumlanabilir.Burada, dendritik hücrelere bağlanan konvansiyonel T hücresi gri, dendritik hücrelere düzenleyici T hücresi bağlanması mavi renkte gösterilir. Geleneksel bir T hücresi ile düzenleyici bir T hücresi arasındaki yapışma kuvvetleri, antijen sunan hücreler tarafından sunulan peptid antijenlerini tanırken, düzenleyici T hücreleri bağışıklık reaksiyonunun sonuna doğru konvansiyonel T hücre aracılı bağışıklığı kapatan baskılayıcı T hücreleridir. Fagoessentetiketli fagositik RAW264.7 hücresinin bu şeması, hücreye tek bir çıplak, altı mikron çapında polistiren boncukla yaklaşıldığını gösterir.Boncuk çekici üzerine, membran PIP2 temas yerinde sıralanır, b yakın, daha sonra moesin membran işe neden olur, fagositik bir olay ile sonuçlanan. Burada açıklanan prosedüre ek olarak, AFM tabanlı tek hücreli kuvvet spektroskopisi tek hücreli düzeyde gerçek zamanlı olarak immün hücre aktivasyonunu incelemek için floresan görüntüleme ile birlikte kullanılabilir. Kombine floresan teknikleri, Bu yöntem gerçek zamanlı olarak daha karmaşık hücresel süreçleri ele sağlar, dendritik hücre ve T hücre çifti arasında bir bağışıklık sinaps oluşumu gibi.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

Visual Analitik Teknikleri ile İmmünolojik Veri Analizi kolaylaştırılması

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Tek hücreli Analizi Bacillus subtilis</emFloresan Mikroskobu ve Akım Sitometri Kullanma> Biyofilmler

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Görüntüleme İmmünoloji Synapse Dynamics için bir Endotel Hücre Modeli Düzlemsel

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskopi Verilerinin uzay-zamansal Görüntü Korelasyon Spektroskopisi nicel T Hücreleri kortikal Aktin Akışı

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Kan-beyin bariyeri Model

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Hücresel Farklılaşma ve Tek Hücreli Görüntüleme İndüksiyonu<emVibrio parahaemolyticus</em&gt; Yüzücü ve Swarmer Hücreleri

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Opsonophagocytic öldürme tahlil bakteriyel patojenlere karşı immünolojik yanıt değerlendirmek için

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Fare Buzağılarına Tutarlı Masaj Benzeri Pertürbasyonların Uygulanması ve Bunun Sonucu Kas içi Basınç Değişikliklerinin İzlenmesi

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...