Name: studying cryptosporidium infection in 3d tissue-derived human organoid culture systems by microinjection
Uploaded: 2019-09-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection at JoVE.com

אנו אסירי תודה לדבורה א. שפר מבית הספר של בעלי חיים ומדעי ביורפואי השוואתי, המכללה לחקלאות ומדעי החיים, אוניברסיטת אריזונה, טוסון, AZ, ארה ב על שסייע לנו עם ייצור וניתוח הoocyst. כמו כן, אנו מודים לגבי מיקרוסקופ ומרכז ההדמיה ו-d. d Mullendore באוניברסיטת וושינגטון לקראת הכנה והדמיה של ציסטות מבודדות של אורגנואיד.
D.D. הוא המקבל של מענק בני מארגון הולנד למחקר מדעי (NWO-ALW, 016.171.015). I.H. הוא המקבל של מענק בני מארגון הולנד למחקר מדעי (NWO-ALW, 863.14.002) ונתמך על ידי מלגות מארי קירי מהוועדה האירופית (הצעה 330571 FP7-אנשים-2012-IIF). המחקר המוביל לתוצאות אלה קיבל מימון ממועצת המחקר האירופית תחת הסכם מתקדם המענק של ERC no. 67013 ו-NIH NIAIH תחת R21 AT009174 כדי RMO. עבודה זו היא חלק ממכון Oncode, אשר ממומן חלקית על ידי האגודה ההולנדית לסרטן ומומן על ידי מענק של האגודה ההולנדית לסרטן.

כל טיפול ברקמות וכריתה בוצעה תחת הלוח סקירה מוסדית (IRB) מאושר פרוטוקולים עם הסכמת המטופל.
1. הכנה של C. parvum אוציסטות עבור הזרקה
הערה: הצפנת הקריפטוספדיום נרכשו ממקור מסחרי (ראה את הטבלה של חומרים). אלה האוציסטות מיוצרים עגלים מאוחסנים ?...

<ol>
	<li>Checkley, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+global+burden,+novel+diagnostics,+therapeutics,+and+vaccine+targets+for+Cryptosporidium.">A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium.</a> The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).</li><li>Bones, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past+and+future+trends+of+Cryptosporidium+in+vitro+research.">Past and future trends of Cryptosporidium in vitro research.</a> Experimental Parasitology. 196, 28-37 (2018).</li><li>Muller, J., Hemphill, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+systems+for+the+study+of+apicomplexan+parasites+in+farm+animals.">In vitro culture systems for the study of apicomplexan parasites in farm animals.</a> International Journal for Parasitology. 43 (2), 115-124 (2013).</li><li>Karanis, P., Aldeyarbi, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Cryptosporidium+in+vitro+culture.">Evolution of Cryptosporidium in vitro culture.</a> International Journal for Parasitology. 41 (12), 1231-1242 (2011).</li><li>Morada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+culture+of+Cryptosporidium+parvum+using+hollow+fiber+technology.">Continuous culture of Cryptosporidium parvum using hollow fiber technology.</a> International Journal for Parasitology. 46 (1), 21-29 (2016).</li><li>DeCicco RePass, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Bioengineered+Three-Dimensional+Human+Intestinal+Model+for+Long-Term+Infection+of+Cryptosporidium+parvum.">Novel Bioengineered Three-Dimensional Human Intestinal Model for Long-Term Infection of Cryptosporidium parvum.</a> Infection and Immunity. 85 (3), (2017).</li><li>Miller, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+culture+platform+for+Cryptosporidium+that+enables+long-term+cultivation+and+new+tools+for+the+systematic+investigation+of+its+biology.">A cell culture platform for Cryptosporidium that enables long-term cultivation and new tools for the systematic investigation of its biology.</a> International Journal for Parasitology. 48 (3-4), 197-201 (2018).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modelling.">Long-term expanding human airway organoids for disease modelling.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Dutta, D., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+to+study+host-pathogen+interactions.">Organoid culture systems to study host-pathogen interactions.</a> Current Opinion in Immunology. 48, 15-22 (2017).</li><li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+Cryptosporidium+infection+in+human+small+intestinal+and+lung+organoids.">Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids.</a> Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+Modeling+in+Stem+Cell-Derived+3D+Organoid+Systems.">Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>O'Hara, S. P., Chen, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+Cryptosporidium+infection.">The cell biology of Cryptosporidium infection.</a> Microbes and Infection. 13 (8-9), 721-730 (2011).</li><li>Lendner, M., Daugschies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptosporidium+infections:+molecular+advances.">Cryptosporidium infections: molecular advances.</a> Parasitology. 141 (11), 1511-1532 (2014).</li><li>Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acids+enhance+invasiveness+of+Cryptosporidium+spp.+into+cultured+cells.">Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells.</a> Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).</li><li>O'Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Cpgp40/15+in+Toxoplasma+gondii:+a+surrogate+system+for+the+study+of+Cryptosporidium+glycoprotein+antigens.">Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens.</a> Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).</li><li>Wilke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+Antibodies+to+Intracellular+Stages+of+Cryptosporidium+parvum+Define+Life+Cycle+Progression+In+Vitro.">Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro.</a> mSphere. 3 (3), (2018).</li><li>Vinayak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modification+of+the+diarrhoeal+pathogen+Cryptosporidium+parvum.">Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum.</a> Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).</li><li>Dijkstra, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Tumor-Reactive+T+Cells+by+Co-culture+of+Peripheral+Blood+Lymphocytes+and+Tumor+Organoids.">Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids.</a> Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).</li></ol>

תרבות של הצפנת הצפנה טפילים במעי ואורגנואידים הנשימה מספק מודל מדויק ללמוד אינטראקציות מארח טפיל10 אבל יש גם יישומים רבים אחרים. לדוגמה, השיטות הנוכחיות של בחירת והפצת הצפנה מהונדסים גנטית טפילים דורשים מעבר בעכברים19 אשר אינו מאפשר בידוד של טפילים כי י?...

התפתחות של תרופות או חיסונים לטיפול ומניעה של הדבקת הצפנה היתה מעכבת היעדר מערכות מבחנה אשר לחקות בדיוק את המצב vivo בבני אדם1,2. רבים מהמערכות הזמינות כעת רק לאפשר זיהום לטווח קצר (< 5 ימים) או לא לתמוך במחזור החיים המלא של הטפיל3,4. מערכות אחרות המאפשרות התפתחות מלאה של הטפיל מבוססים על קווי תאים מונצח או תאים סרטניים שאינם בנאמנות המצב הפיזיולוגי של בני אדם5,6,7 . אורגנואידים או ' מיני איברי ' הם 3D רקמות נגזרות מבנים אשר גדלים במטריצה מתוך החילוץ שנוספו עם רקמות שונות מסוימים הצמיחה גורמים. אורגנואידים פותחו מאיברים שונים ורקמות. הם יציבים מבחינה גנטית ומוארכים את רוב התפקודים של אברי המוצא שלהם, ויכולים להישמר בתרבות לפרקי זמן ארוכים. פיתחנו שיטה לזיהום המעי האנושי והריאות אורגנואידים עם Cryptosporidium המספקת מודל מדויק של מבחנה למחקר של אינטראקציות מארח טפיל רלוונטי מעיים והצפנת הנשימה8 ,9,10,11,12,13. בניגוד לדגמים אחרים של תרבות שפורסמו, מערכת האורגנואיד מייצגת אינטראקציות טפיל מארח של החיים האמיתיים, מאפשרת השלמת מחזור החיים כך שכל השלבים של מחזור החיים הטפיל ניתן ללמוד, ושומר על התפשטות הטפיל עד 28 ימים10.
Cryptosporidium parvum הוא טפיל apicom, אשר מדביק את האפיתל של הנשימה ומעיים שדות, גרימת מחלה diarrheal ממושכת. השלב הסביבתי עמיד הוא oocyst, נמצא מזון מזוהם מים14. לאחר שבלע או שאפה, את הריזוטו ומשחרר ארבעה sporozoites כי לצרף לתאי אפיתל. Sporozoites להחליק על תאים מארחים ולעסוק קולטנים תא מארח, אבל הטפיל לא לפלוש באופן מלא לתא, והוא מופיע כדי לגרום לתא המארח להפרץ15. הטפיל, שהופנמו בתוך תא פנימי, אך ממוכך, נשאר על פני השטח הרשמי של התא, ומשכפל בתוך החללים הפרזיטואטיים. הוא עובר שני סיבובים של רבייה לא-מינית – תהליך הנקרא merogony. במהלך המראווני, הסוג שאני מפתח מפתחים אשר מכילים שמונה merozoites המשוחררים לפלוש לתאים חדשים. אלה merozoites לפלוש תאים חדשים כדי להתפתח סוג II meronts המכיל ארבעה merozoites. Merozoites אלה, כאשר הם משתחררים, להדביק תאים ולהתפתח מאקרוגמונטים ומיקרוגמבטים. מיקרוגיים משתחררים ומדשן את המקגיים המייצרים זיטים שבוגרים לתוך ציסטות. בוגרת האוציסטות משתחררים לאחר מכן לתוך לומן. האוציסטות הן דקות-חומה אשר מיד מייבאות להדביק את האפיתל, או מוקף חומה עבה אשר משתחררים לתוך הסביבה כדי להדביק את המארח הבא14. כל שלבי הצפנת מחזור החיים זוהו במערכת התרבות האורגאידית שפותחה בעבר על ידי הקבוצה שלנו10.
מאז בנאמנות האדם אורגנואידים שכפול רקמות האדם9,11,13, ותמיכה בכל השלבים replicative הצפנה10, הם מערכת התרבות האידיאלית רקמה ללמוד קריפטוספטורידיום ביולוגיה ואינטראקציות מארחים-טפיל. כאן אנו מתארים את ההליכים לזיהום אורגנואידים עם שני ציסטות קריפטוגנטים ו-הצפנה , ובידוד החדש אאוציסטות המיוצר במערכת זו תרבות רקמה.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>Basement membrane extract (extracellular matrix)</td>
<td>amsbio</td>
<td>3533-010-02</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody)</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>A400FLR-1X</td>
<td>Final Concentration = Use 2-3 drops/slide</td>
</tr>
<tr>
<td>Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>IMS400-20</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dynamag 15 rack</td>
<td>Thermofisher Scientific</td>
<td>12301D</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dynamag 2 rack</td>
<td>Thermofisher Scientific</td>
<td>12321D</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>EMD Millipore&nbsp;Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3&micro;m</td>
<td>EMD-Millipore</td>
<td>TSTP02500</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Fast green dye</td>
<td>SIGMA</td>
<td>F7252-5G&nbsp;&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Femtojet 4i Microinjector</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5252000013</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass capillaries of 1 mm diameter</td>
<td>WPI</td>
<td>TW100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Matrigel (extracellular matrix)</td>
<td>Corning</td>
<td>356237</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Microfuge tube 1.5ml</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>T9661-1000EA</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro-loader tips</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>612-7933</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Micropipette puller P-97</td>
<td>Shutter instrument</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Normal donkey Serum</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>C06SB</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Penstrep</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium hypoclorite (use 5%)</td>
<td>Clorox</td>
<td>50371478</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Super stick slides</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>S100-3</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Swinnex-25 47mm Polycarbonate filter holder</td>
<td>EMD-Millipore</td>
<td>SX0002500</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Taurocholic acid sodium salt hydrate</td>
<td>SIGMA</td>
<td>T4009-5G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Tween-20</td>
<td>Merck</td>
<td>8221840500</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Vectashield mounting agent</td>
<td>Vector Labs</td>
<td>H-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Vortex Genie 2</td>
<td>Scientific industries, Inc</td>
<td>SI0236</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Final amount</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12634-010</td>
<td>500ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Penstrep</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>5ml of stock in 500ml DMEM</td>
</tr>
<tr>
<td>Glutamax</td>
<td>Gibco</td>
<td>35050038</td>
<td>5ml of stock in 500ml DMEM</td>
</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
<td>Gibco</td>
<td>15630056</td>
<td>5ml of stock in 500ml DMEM</td>
</tr>
<tr>
<td> INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>A83-01</td>
<td>Tocris</td>
<td>2939-50mg</td>
<td>0.5&micro;M</td>
</tr>
<tr>
<td>Adv+++</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>make upto 100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>B27</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504044</td>
<td>1X</td>
</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
<td>Peprotech</td>
<td>AF-100-15</td>
<td>50ng/mL</td>
</tr>
<tr>
<td>Gastrin</td>
<td>Tocris</td>
<td>3006-1mg</td>
<td>10 nM</td>
</tr>
<tr>
<td>NAC</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9125-25G</td>
<td>1.25mM</td>
</tr>
<tr>
<td>NIC</td>
<td>Sigma</td>
<td>N0636-100G</td>
<td>10mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Noggin CM</td>
<td>In house*</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10%</td>
</tr>
<tr>
<td>P38 inhibitor (SB202190)</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7076-25 mg</td>
<td>10&micro;M</td>
</tr>
<tr>
<td>PGE2</td>
<td>Tocris</td>
<td>2296/10</td>
<td>10 nM</td>
</tr>
<tr>
<td>Primocin</td>
<td>InvivoGen</td>
<td>ant-pm-1</td>
<td>1ml/500ml media</td>
</tr>
<tr>
<td>RSpoI CM</td>
<td>In house*</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>20%</td>
</tr>
<tr>
<td>Wnt3a CM</td>
<td>In house*</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>50%</td>
</tr>
<tr>
<td>In house* - cell lines will be provided upon request</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME)</td>
</tr>
<tr>
<td>LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Adv+++</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>make upto 100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>ALK-I A83-01</td>
<td>Tocris</td>
<td>2939-50mg</td>
<td>500nM</td>
</tr>
<tr>
<td>B27</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504044</td>
<td>0.0763888889</td>
</tr>
<tr>
<td>FGF-10</td>
<td>Peprotech</td>
<td>100-26</td>
<td>100ng/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>FGF-7</td>
<td>Peprotech</td>
<td>100-19</td>
<td>25ng/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>N-Acetylcysteine</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9125-25G</td>
<td>1.25mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Nicotinamide</td>
<td>Sigma</td>
<td>N0636-100G</td>
<td>5mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Noggin UPE</td>
<td>U-Protein Express</td>
<td>Contact company directly</td>
<td>10%</td>
</tr>
<tr>
<td>p38 MAPK-I</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7076-25 mg</td>
<td>1&micro;M</td>
</tr>
<tr>
<td>Primocin</td>
<td>InvivoGen</td>
<td>ant-pm-1</td>
<td>1:500</td>
</tr>
<tr>
<td>RhoKI Y-27632</td>
<td>Abmole Bioscience</td>
<td>M1817_100 mg</td>
<td>2.5&micro;m</td>
</tr>
<tr>
<td>Rspo UPE</td>
<td>U-Protein Express</td>
<td>Contact company directly</td>
<td>10%</td>
</tr>
<tr>
<td>Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>L-Glutathione reduced</td>
<td>Sigma</td>
<td>G4251-10MG</td>
<td>0.5 &mu;g/&mu;l of OME/OMD/LOM</td>
</tr>
<tr>
<td>Betaine</td>
<td>Sigma</td>
<td>61962</td>
<td>0.5 &mu;g/&mu;l of OME/OMD/LOM</td>
</tr>
<tr>
<td>L-Cysteine</td>
<td>Sigma</td>
<td>168149-2.5G</td>
<td>0.5 &mu;g/&mu;l of OME/OMD/LOM</td>
</tr>
<tr>
<td>Linoleic acid</td>
<td>Sigma</td>
<td>L1376-10MG</td>
<td>6.8 &mu;g/ml of OME/OMD /LOM</td>
</tr>
<tr>
<td>Taurine</td>
<td>Sigma</td>
<td>T0625-10MG</td>
<td>0.5 &mu;g/&mu;l of OME/OMD/LOM</td>
</tr>
<tr>
<td>Blocking buffer (for immunoflourescence staining)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Donkey/Goat serum</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>C06SB</td>
<td>2%</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>70011044</td>
<td>Make upto 100ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>Merck</td>
<td>P1379</td>
<td>0.1%</td>
</tr>
<tr>
<td>List of Antibodies used </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa 568 goat anti-rabbit</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A-11011</td>
<td>Dilution-1:500; RRID: AB_143157</td>
</tr>
<tr>
<td>Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>A400FLK</td>
<td>Dilution- 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>IMS400-20</td>
<td>Dilution-1:500</td>
</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D1306</td>
<td>Dilution-1:1000; RRID : AB_2629482</td>
</tr>
<tr>
<td>Phalloidin-Alexa 674</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A22287</td>
<td>Dilution-1:1000; RRID: AB_2620155</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O'Connor (co-author).</td>
<td>Upon request</td>
<td>Upon request</td>
<td>Dilution-1:500</td>
</tr>
<tr>
<td>Sporo-Glo</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>A600FLR-1X</td>
<td>Dilution- 1:200</td>
</tr>
</tbody>
</table>

studying cryptosporidium infection in 3d tissue-derived human organoid culture systems by microinjection

קריפטוספורידיום parvum הוא אחד הגורמים העיקריים של מחלת diarrheal אנושי. כדי להבין את הפתולוגיה של הטפיל ולפתח תרופות יעילות, מערכת תרבות מבחנה המהווה את התנאים במארח יש צורך. אורגנואידים, הדומה מאוד לרקמות המוצא שלהם, הם אידיאליים ללימוד אינטראקציות מארחים-פרזיאליות. אורגנואידים הם תלת-ממדיים (3D) מבנים מבוססי רקמה הנגזרים מתאי גזע בוגרים וגדלים בתרבות לפרקי זמן ארוכים מבלי לעבור סטייה גנטית או טרנספורמציה. יש להם קוטביות מוגדרת היטב עם משטחי פסגה וגם בזלת צלעות. אורגנואידים יש יישומים שונים בדיקות סמים, ביו בנקאות, ומידול מחלות ומארח-חיידק אינטראקציה לימודים. כאן אנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד של איך להכין את הנבגים ואת הספוראוזוטים של קריפטוספורידיום לזיהום המעי האנושי אורגנואידים. אנו לאחר מכן להדגים כיצד מיקרוהזרקה ניתן להשתמש כדי להזריק את החיידקים לתוך אורגאיד לומן. ישנן שלוש שיטות עיקריות שבהן ניתן להשתמש באורגנואידים למחקרים מארחים-חיידק-מיקרוהזרקה, הטיה מכנית וציפוי, ועל ידי ביצוע monolayers. מיקרוהזרקה מאפשרת תחזוקה של המבנה התלת-ממדי ומאפשרת שליטה מדויקת באמצעי הטפיל והמגע הישיר הרשמי של החיידקים. אנו מספקים פרטים עבור צמיחה אופטימלית של אורגנואידים עבור הדמיה או הייצור הoocyst. בסופו של דבר, אנו גם להדגים כיצד אאוציסטות שנוצר לאחרונה ניתן מבודד אורגאיד עבור המשך עיבוד וניתוח במורד הזרם.

הפרוטוקולים המוצגים כאן התוצאה היא טיהור יעיל של האוציסטות והספורזוטים (איור 1A) מוכן הזרקת מיקרו. הפרוטוקול בתחנת המשטרה מביא לשחרורו של הספוראוזוטים מ-70%-80% מהציסטות, ולכן חיוני לסנן את שאר הפגזים והצדפים דרך מסנן של 3 יקרומטר. הסינון מביא כמעט 100% לטיהור הספוראוזוט (<strong class...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection at JoVE.com

Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection

אנו מתארים פרוטוקולים כדי להכין זיהומים ולטהר את הנבגים עבור לימוד זיהום של המעי האנושי ואורגאואידים על ידי הקריפטוספורידיום parvum. אנו מדגימים את ההליכים למיקרו הזרקה של טפילים לתוך מעיים אורגנואיד וכתמים של אורגנואידים. לבסוף, אנו מתארים את הבידוד. של ציסטות שנוצרו מהאורגנואידים

לימוד זיהום הצפנה ברקמה תלת-ממדית-מערכות תרבות מיקרואיד של האדם הנגזר על ידי מיקרו-הזרקה

Cryptosporidium parvum is one of the major causes of human diarrheal disease. To understand the pathology of the parasite and develop efficient drugs, an ...

באמצעות הליך טיהור ומיקרו-ג'ינג'יט זה של ספורוזויט, ניתן ללמוד למעשה כל חיידק מארח בכל מערכת איברים המופקת מרקמות. באמצעות טכניקה זו, אנו יכולים לשלוט על כמות ספורוזואיטים טהורים מוזרק לתוך לומן אורגנואיד או בצד האפי של האורגנואיד. כדי לטהר את C.parvum sporozoites, להעביר את oocyst לצינור 15 מיליליטר ו להשתמש מחדש את התאים באחת פעמים 10 כדי oocyst השביעי לכל ריכוז בינוני excystation מיליליטר.לאחר 60 עד 90 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לערבב 14 מיליליטר של פתרון לשטוף מתאים עם oocysts, ומעים את התאים על ידי צנטריפוגה. שאפו את העל-טבעי בזהירות כדי להימנע מאיבוד אוציסטות והתינו מחדש את גלולת הספרוזואיקון ב-3 פעמים 10 עד ל-1-2 מיליליטר של ריכוז DMEM. כדי להסיר את כל oocysts הנותרים ופגזים, מניחים חבית מזרק 10 מיליליטר מצויד ב מכשיר מחזיק מסנן 47 מיליליטר מצויד במסנן פוליקרבונט בגודל נקבובית שלושה מיקרומטר לתוך צינור 15 מיליליטר בארבע מעלות צלזיוס.הוסף 7.5 מיליליטר של ההשעיה ספורוזויט להרכבת המסנן. כאשר הנפח כולו עבר דרך מסננת על ידי כוח הכבידה, לשטוף את כל התאים הנותרים דרך מסננת עם עוד 7.5 מיליליטר של DMEM. כאשר כל הכביסה עברה דרך מסננת, לאסוף את ההשעיה ספורוזואיט מסונן על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ולתייג את גלולה ב 50 כדי 100 microliters של מדיום תרבות אורגנואידית מתאימה, בתוספת 0.05% צבע ירוק מהיר, ו L-גלוטתיון, betaine, L-cysteine, חומצה לינולאית, ו taurine המכיל חיץכדי microinject את הטפילים לתוך הצד apical של אורגנואיד 3D, תחילה להשתמש מושך micropipette להכין נימים הזרקת זכוכית. השתמש במקלפים כדי לחתוך את קצה נימי לקוטר 9 עד 12 מיקרומטר כדי לאפשר זרימה קלה של sporozoites או oocysts, אם תבחר להזריק oocysts ישירות, ולהשתמש טיפים מיקרו מטעין כדי למלא כל נימי עם צבע ירוק מהיר שכותרתו oocyst או השעיה sporozoite. לאחר מכן, לטעון את נימי הראשון מלא ספורוזויט לתוך microinjector ולהשתמש מיקרוסקופ הפוך בהגדלה 5x ולחץ מתמיד microinject 100 כדי 200 nanoliters של ההשעיה לתוך כל organoid.פרוטוקול excystation תוצאות שחרורו של sporozoites מכ 70 עד 80% של oocysts. לכן, חיוני לסנן את קליפות oocyst הנותרים באמצעות סינון שלושה מיקרומטר. הסר כמעט 100% מהבעיות הבלתי מוסברות.יתר על כן, תוספת של צבע ירוק מסייע להבטיח את הזריקה של כל האורגנואידים, ומאפשר הדמיה של אורגנואידים מוזרק לפחות 24 שעות לאחר ההזרקה. למרות שזו שיטה מתורגל היטב, סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים יכול לשמש כדי להבטיח כי תהליך excystation לא לפגוע sporozoites או oocysts. הזרקת כמויות שוות של oocysts לתוך לומן אורגנואיד יכול להיות מאושר חזותית על ידי הדמיה מיקרוסקופית פשוטה.בדיקות immunofluorescence יכול לשמש גם כדי לחקור את סוגי התאים הנגועים Cryptosporidium. לאחר האורגנואידים המובחנים נדבקו במשך חמישה ימים, נוכחותם של sporozoites בתוך oocysts ניתן לאשר על ידי ייבוש חלק של oocysts על שקופית דבק, תיקון oocysts עם מתנול, ושילוב כתמי DAPI עם נוגדן ספציפי oocyst מתאים. לקבלת תוצאות מרביות, יש להשתמש ב-oocysts טריים, להשתמש באותו נימי עבור כל הזריקות ולשנות את המדיה כל יום לאחר ההזרקה.באמצעות טכניקה זו, מעבדות שונות מתחילות כעת להשתמש באורגנואידים כדי לחקור אינטראקציות בין חיידקים מארחים. אנו לומדים commensals, כמו גם פתוגנים אחרים בהגדרות מיקרוקולטורה אורגנואידית דומה. כמו Cryptosporidium הוא טפיל אנושי, חשוב לבצע ניסויים אלה על פי תקנות בטיחות ברמה 2.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Keratitis חוזר herpetic סטרומה בעכברים, מודל ללימוד HSK אנוש

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

הערכת חישה המולדת של CD4 הנגוע ב- HIV-1<sup&gt; +</sup&gt; T תאים על ידי תאים דנדריטים Plasmacytoid שימוש<em&gt; Ex vivo</em&gt; עמית תרבות מערכת.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Organoids כמודל למחלות זיהומיות: התרבות של האדם וOrganoids הקיבה Murine וMicroinjection של הליקובקטר פילורי

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

העכבר ואת האדם-נגזר תרבות ראשי קיבה אפיתל חד שכבתי לצורך המחקר של התחדשות

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

מדידת דנגה נגיף RNA תגובת שיקוע התרבות של תאים נגועים על ידי תגובת שרשרת של פולימראז כמותיים בזמן אמת

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

ניתוח אינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה של האדם באמצעות מערכות תסיסה מחוץ לאמבט

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

טיהור של תשואה גבוהה לחילוץ ההכנות הרחק וירוס

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

זיהום פנאומטי של תאים אנושיים ראשוניים של האדם בזרימה קבועה

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

מדידת פאיגוציטוזה של אספרגייוס מחטאים מחט על ידי האדם לוקיולוציטים באמצעות זרם ציטוטוטרי

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...