Name: studying cryptosporidium infection in 3d tissue-derived human organoid culture systems by microinjection
Uploaded: 2019-09-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection at JoVE.com

Vi er taknemmelige for Deborah A. Schaefer fra School of Animal og komparative Biomedical Sciences, College of Agriculture and Life Sciences, University of Arizona, Tucson, AZ, USA for at hjælpe os med oocysttal produktion og analyse. Vi takker også Franceschi Microscopy og Imaging Center og D.L. Mullendore på Washington State University for TEM forberedelse og billeddannelse af isolerede organoid oocyster.
D.D. er modtager af et VENI-stipendium fra den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (NWO-ALW, 016. Veni. 171.015). I.H. er modtager af et VENI-stipendium fra den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (NWO-ALW, 863.14.002) og blev støttet af Marie Curie-stipendier fra Europa-Kommissionen (forslag 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF). Den forskning, der førte til disse resultater, har modtaget støtte fra Det Europæiske Forskningsråd under EFR'S avancerede tilskudsaftale nr. 67013 og fra NIH NIAIH under R21 AT009174 til RMO. Dette arbejde er en del af Oncode Institute, som delvis finansieres af det hollandske Cancer selskab og blev finansieret af et stipendium fra det hollandske Cancer selskab.

Al vævs håndtering og resektion blev udført under de godkendte protokoller for institutionel revision (IRB) med patientens samtykke.
1. klargøring af C. at oocyster til injektion
Bemærk: Cryptosporidium oocyster blev købt fra en kommerciel kilde (Se tabellen over materialer). Disse oocyster produceres i kalve og opbevares i fosfat-bufferet saltvand (PBS) med antibiotika. De kan opbevares i ca. 3 måneder ved 4 ...

<ol>
	<li>Checkley, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+global+burden,+novel+diagnostics,+therapeutics,+and+vaccine+targets+for+Cryptosporidium.">A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium.</a> The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).</li><li>Bones, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past+and+future+trends+of+Cryptosporidium+in+vitro+research.">Past and future trends of Cryptosporidium in vitro research.</a> Experimental Parasitology. 196, 28-37 (2018).</li><li>Muller, J., Hemphill, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+systems+for+the+study+of+apicomplexan+parasites+in+farm+animals.">In vitro culture systems for the study of apicomplexan parasites in farm animals.</a> International Journal for Parasitology. 43 (2), 115-124 (2013).</li><li>Karanis, P., Aldeyarbi, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Cryptosporidium+in+vitro+culture.">Evolution of Cryptosporidium in vitro culture.</a> International Journal for Parasitology. 41 (12), 1231-1242 (2011).</li><li>Morada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+culture+of+Cryptosporidium+parvum+using+hollow+fiber+technology.">Continuous culture of Cryptosporidium parvum using hollow fiber technology.</a> International Journal for Parasitology. 46 (1), 21-29 (2016).</li><li>DeCicco RePass, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Bioengineered+Three-Dimensional+Human+Intestinal+Model+for+Long-Term+Infection+of+Cryptosporidium+parvum.">Novel Bioengineered Three-Dimensional Human Intestinal Model for Long-Term Infection of Cryptosporidium parvum.</a> Infection and Immunity. 85 (3), (2017).</li><li>Miller, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+culture+platform+for+Cryptosporidium+that+enables+long-term+cultivation+and+new+tools+for+the+systematic+investigation+of+its+biology.">A cell culture platform for Cryptosporidium that enables long-term cultivation and new tools for the systematic investigation of its biology.</a> International Journal for Parasitology. 48 (3-4), 197-201 (2018).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modelling.">Long-term expanding human airway organoids for disease modelling.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Dutta, D., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+to+study+host-pathogen+interactions.">Organoid culture systems to study host-pathogen interactions.</a> Current Opinion in Immunology. 48, 15-22 (2017).</li><li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+Cryptosporidium+infection+in+human+small+intestinal+and+lung+organoids.">Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids.</a> Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+Modeling+in+Stem+Cell-Derived+3D+Organoid+Systems.">Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>O'Hara, S. P., Chen, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+Cryptosporidium+infection.">The cell biology of Cryptosporidium infection.</a> Microbes and Infection. 13 (8-9), 721-730 (2011).</li><li>Lendner, M., Daugschies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptosporidium+infections:+molecular+advances.">Cryptosporidium infections: molecular advances.</a> Parasitology. 141 (11), 1511-1532 (2014).</li><li>Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acids+enhance+invasiveness+of+Cryptosporidium+spp.+into+cultured+cells.">Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells.</a> Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).</li><li>O'Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Cpgp40/15+in+Toxoplasma+gondii:+a+surrogate+system+for+the+study+of+Cryptosporidium+glycoprotein+antigens.">Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens.</a> Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).</li><li>Wilke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+Antibodies+to+Intracellular+Stages+of+Cryptosporidium+parvum+Define+Life+Cycle+Progression+In+Vitro.">Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro.</a> mSphere. 3 (3), (2018).</li><li>Vinayak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modification+of+the+diarrhoeal+pathogen+Cryptosporidium+parvum.">Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum.</a> Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).</li><li>Dijkstra, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Tumor-Reactive+T+Cells+by+Co-culture+of+Peripheral+Blood+Lymphocytes+and+Tumor+Organoids.">Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids.</a> Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).</li></ol>

Kultur af Cryptosporidium parasitter i tarm og luftvejs organoider giver en præcis model til at studere vært-parasisite interaktioner10 men også har mange andre applikationer. For eksempel, nuværende metoder til udvælgelse og formeringsmateriale genetisk modificerede Cryptosporidium parasitter kræver passage i mus19 , som ikke tillader isolering af parasitter, der har ændringer afgørende for in vivo infektion. Organoid kultur af Cryptosporidium...

Udvikling af lægemidler eller vacciner til behandling og forebyggelse af Cryptosporidium infektion er blevet hæmmet af manglen på in vitro-systemer, der præcist efterligner in vivo situationen i mennesker1,2. Mange af de i øjeblikket tilgængelige systemer enten kun tillader kortvarig infektion (< 5 dage) eller ikke understøtter den komplette livscyklus af parasiten3,4. Andre systemer, der muliggør en fuldstændig udvikling af parasitten, er baseret på immortaliserede cellelinjer eller Cancer cellelinjer, som ikke trofast gengør den fysiologiske situation i mennesker5,6,7 . Organoider eller ' mini-organer ' er 3D væv afledte strukturer, der dyrkes i en ekstracellulær matrix suppleret med forskellige vævsspecifikke vækstfaktorer. Organoider er udviklet fra forskellige organer og væv. De er genetisk stabile og rekapitulerer de fleste funktioner i organerne af deres oprindelse, og kan opretholdes i kulturen i længere tid. Vi har udviklet en metode til at inficere humane tarm-og lunge organoider med Cryptosporidium , der giver en nøjagtig in vitro-model til studiet af vært-parasisite interaktioner relevante for tarm og respiratorisk Cryptosporidiose8 ,9,10,11,12,13. I modsætning til andre offentliggjorte kultur modeller, er organoid-systemet repræsentativt for den virkelige værts parasitator interaktion, giver mulighed for færdiggørelse af livscyklus, således at alle stadier af parasitens livscyklus kan undersøgt, og opretholder parasisite formering i op til 28 dage10.
Cryptosporidium at er en apicomplexan parasisite, der inficerer epitel af de respiratoriske og intestinale skrifter, forårsager langvarig diarré sygdom. Den resistente miljømæssige fase er oocyst, findes i forurenet mad og vand14. Når det indtages eller inhaleres, oocysten excysts og frigiver fire sporozoiter, der binder sig til epiteliale celler. Sporozoiter glide på værter celler og engagere Host celle receptorer, men parasit ikke fuldt invadere cellen, og synes at inducere værten cellen til at opsluge det15. Parasitet, som er internaliseret i et intracellulært, men extracytoplasmic rum, forbliver på den apikale overflade af cellen, replikerer inden for en parasitophorous vakuole. Det gennemgår to runder af aseksuelle reproduktion-en proces kaldet merogony. Under merogony, type I meronts udvikle som indeholder otte merozoiter, der er frigivet til at invadere nye celler. Disse merozoiter invaderer nye celler for at udvikle sig til type II-meronter, der indeholder fire merozoiter. Disse merozoiter, når de frigives, inficere celler og udvikle sig til makro gamonter og mikrogamonter. Mikrogameter frigives og befrugte makrogametes, der producerer zygoter, som modnes til oocyster. Modne oocyster frigives efterfølgende i lumen. Oocyster er enten tyndvæggede, som umiddelbart excyst at reinficere Epitelet, eller tyk walled, som er frigivet i miljøet for at inficere den næste vært14. Alle stadier af Cryptosporidium livscyklus er blevet identificeret i organoid kultur system tidligere udviklet af vores gruppe10.
Da humane organoider trofast replikerer humane væv9,11,13og understøtter alle replikerende stadier af Cryptosporidium10, er de det ideelle vævskultur system til at studere Cryptosporidium biologi og vært-parasisite interaktioner. Her beskriver vi procedurerne for inficering af organoider med både Cryptosporidium oocyster og excysted sporozoiter og isolering af de nye oocyster, der produceres i dette vævskultur system.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>Basement membrane extract (extracellular matrix)</td>
<td>amsbio</td>
<td>3533-010-02</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody)</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>A400FLR-1X</td>
<td>Final Concentration = Use 2-3 drops/slide</td>
</tr>
<tr>
<td>Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>IMS400-20</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dynamag 15 rack</td>
<td>Thermofisher Scientific</td>
<td>12301D</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dynamag 2 rack</td>
<td>Thermofisher Scientific</td>
<td>12321D</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>EMD Millipore&nbsp;Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3&micro;m</td>
<td>EMD-Millipore</td>
<td>TSTP02500</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Fast green dye</td>
<td>SIGMA</td>
<td>F7252-5G&nbsp;&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Femtojet 4i Microinjector</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5252000013</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass capillaries of 1 mm diameter</td>
<td>WPI</td>
<td>TW100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Matrigel (extracellular matrix)</td>
<td>Corning</td>
<td>356237</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Microfuge tube 1.5ml</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>T9661-1000EA</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro-loader tips</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>612-7933</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Micropipette puller P-97</td>
<td>Shutter instrument</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Normal donkey Serum</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>C06SB</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Penstrep</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium hypoclorite (use 5%)</td>
<td>Clorox</td>
<td>50371478</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Super stick slides</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>S100-3</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Swinnex-25 47mm Polycarbonate filter holder</td>
<td>EMD-Millipore</td>
<td>SX0002500</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Taurocholic acid sodium salt hydrate</td>
<td>SIGMA</td>
<td>T4009-5G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Tween-20</td>
<td>Merck</td>
<td>8221840500</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Vectashield mounting agent</td>
<td>Vector Labs</td>
<td>H-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Vortex Genie 2</td>
<td>Scientific industries, Inc</td>
<td>SI0236</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Final amount</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12634-010</td>
<td>500ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Penstrep</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>5ml of stock in 500ml DMEM</td>
</tr>
<tr>
<td>Glutamax</td>
<td>Gibco</td>
<td>35050038</td>
<td>5ml of stock in 500ml DMEM</td>
</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
<td>Gibco</td>
<td>15630056</td>
<td>5ml of stock in 500ml DMEM</td>
</tr>
<tr>
<td> INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>A83-01</td>
<td>Tocris</td>
<td>2939-50mg</td>
<td>0.5&micro;M</td>
</tr>
<tr>
<td>Adv+++</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>make upto 100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>B27</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504044</td>
<td>1X</td>
</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
<td>Peprotech</td>
<td>AF-100-15</td>
<td>50ng/mL</td>
</tr>
<tr>
<td>Gastrin</td>
<td>Tocris</td>
<td>3006-1mg</td>
<td>10 nM</td>
</tr>
<tr>
<td>NAC</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9125-25G</td>
<td>1.25mM</td>
</tr>
<tr>
<td>NIC</td>
<td>Sigma</td>
<td>N0636-100G</td>
<td>10mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Noggin CM</td>
<td>In house*</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10%</td>
</tr>
<tr>
<td>P38 inhibitor (SB202190)</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7076-25 mg</td>
<td>10&micro;M</td>
</tr>
<tr>
<td>PGE2</td>
<td>Tocris</td>
<td>2296/10</td>
<td>10 nM</td>
</tr>
<tr>
<td>Primocin</td>
<td>InvivoGen</td>
<td>ant-pm-1</td>
<td>1ml/500ml media</td>
</tr>
<tr>
<td>RSpoI CM</td>
<td>In house*</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>20%</td>
</tr>
<tr>
<td>Wnt3a CM</td>
<td>In house*</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>50%</td>
</tr>
<tr>
<td>In house* - cell lines will be provided upon request</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME)</td>
</tr>
<tr>
<td>LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Adv+++</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>make upto 100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>ALK-I A83-01</td>
<td>Tocris</td>
<td>2939-50mg</td>
<td>500nM</td>
</tr>
<tr>
<td>B27</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504044</td>
<td>0.0763888889</td>
</tr>
<tr>
<td>FGF-10</td>
<td>Peprotech</td>
<td>100-26</td>
<td>100ng/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>FGF-7</td>
<td>Peprotech</td>
<td>100-19</td>
<td>25ng/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>N-Acetylcysteine</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9125-25G</td>
<td>1.25mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Nicotinamide</td>
<td>Sigma</td>
<td>N0636-100G</td>
<td>5mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Noggin UPE</td>
<td>U-Protein Express</td>
<td>Contact company directly</td>
<td>10%</td>
</tr>
<tr>
<td>p38 MAPK-I</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7076-25 mg</td>
<td>1&micro;M</td>
</tr>
<tr>
<td>Primocin</td>
<td>InvivoGen</td>
<td>ant-pm-1</td>
<td>1:500</td>
</tr>
<tr>
<td>RhoKI Y-27632</td>
<td>Abmole Bioscience</td>
<td>M1817_100 mg</td>
<td>2.5&micro;m</td>
</tr>
<tr>
<td>Rspo UPE</td>
<td>U-Protein Express</td>
<td>Contact company directly</td>
<td>10%</td>
</tr>
<tr>
<td>Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>L-Glutathione reduced</td>
<td>Sigma</td>
<td>G4251-10MG</td>
<td>0.5 &mu;g/&mu;l of OME/OMD/LOM</td>
</tr>
<tr>
<td>Betaine</td>
<td>Sigma</td>
<td>61962</td>
<td>0.5 &mu;g/&mu;l of OME/OMD/LOM</td>
</tr>
<tr>
<td>L-Cysteine</td>
<td>Sigma</td>
<td>168149-2.5G</td>
<td>0.5 &mu;g/&mu;l of OME/OMD/LOM</td>
</tr>
<tr>
<td>Linoleic acid</td>
<td>Sigma</td>
<td>L1376-10MG</td>
<td>6.8 &mu;g/ml of OME/OMD /LOM</td>
</tr>
<tr>
<td>Taurine</td>
<td>Sigma</td>
<td>T0625-10MG</td>
<td>0.5 &mu;g/&mu;l of OME/OMD/LOM</td>
</tr>
<tr>
<td>Blocking buffer (for immunoflourescence staining)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Donkey/Goat serum</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>C06SB</td>
<td>2%</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>70011044</td>
<td>Make upto 100ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>Merck</td>
<td>P1379</td>
<td>0.1%</td>
</tr>
<tr>
<td>List of Antibodies used </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa 568 goat anti-rabbit</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A-11011</td>
<td>Dilution-1:500; RRID: AB_143157</td>
</tr>
<tr>
<td>Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>A400FLK</td>
<td>Dilution- 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>IMS400-20</td>
<td>Dilution-1:500</td>
</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D1306</td>
<td>Dilution-1:1000; RRID : AB_2629482</td>
</tr>
<tr>
<td>Phalloidin-Alexa 674</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A22287</td>
<td>Dilution-1:1000; RRID: AB_2620155</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O'Connor (co-author).</td>
<td>Upon request</td>
<td>Upon request</td>
<td>Dilution-1:500</td>
</tr>
<tr>
<td>Sporo-Glo</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>A600FLR-1X</td>
<td>Dilution- 1:200</td>
</tr>
</tbody>
</table>

studying cryptosporidium infection in 3d tissue-derived human organoid culture systems by microinjection

Cryptosporidium at er en af de vigtigste årsager til menneskelig diarré sygdom. At forstå patologi af parasitten og udvikle effektive lægemidler, et in vitro-kultur system, der rekapitulerer betingelserne i værten er nødvendig. Organoider, der ligner væv i deres oprindelse, er ideelle til at studere vært-parasisite interaktioner. Organoider er tredimensionale (3D) væv-afledte strukturer, som er afledt af voksne stamceller og vokse i kultur i længere perioder uden at gennemgå nogen genetisk aberration eller omdannelse. De har veldefinerede polaritet med både apikale og basolaterale overflader. Organoider har forskellige anvendelser i dopingtest, bio Banking, og sygdoms modellering og Host-Microbe interaktionsstudier. Her præsenterer vi en trin-for-trin protokol om, hvordan man forbereder oocyster og sporozoiter af Cryptosporidium til at inficere menneskelige tarm og luftvejene organoider. Vi viser derefter, hvordan mikroinjektion kan bruges til at injicere mikrober i organoid lumen. Der er tre vigtige metoder, som organoider kan bruges til Host-Microbe interaktionsstudier-mikroinjektion, mekanisk klipning og plating, og ved at gøre monolayers. Mikroinjektion muliggør vedligeholdelse af 3D-strukturen og giver mulighed for præcis kontrol af parasitisk volumen og direkte apikale side kontakt for mikroberne. Vi giver detaljer for optimal vækst af organoider til enten billeddannelse eller oocysttal produktion. Endelig viser vi også, hvordan de nyligt genererede oocyster kan isoleres fra organoid til yderligere downstream-behandling og analyse.

De protokoller, der præsenteres her, resulterer i en effektiv rensning af oocyster og sporozoiter (figur 1a) klar til mikroinjektion. Excystations protokollen resulterer i frigivelse af sporozoiter fra ca. 70 – 80% af oocysterne, derfor er det vigtigt at filtrere de resterende oocyster og skaller gennem et 3 μm filter. Filtrering resulterer i næsten 100% sporozoite rensning (figur 1b). Desuden er tilsætning af et grønt farvestof med til at sikre injektion...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection at JoVE.com

Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection

Vi beskriver protokoller til at forberede oocyster og rense sporozoiter til at studere infektion af humane tarm og luftvejs organoider af Cryptosporidium parvum. Vi demonstrerer procedurerne for mikroinjektion af parasitter i tarm organoid lumen og immun farvning af organoider. Endelig beskriver vi isolationen af genererede oocyster fra organoiderne.

Studere Cryptosporidium infektion i 3D vævs-afledte humane Organoid kultur systemer ved mikroinjektion

Cryptosporidium parvum is one of the major causes of human diarrheal disease. To understand the pathology of the parasite and develop efficient drugs, an ...

Ved hjælp af denne sporozoite rensning og mikroinjektion procedure, hovedsagelig enhver vært mikrobe kan studeres i ethvert væv-afledt organ system. Ved hjælp af denne teknik, kan vi kontrollere mængden af rene sporozoitter injiceres i organoid lumen eller den apikale side af organoid. For at rense C.parvum sporozoitter, overføre oocyst til en 15-milliliter rør og resuspend cellerne på en gang 10 til den syvende oocyst per milliliter udcystation medium koncentration.Efter 60 til 90 minutter ved 37 grader Celsius blandes 14 milliliter af en passende vaskeopløsning med oocystene og sedimenteres cellerne ved centrifugering. Inspirer supernatanten omhyggeligt for at undgå at miste oocysts og opsplitning sporozoic pellet på en tre gange 10 til den syvende oocyst per en til to milliliter DMEM koncentration. For at fjerne eventuelle resterende oocysts og skaller, placere en 10-milliliter sprøjte tønde udstyret med en 47-milliliter filterholder apparat udstyret med en tre-mikrometer pore størrelse polycarbonat filter i en 15-milliliter rør ved fire grader Celsius.Der tilsættes 7,5 milliliter sporozoitesuspension til filtersamlingen. Når hele volumen er passeret gennem semælten ved tyngdekraften, vaskes eventuelle resterende celler gennem semerne med yderligere 7,5 milliliter DMEM. Når al vask er passeret gennem sien, indsamles den filtrerede sporozoitsuspension ved centrifugering i 10 minutter, og pellet i 50 til 100 mikroliter af et passende organoid kulturmedium, suppleret med 0,05 % hurtigt grønt farvestof, og L-glutathion, betain, L-cystein, linolsyre og taurin, der indeholder reduktionsbuffer.At mikroinject parasitterne ind i den apikale side af en 3D organoid, første brug en mikropipette puller til at forberede glas injektion kapillærer. Brug kraftkker til at skære spidsen af kapillær til en ni til 12 mikrometer diameter for at muliggøre en nem strøm af sporozoitter eller oocysts, hvis du vælger at injicere oocysts direkte, og bruge mikro-loader tips til at fylde hver kapillær med en hurtig grøn farvestof mærket oocyst eller sporozoit suspension. Derefter indlæses den første sporozoitfyldte kapillær i en mikroinjektor, og der anvendes et omvendt mikroskop ved en 5x forstørrelse og et konstant tryk på mikroinject 100 til 200 nanoliters af suspensionen i hvert organoid.Excystation-protokollen resulterer i frigivelse af sporozoitter fra ca. 70 til 80% af oocysts. Derfor er det vigtigt at bortfiltrere de resterende oocyst skaller gennem en tre-mikrometer filtrering. Fjern næsten 100% af de unexcysted oocyster.Desuden er tilsætning af et grønt farvestof hjælper med at sikre injektion af alle de organoider, og giver mulighed for visualisering af de injicerede organoider i mindst 24 timer efter injektionen. Selv om dette er en veloøvet metode, scanning elektronmikroskopi kan bruges til at sikre, at excystation processen ikke skader sporozoitter eller oocysts. Injektion af lige store mængder oocysts i organoid lumen kan visuelt bekræftes ved simpel mikroskopisk billeddannelse.Immunofluorescens assays kan også bruges til at udforske de typer af celler, der er inficeret med Cryptosporidium. Efter de differentierede organoider er blevet inficeret i fem dage, tilstedeværelsen af sporozoitter i oocysts kan bekræftes ved at tørre ned en del af oocysts på en klæbende dias, fastsættelse af oocysts med methanol, og kombinere DAPI farvning med en passende oocyst-specifikke antistof. For at opnå de maksimale resultater skal du bruge friske oocysts, bruge den samme kapillær til alle injektionerne og skifte mediet hver dag efter injektionen.Ved hjælp af denne teknik, forskellige laboratorier er nu begyndt at bruge organoids at studere vært-mikrobe interaktioner. Vi studerer commensals samt andre patogener i lignende organoid mikrokultur indstillinger. Da Cryptosporidium er en menneskelig parasit, er det vigtigt at udføre disse eksperimenter i henhold til niveau 2 sikkerhedsregler.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Tilbagevendende Herpetisk stromal keratitis i Mus, en model for at studere menneskets HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Vurdering af Innate Sensing af HIV-1 inficerede CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-celler ved plasmacytoide dendritiske celler ved hjælp af en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-dyrkningssystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Organoids som model for infektionssygdomme: Kultur i humane og murine mave Organoids og Mikroinjektion af Helicobacter pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

Mus - og menneske-afledte primære gastrisk epitelial éncellelag kultur for studiet af regenerering

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Kvantificering af Efferocytosis af encellede Fluorescens mikroskopi

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

Måling af Dengue Virus RNA i cellekultur Supernatant af inficerede celler ved Real-time kvantitativ Polymerase Chain Reaction

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

Analyse af interaktioner mellem Endobiotika og humant tarm mikrobiota ved hjælp af in vitro-bade fermenterings systemer

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

Rensning af ekstracellulære vesikulære præparater med høj udbytte afstand fra virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Pneumococcus infektion af primære humane endotelceller i konstant flow

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Måling af fagocytose af Aspergillus fumigatus Conidia af humane leukocytter ved hjælp af strømnings cytometri

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...