Name: studying cryptosporidium infection in 3d tissue-derived human organoid culture systems by microinjection
Uploaded: 2019-09-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection at JoVE.com

نحن ممتنون لديبورا أ. شايفر من كلية العلوم الطبية الحيوية الحيوانية والمقارنة، كلية الزراعة وعلوم الحياة، جامعة أريزونا، توسون، AZ، الولايات المتحدة الأمريكية لمساعدتنا في إنتاج وتحليل الخراجات. كما نشكر مركز فرانشي للتنظير المجهري والتصوير وD.L. Mullendore في جامعة ولاية واشنطن لإعداد وتصوير الخراجات العضوية المعزولة.
وقد حصل على منحة من المنظمة الهولندية للبحث العلمي (NWO-ALW, 016.Veni.171.015). وقد حصلت المنظمة الهولندية للبحوث العلمية (NWO-ALW، 863.14.002) على منحة من المعهد الهولندي للبحوث العلمية، وحظيت بدعم زمالات ماري كوري من المفوضية الأوروبية (الاقتراح 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF). وقد تلقى البحث الذي أدى إلى هذه النتائج تمويلاً من المجلس الأوروبي للبحوث بموجب اتفاقية المنح المتقدمة الخاصة بلجنة البحوث الدولية رقم 67013 ومن المعهد الوطني للصحة في إطار R21 AT009174 إلى RMO. هذا العمل هو جزء من معهد Oncode، الذي يمول جزئيا من قبل الجمعية الهولندية للسرطان وتم تمويله من منحة من جمعية السرطان الهولندية.

تم إجراء جميع مناولة الأنسجة واستئصالها في إطار البروتوكولات المعتمدة من مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) بموافقة المريض.
1. إعداد C. parvum Oocysts للحقن
ملاحظة: تم شراء الخراجات Cryptosporidium من مصدر تجاري (انظر جدول المواد). يتم إنتاج هذه الخراجات ف...

<ol>
	<li>Checkley, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+global+burden,+novel+diagnostics,+therapeutics,+and+vaccine+targets+for+Cryptosporidium.">A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium.</a> The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).</li><li>Bones, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past+and+future+trends+of+Cryptosporidium+in+vitro+research.">Past and future trends of Cryptosporidium in vitro research.</a> Experimental Parasitology. 196, 28-37 (2018).</li><li>Muller, J., Hemphill, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+systems+for+the+study+of+apicomplexan+parasites+in+farm+animals.">In vitro culture systems for the study of apicomplexan parasites in farm animals.</a> International Journal for Parasitology. 43 (2), 115-124 (2013).</li><li>Karanis, P., Aldeyarbi, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Cryptosporidium+in+vitro+culture.">Evolution of Cryptosporidium in vitro culture.</a> International Journal for Parasitology. 41 (12), 1231-1242 (2011).</li><li>Morada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+culture+of+Cryptosporidium+parvum+using+hollow+fiber+technology.">Continuous culture of Cryptosporidium parvum using hollow fiber technology.</a> International Journal for Parasitology. 46 (1), 21-29 (2016).</li><li>DeCicco RePass, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Bioengineered+Three-Dimensional+Human+Intestinal+Model+for+Long-Term+Infection+of+Cryptosporidium+parvum.">Novel Bioengineered Three-Dimensional Human Intestinal Model for Long-Term Infection of Cryptosporidium parvum.</a> Infection and Immunity. 85 (3), (2017).</li><li>Miller, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+culture+platform+for+Cryptosporidium+that+enables+long-term+cultivation+and+new+tools+for+the+systematic+investigation+of+its+biology.">A cell culture platform for Cryptosporidium that enables long-term cultivation and new tools for the systematic investigation of its biology.</a> International Journal for Parasitology. 48 (3-4), 197-201 (2018).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modelling.">Long-term expanding human airway organoids for disease modelling.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Dutta, D., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+to+study+host-pathogen+interactions.">Organoid culture systems to study host-pathogen interactions.</a> Current Opinion in Immunology. 48, 15-22 (2017).</li><li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+Cryptosporidium+infection+in+human+small+intestinal+and+lung+organoids.">Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids.</a> Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+Modeling+in+Stem+Cell-Derived+3D+Organoid+Systems.">Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>O'Hara, S. P., Chen, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+Cryptosporidium+infection.">The cell biology of Cryptosporidium infection.</a> Microbes and Infection. 13 (8-9), 721-730 (2011).</li><li>Lendner, M., Daugschies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptosporidium+infections:+molecular+advances.">Cryptosporidium infections: molecular advances.</a> Parasitology. 141 (11), 1511-1532 (2014).</li><li>Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acids+enhance+invasiveness+of+Cryptosporidium+spp.+into+cultured+cells.">Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells.</a> Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).</li><li>O'Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Cpgp40/15+in+Toxoplasma+gondii:+a+surrogate+system+for+the+study+of+Cryptosporidium+glycoprotein+antigens.">Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens.</a> Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).</li><li>Wilke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+Antibodies+to+Intracellular+Stages+of+Cryptosporidium+parvum+Define+Life+Cycle+Progression+In+Vitro.">Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro.</a> mSphere. 3 (3), (2018).</li><li>Vinayak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modification+of+the+diarrhoeal+pathogen+Cryptosporidium+parvum.">Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum.</a> Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).</li><li>Dijkstra, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Tumor-Reactive+T+Cells+by+Co-culture+of+Peripheral+Blood+Lymphocytes+and+Tumor+Organoids.">Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids.</a> Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).</li></ol>

ثقافة الطفيليات Cryptosporidium في الجهازيات المعوية ومجرى الهواء يوفر نموذجا دقيقا لدراسة التفاعلات المضيفة الطفيلية10 ولكن أيضا لديها العديد من التطبيقات الأخرى. على سبيل المثال، تتطلب الطرق الحالية لاختيار ونشر طفيليات Cryptosporidium المعدلة وراثيا ً مروراً في الفئران<sup class...

وقد أعاق تطوير الأدوية أو اللقاحات لعلاج والوقاية من عدوى Cryptosporidium بسبب عدم وجود أنظمة في المختبر التي تحاكي على وجه التحديد في حالة الجسم الحي في البشر1،2. العديد من النظم المتاحة حاليا إما تسمح فقط العدوى على المدى القصير (<5 أيام) أو لا تدعم دورة الحياة الكاملة للطفيلي3،4. وتقوم الأنظمة الأخرى التي تمكن من التطور الكامل للطفيلي على خطوط الخلايا الخالدة أو خطوط الخلايا السرطانية التي لا تلخص بأمانة الوضع الفسيولوجي في البشر5و6و7 . الأعضاء أو "الأعضاء المصغرة" هي هياكل مشتقة من الأنسجة ثلاثية الأبعاد والتي تزرع في مصفوفة خارج الخلية تكملها عوامل نمو مختلفة خاصة بالأنسجة. وقد وضعت الأعضاء من مختلف الأجهزة والأنسجة. وهي مستقرة وراثيا وخلاصة معظم وظائف الأجهزة من أصلها، ويمكن الحفاظ عليها في الثقافة لفترات طويلة من الزمن. لقد طورنا طريقة لإصابة أجهزة الجهاز ية والرئة المعوية البشرية مع Cryptosporidium التي توفر نموذج دقيق في المختبر لدراسة التفاعلات بين المضيف والطفيليات ذات الصلة بالأمعاء والجهاز التنفسي cryptosporidiosis8 ،9،10،11،12،13. على النقيض من النماذج الثقافية المنشورة الأخرى، يمثل النظام العضوي تفاعلات الطفيليات المضيفة في الحياة الحقيقية، ويسمح بإكمال دورة الحياة بحيث يمكن دراسة جميع مراحل دورة حياة الطفيلي، ويحافظ على انتشار الطفيليات لمدة تصل إلى 28 يوما10.
Cryptosporidium parvum هو طفيلي أبي مركب يصيب ظهارة الجهاز التنفسي والأمعاء، مما يسبب مرض الإسهال لفترات طويلة. المرحلة البيئية المقاومة هي الكيسة، وجدت في المواد الغذائية والمياه الملوثة14. مرة واحدة بلعها أو استنشاقها، وexcysts oocysts ويطلق أربعة sporozoites التي تعلق على الخلايا الظهارية. Sporozoites تنزلق على الخلايا المضيفة والانخراط مستقبلات الخلية المضيفة، ولكن الطفيلي لا يغزو الخلية تماما، ويبدو أن حث الخلية المضيفة لغمرها15. يبقى الطفيلي، الذي يتم استيعابه داخل مقصورة داخل الخلايا ولكن خارج السيتوبلازم، على السطح الاستئصالي للخلية، وتكرار داخل vacuole الطفيلية. وهو يخضع لجولتين من التكاثر غير الجنسي - وهي عملية تسمى merogony. خلال merogony، نوع I meronts تطوير التي تحتوي على ثمانية merozoites التي يتم تحريرها لغزو خلايا جديدة. هذه merozoites غزو خلايا جديدة لتطوير إلى نوع 2 meronts تحتوي على أربعة merozoites. هذه merozoites، عندما صدر، تصيب الخلايا وتتطور إلى macrogamonts وmicrogamonts. يتم تحرير Microgametes وتخصيب الماكروجاميتس إنتاج الزيجوت التي تنضج في oocysts. يتم إطلاق الخراجات الناضجة في وقت لاحق في التجويف. الخراجات هي إما رقيقة الجدران التي excyst على الفور لإعادة تطهير ظهارة، أو سميكة الجدران التي يتم تحريرها في البيئة لتصيب المضيف المقبل14. وقد تم تحديد جميع مراحل دورة حياة Cryptosporidium في نظام الثقافة العضوية التي وضعت سابقا من قبل مجموعتنا10.
منذ الأعضاء البشرية بصدق تكرار الأنسجة البشرية9،11،13،ودعم جميع المراحل المستنسخة من Cryptosporidium10،فهي نظام زراعة الأنسجة المثالي لدراسة علم الأحياء Cryptosporidium والتفاعلات بين المضيف والطفيلي. هنا نقوم بوصف إجراءات إصابة الأعضاء مع كل من Cryptosporidium oocysts وsporozoites excysted، وعزل oocysts الجديدة المنتجة في هذا النظام زراعة الأنسجة.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>Basement membrane extract (extracellular matrix)</td>
<td>amsbio</td>
<td>3533-010-02</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody)</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>A400FLR-1X</td>
<td>Final Concentration = Use 2-3 drops/slide</td>
</tr>
<tr>
<td>Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>IMS400-20</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dynamag 15 rack</td>
<td>Thermofisher Scientific</td>
<td>12301D</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dynamag 2 rack</td>
<td>Thermofisher Scientific</td>
<td>12321D</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>EMD Millipore&nbsp;Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3&micro;m</td>
<td>EMD-Millipore</td>
<td>TSTP02500</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Fast green dye</td>
<td>SIGMA</td>
<td>F7252-5G&nbsp;&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Femtojet 4i Microinjector</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5252000013</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass capillaries of 1 mm diameter</td>
<td>WPI</td>
<td>TW100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Matrigel (extracellular matrix)</td>
<td>Corning</td>
<td>356237</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Microfuge tube 1.5ml</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>T9661-1000EA</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro-loader tips</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>612-7933</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Micropipette puller P-97</td>
<td>Shutter instrument</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Normal donkey Serum</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>C06SB</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Penstrep</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium hypoclorite (use 5%)</td>
<td>Clorox</td>
<td>50371478</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Super stick slides</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>S100-3</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Swinnex-25 47mm Polycarbonate filter holder</td>
<td>EMD-Millipore</td>
<td>SX0002500</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Taurocholic acid sodium salt hydrate</td>
<td>SIGMA</td>
<td>T4009-5G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Tween-20</td>
<td>Merck</td>
<td>8221840500</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Vectashield mounting agent</td>
<td>Vector Labs</td>
<td>H-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Vortex Genie 2</td>
<td>Scientific industries, Inc</td>
<td>SI0236</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Final amount</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12634-010</td>
<td>500ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Penstrep</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>5ml of stock in 500ml DMEM</td>
</tr>
<tr>
<td>Glutamax</td>
<td>Gibco</td>
<td>35050038</td>
<td>5ml of stock in 500ml DMEM</td>
</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
<td>Gibco</td>
<td>15630056</td>
<td>5ml of stock in 500ml DMEM</td>
</tr>
<tr>
<td> INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>A83-01</td>
<td>Tocris</td>
<td>2939-50mg</td>
<td>0.5&micro;M</td>
</tr>
<tr>
<td>Adv+++</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>make upto 100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>B27</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504044</td>
<td>1X</td>
</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
<td>Peprotech</td>
<td>AF-100-15</td>
<td>50ng/mL</td>
</tr>
<tr>
<td>Gastrin</td>
<td>Tocris</td>
<td>3006-1mg</td>
<td>10 nM</td>
</tr>
<tr>
<td>NAC</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9125-25G</td>
<td>1.25mM</td>
</tr>
<tr>
<td>NIC</td>
<td>Sigma</td>
<td>N0636-100G</td>
<td>10mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Noggin CM</td>
<td>In house*</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10%</td>
</tr>
<tr>
<td>P38 inhibitor (SB202190)</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7076-25 mg</td>
<td>10&micro;M</td>
</tr>
<tr>
<td>PGE2</td>
<td>Tocris</td>
<td>2296/10</td>
<td>10 nM</td>
</tr>
<tr>
<td>Primocin</td>
<td>InvivoGen</td>
<td>ant-pm-1</td>
<td>1ml/500ml media</td>
</tr>
<tr>
<td>RSpoI CM</td>
<td>In house*</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>20%</td>
</tr>
<tr>
<td>Wnt3a CM</td>
<td>In house*</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>50%</td>
</tr>
<tr>
<td>In house* - cell lines will be provided upon request</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME)</td>
</tr>
<tr>
<td>LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Adv+++</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>make upto 100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>ALK-I A83-01</td>
<td>Tocris</td>
<td>2939-50mg</td>
<td>500nM</td>
</tr>
<tr>
<td>B27</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504044</td>
<td>0.0763888889</td>
</tr>
<tr>
<td>FGF-10</td>
<td>Peprotech</td>
<td>100-26</td>
<td>100ng/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>FGF-7</td>
<td>Peprotech</td>
<td>100-19</td>
<td>25ng/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>N-Acetylcysteine</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9125-25G</td>
<td>1.25mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Nicotinamide</td>
<td>Sigma</td>
<td>N0636-100G</td>
<td>5mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Noggin UPE</td>
<td>U-Protein Express</td>
<td>Contact company directly</td>
<td>10%</td>
</tr>
<tr>
<td>p38 MAPK-I</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7076-25 mg</td>
<td>1&micro;M</td>
</tr>
<tr>
<td>Primocin</td>
<td>InvivoGen</td>
<td>ant-pm-1</td>
<td>1:500</td>
</tr>
<tr>
<td>RhoKI Y-27632</td>
<td>Abmole Bioscience</td>
<td>M1817_100 mg</td>
<td>2.5&micro;m</td>
</tr>
<tr>
<td>Rspo UPE</td>
<td>U-Protein Express</td>
<td>Contact company directly</td>
<td>10%</td>
</tr>
<tr>
<td>Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>L-Glutathione reduced</td>
<td>Sigma</td>
<td>G4251-10MG</td>
<td>0.5 &mu;g/&mu;l of OME/OMD/LOM</td>
</tr>
<tr>
<td>Betaine</td>
<td>Sigma</td>
<td>61962</td>
<td>0.5 &mu;g/&mu;l of OME/OMD/LOM</td>
</tr>
<tr>
<td>L-Cysteine</td>
<td>Sigma</td>
<td>168149-2.5G</td>
<td>0.5 &mu;g/&mu;l of OME/OMD/LOM</td>
</tr>
<tr>
<td>Linoleic acid</td>
<td>Sigma</td>
<td>L1376-10MG</td>
<td>6.8 &mu;g/ml of OME/OMD /LOM</td>
</tr>
<tr>
<td>Taurine</td>
<td>Sigma</td>
<td>T0625-10MG</td>
<td>0.5 &mu;g/&mu;l of OME/OMD/LOM</td>
</tr>
<tr>
<td>Blocking buffer (for immunoflourescence staining)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Donkey/Goat serum</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>C06SB</td>
<td>2%</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>70011044</td>
<td>Make upto 100ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>Merck</td>
<td>P1379</td>
<td>0.1%</td>
</tr>
<tr>
<td>List of Antibodies used </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa 568 goat anti-rabbit</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A-11011</td>
<td>Dilution-1:500; RRID: AB_143157</td>
</tr>
<tr>
<td>Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>A400FLK</td>
<td>Dilution- 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>IMS400-20</td>
<td>Dilution-1:500</td>
</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D1306</td>
<td>Dilution-1:1000; RRID : AB_2629482</td>
</tr>
<tr>
<td>Phalloidin-Alexa 674</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A22287</td>
<td>Dilution-1:1000; RRID: AB_2620155</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O'Connor (co-author).</td>
<td>Upon request</td>
<td>Upon request</td>
<td>Dilution-1:500</td>
</tr>
<tr>
<td>Sporo-Glo</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>A600FLR-1X</td>
<td>Dilution- 1:200</td>
</tr>
</tbody>
</table>

studying cryptosporidium infection in 3d tissue-derived human organoid culture systems by microinjection

Cryptosporidium parvum هو واحد من الأسباب الرئيسية لمرض الإسهال البشري. لفهم أمراض الطفيلي وتطوير الأدوية الفعالة ، هناك حاجة إلى نظام زراعة في المختبر يلخص الظروف في المضيف. الأعضاء، التي تشبه إلى حد كبير الأنسجة من أصلها، مثالية لدراسة التفاعلات بين المضيف والطفيلي. الأعضاء هي هياكل ثلاثية الأبعاد مشتقة من الأنسجة مشتقة من الخلايا الجذعية للبالغين وتنمو في الثقافة لفترات طويلة من الزمن دون أن تتعرض لأي انحراف وراثي أو تحول. لديهم القطبية محددة جيدا مع كل من الأسطح البهيجة وbasolateral. الأعضاء لديها تطبيقات مختلفة في اختبار المخدرات، والأعمال المصرفية الحيوية، ونمذجة الأمراض ودراسات التفاعل بين المضيف والميكروبات. هنا نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لكيفية إعداد oocysts وsporozoites من Cryptosporidium لإصابة الأمعاء البشرية والجهاز الهوائي. ثم نبين كيف يمكن استخدام الحقن المجهري لحقن الميكروبات في التجويف العضوي. هناك ثلاث طرق رئيسية يمكن من خلالها استخدام الأعضاء في دراسات التفاعل بين المضيف والميكروبات - الحقن المجهري، القص الميكانيكي والطلاء، وعن طريق صنع الطبقات الأحادية. الحقن المجهري يتيح الحفاظ على هيكل 3D ويسمح للسيطرة الدقيقة على أحجام الطفيليات والاتصال الجانبي apical مباشرة للميكروبات. نحن نقدم تفاصيل للنمو الأمثل للأعضاء إما التصوير أو إنتاج الكيسة. وأخيرا، ونحن نبين أيضا كيف يمكن عزل oocysts ولدت حديثا من الجهازية لمزيد من المعالجة النهائية والتحليل.

البروتوكولات المعروضة هنا تؤدي إلى تنقية فعالة من الخراجات وsporozoites(الشكل 1A)على استعداد للحقن الدقيق. يؤدي بروتوكول excystation إلى إطلاق sporozoites من حوالي 70-80٪ من الخراجات، وبالتالي فمن الضروري تصفية الخراجات والقذائف المتبقية من خلال مرشح 3 ميكرومتر. نتائج الترشيح في ما يقرب من 10...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection at JoVE.com

Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection

نحن نصف بروتوكولات لإعداد oocysts وتنقية sporozoites لدراسة العدوى من أجهزة الجهاز الهضمي والهواء البشري من قبل Cryptosporidium parvum. نقوم بتوضيح إجراءات الحقن المجهري للطفيليات في تجويف الأعضاء المعوية وتلطيخ المناعة من الأعضاء. وأخيرا، ونحن نصف عزل ة الخراجات المتولدة من الأعضاء.

دراسة عدوى Cryptosporidium في أنظمة الثقافة العضوية البشرية المشتقة من الأنسجة ثلاثية الدناطية عن طريق الحقن المجهري

Cryptosporidium parvum is one of the major causes of human diarrheal disease. To understand the pathology of the parasite and develop efficient drugs, an ...

باستخدام هذا تنقية sporozoite والإجراءات الحقن المجهري، أساسا أي ميكروب مضيف يمكن دراسته في أي نظام الجهاز المستمدة من الأنسجة. باستخدام هذه التقنية، يمكننا التحكم في كمية الـ sporozoites النقية المحقونة في تجويف الأعضاء أو الجانب العضلي من الجهاز العضوي. لتنقية سي بارفوم sporozoites، نقل البويضة إلى أنبوب 15 ملليلتر و resuspend الخلايا في مرة واحدة 10 إلى بويضية السابعة لكل ملليلتر التركيز المتوسط excystation.بعد 60 إلى 90 دقيقة في 37 درجة مئوية، مزيج 14 ملليلتر من محلول الغسيل المناسب مع البويضات، ورواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي. التعرق بعناية لتجنب فقدان البويضات و resuspend بيليه sporozoic في ثلاث مرات 10 إلى البويضة السابعة لكل واحد إلى مليلتر اثنين من تركيز DMEM. لإزالة أي بويضات وقذائف متبقية، ضع برميل حقنة 10 ملليلتر مجهز بجهاز حامل مرشح 47 ملليلتر مزود بمصفح بولي كربونات بحجم ثلاثة ميكرومتر في أنبوب 15 ملليلتر عند أربع درجات مئوية.إضافة 7.5 ملليلتر من تعليق sporozoite إلى تجميع التصفية. عندما تم تمرير وحدة التخزين بأكملها من خلال مصفاة من الجاذبية، وغسل أي الخلايا المتبقية من خلال مصفاة مع آخر 7.5 ملليلتر من DMEM. عندما مرت كل من غسل من خلال مصفاة، وجمع تعليق sporozoite المصفاة عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق وتسمية بيليه في 50 إلى 100 ميكرولترات من متوسطة الثقافة العضوية المناسبة، وتستكمل مع 0.05٪ صبغة خضراء سريعة، وL-الجلوتاثيون، بيتاين، L-سيستين، حمض اللينوليك، والتورين التي تحتوي على الحد من العازلة.لmicroinject الطفيليات في الجانب apical من organoid 3D ، استخدم أولا سحب micropipette لإعداد الشعيرات الدموية حقن الزجاج. استخدام ملقط لقطع غيض من شعرية إلى قطر 9 إلى 12 ميكرومتر لتمكين تدفق سهل من sporozoites أو oocysts، إذا اخترت لحقن البويضات مباشرة، واستخدام نصائح اللودر الصغير لملء كل شعري مع صبغة خضراء سريعة المسمى تعليق oocyst أو sporozoite. ثم، تحميل الشعرية الأولى المملوءة sporozoite في مجهر واستخدام المجهر المقلوب في التكبير 5x وضغط مستمر لmicroinject 100 إلى 200 نانولترات من التعليق في كل organoid.ينتج عن بروتوكول excystation إصدار sporozoites من حوالي 70 إلى 80٪ من البويضات. ولذلك، فمن الضروري لتصفية قذائف البويضة المتبقية من خلال الترشيح ثلاثة ميكرومتر. إزالة ما يقرب من 100٪ من البويضات غير مفزّة.وعلاوة على ذلك، إضافة صبغة خضراء يساعد على ضمان حقن جميع organoids، ويسمح التصور من organoids حقن لمدة 24 ساعة على الأقل بعد الحقن. على الرغم من أن هذه طريقة جيدة الممارسة، يمكن استخدام المجهر الإلكتروني المسح الضوئي لضمان أن عملية excystation لم تلحق الضرر sporozoites أو البويضات. حقن كميات متساوية من البويضات في تجويف organoid يمكن أن تؤكد بصريا عن طريق التصوير المجهري بسيطة.يمكن أيضًا استخدام مقايسات الفلور المناعية لاستكشاف أنواع الخلايا المصابة بواسطة Cryptosporidium. بعد إصابة الأعضاء المختلفة لمدة خمسة أيام ، يمكن تأكيد وجود sporozoites داخل البويضات عن طريق تجفيف جزء من البويضات على شريحة لاصقة ، وتحديد البويضات مع الميثانول ، والجمع بين تلطيخ DAPI مع جسم مضاد مناسب خاص بالبويضات. للحصول على أقصى النتائج، استخدم البويضات الطازجة، واستخدم نفس الشعيرات الدموية لجميع الحقن، وغير الوسائط كل يوم بعد الحقن.باستخدام هذه التقنية ، بدأت مختبرات مختلفة الآن في استخدام الأجهزة لدراسة تفاعلات الميكروب المضيف. نحن ندرس commensals وكذلك مسببات الأمراض الأخرى في إعدادات الزراعة الدقيقة العضوية مماثلة. بما أن Cryptosporidium هو طفيلي بشري ، فمن المهم إجراء هذه التجارب وفقًا للوائح السلامة من المستوى 2.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

التهاب القرنية العقبولي المتكررة اللحمية في الفئران، وهذا نموذج لدراسة الإنسان HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

تقييم الفطرية الاستشعار من HIV-1 CD4 المصابة<sup&gt; +</sup&gt; T الخلايا عن طريق الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل باستخدام<em&gt; خارج الحي</em&gt; المشارك ثقافة النظام.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Organoids كنموذج للأمراض المعدية: ثقافة الإنسان وOrganoids المعدة الفئران وهيليكوباكتر بيلوري Microinjection من

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

الفأر والإنسان-المستمدة من الثقافة أساسي أحادي الطبقة الظهارية المعدة لدراسة تجديد

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

التحديد الكمي افيروسيتوسيس بالفحص المجهري Fluorescence خلية واحدة

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

قياس فيروس حمى الدنج الجيش الملكي النيبالي في المادة طافية الثقافة من الخلايا المصابة بسلسلة البلمرة الكمية في الوقت الحقيقي

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

تحليل التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية باستخدام أنظمة تخمير الحمام في المختبر

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

تنقية عالية الغلة الاستعدادات الحويصلة خارج الخلية بعيدا عن الفيروس

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

عدوي المكورات الرئوية من خلايا بطانة الإنسان الاساسيه في التدفق المستمر

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

قياس كثرة الفندره من الرشاشيات تبخير كونيديا من قبل الكريات البيضاء البشرية باستخدام تدفق الخلوي

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...