Name: studying cryptosporidium infection in 3d tissue-derived human organoid culture systems by microinjection
Uploaded: 2019-09-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection at JoVE.com

Agradecemos a Deborah a. Schaefer, da escola de Ciências Biomédicas de animais e comparativos, da faculdade de agricultura e ciências biológicas da Universidade do Arizona, Tucson, AZ, EUA, por nos ajudar com a produção e análise do oocisto. Nós igualmente Agradecemos o centro da microscopia e da imagem latente de Franceschi e o DL Mullendore na Universidade de estado de Washington para a preparação e a imagem latente de ooocysts organoid isolados.
D.D. é o beneficiário de um subsídio de VENI da organização neerlandesa para a investigação científica (NWO-ALW, 016. Veni. 171.015). I.H. é o beneficiário de uma subvenção VENI da organização neerlandesa de investigação científica (NWO-ALW, 863.14.002) e foi apoiado por bolsas Marie Curie da Comissão Europeia (proposta 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF). A investigação que conduz a estes resultados recebeu financiamento do Conselho Europeu de investigação no âmbito do acordo de subvenção avançado do ERC n. º 67013 e da NIH NIAIH R21 AT009174 à RMO. Este trabalho faz parte do Instituto Oncode, que é parcialmente financiado pela sociedade holandesa do cancro e foi financiado por uma subvenção da sociedade holandesa do cancro.

Toda a manipulação e Resection do tecido foram executados protocolos aprovados da placa de revisão institucional (IRB) com consentimento paciente.
1. preparação de oocistos de C. parvum para injeção
Nota: Os oocistos de Cryptosporidium foram adquiridos de uma fonte comercial (ver a tabela de materiais). Estes oocistos são produzidos em bezerros e são armazenados em soro-tampão fosfato (PBS) com antibiótico...

<ol>
	<li>Checkley, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+global+burden,+novel+diagnostics,+therapeutics,+and+vaccine+targets+for+Cryptosporidium.">A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium.</a> The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).</li><li>Bones, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past+and+future+trends+of+Cryptosporidium+in+vitro+research.">Past and future trends of Cryptosporidium in vitro research.</a> Experimental Parasitology. 196, 28-37 (2018).</li><li>Muller, J., Hemphill, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+systems+for+the+study+of+apicomplexan+parasites+in+farm+animals.">In vitro culture systems for the study of apicomplexan parasites in farm animals.</a> International Journal for Parasitology. 43 (2), 115-124 (2013).</li><li>Karanis, P., Aldeyarbi, H. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Bioengineered+Three-Dimensional+Human+Intestinal+Model+for+Long-Term+Infection+of+Cryptosporidium+parvum.">Novel Bioengineered Three-Dimensional Human Intestinal Model for Long-Term Infection of Cryptosporidium parvum.</a> Infection and Immunity. 85 (3), (2017).</li><li>Miller, C. 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P., Chen, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+Cryptosporidium+infection.">The cell biology of Cryptosporidium infection.</a> Microbes and Infection. 13 (8-9), 721-730 (2011).</li><li>Lendner, M., Daugschies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptosporidium+infections:+molecular+advances.">Cryptosporidium infections: molecular advances.</a> Parasitology. 141 (11), 1511-1532 (2014).</li><li>Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acids+enhance+invasiveness+of+Cryptosporidium+spp.+into+cultured+cells.">Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells.</a> Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).</li><li>O'Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Cpgp40/15+in+Toxoplasma+gondii:+a+surrogate+system+for+the+study+of+Cryptosporidium+glycoprotein+antigens.">Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens.</a> Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).</li><li>Wilke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+Antibodies+to+Intracellular+Stages+of+Cryptosporidium+parvum+Define+Life+Cycle+Progression+In+Vitro.">Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro.</a> mSphere. 3 (3), (2018).</li><li>Vinayak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modification+of+the+diarrhoeal+pathogen+Cryptosporidium+parvum.">Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum.</a> Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).</li><li>Dijkstra, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Tumor-Reactive+T+Cells+by+Co-culture+of+Peripheral+Blood+Lymphocytes+and+Tumor+Organoids.">Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids.</a> Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).</li></ol>

A cultura de parasitas de Cryptosporidium em organóides intestinais e de vias aéreas fornece um modelo preciso para estudar interações parasita-hospedeiro10 , mas também tem muitas outras aplicações. Por exemplo, os métodos atuais de seleção e propagação de parasitas de Cryptosporidium geneticamente modificados necessitam de passagem em camundongos19 , o que não permite o isolamento de parasitas que têm modificações essenciais para a infec?...

O desenvolvimento de medicamentos ou vacinas para tratamento e prevenção da infecção por Cryptosporidium tem sido dificultado pela falta de sistemas in vitro que imitam precisamente a situação in vivo em humanos1,2. Muitos dos sistemas atualmente disponíveis permitem apenas a infecção a curto prazo (< 5 dias) ou não suportam o ciclo de vida completo do parasita3,4. Outros sistemas que permitam o desenvolvimento completo do parasita são baseados em linhas celulares imortalizadas ou linhas de células cancerosas que não recapitulam fielmente a situação fisiológica em humanos5,6,7 . Organóides ou ' miniórgãos ' são estruturas derivadas de tecido 3D que são cultivadas em uma matriz extracelular suplementada com vários fatores de crescimento específicos do tecido. Organóides foram desenvolvidos a partir de vários órgãos e tecidos. Eles são geneticamente estáveis e recapitulam a maioria das funções dos órgãos de sua origem, e podem ser mantidos em cultura por longos períodos de tempo. Nós desenvolvemos um método para infectar organóides intestinais e pulmonares humanos com Cryptosporidium que fornece um modelo in vitro exato para o estudo de interações hospedeiro-parasita relevantes para a criptosporidiose intestinal e respiratória8 ,9,10,11,12,13. Em contraste com outros modelos de cultura publicados, o sistema organoide é representativo das interações do parasita hospedeiro da vida real, permite a conclusão do ciclo de vida para que todos os estágios do ciclo de vida do parasita possam ser estudados, e mantém a propagação do parasita até 28 dias10.
O Cryptosporidium parvum é um parasita apicomplexum que infecta o epitélio dos tratos respiratório e intestinal, causando doença diarreica prolongada. A fase ambiental resistente é o oocisto, encontrado em alimentos contaminados e água14. Uma vez ingerido ou inalado, o oocisto excistos e libera quatro esporozoítos que se unem às células epiteliais. Os esporozoítos deslizam sobre as células hospedeiras e envolvem receptores de células hospedeiras, mas o parasita não invade totalmente a célula, e parece induzir a célula hospedeira a engolir15. O parasita, que é internalizado dentro de um compartimento intracelular mas extracytoplasmic, permanece na superfície apical da pilha, replicando dentro de um vacuole do vacúolos parasitóforos. Ele sofre duas rodadas de reprodução assexuada — um processo chamado merogonia. Durante a merogonia, o tipo I meronts desenvolve que contêm oito merozoítos que são liberados para invadir novas células. Estes merozoítos invadem novas células para se desenvolverem em merontes tipo II contendo quatro merozoítos. Estes merozoites, quando liberados, infectam as células e se desenvolvem em macrogamonts e microgamonts. Microgametas são liberados e fertilizar os macrogametas produzindo zigotos que amadurecem em oocistos. Os oocistos maduros são liberados subseqüentemente no lúmen. Os oocistos são ou de paredes finas que imediatamente exquisto para reinfectar o epitélio, ou paredes grossas que são liberados para o ambiente para infectar o próximo hospedeiro14. Todas as etapas do ciclo de vida de Cryptosporidium foram identificadas no sistema de cultivo organoide previamente desenvolvido pelo nosso grupo10.
Como os organóides humanos replicam fielmente os tecidos humanos9,11,13, e apoiam todos os estágios replicativos do Cryptosporidium10, eles são o sistema ideal de cultura tecidual para estudar Biologia de Cryptosporidium e interações hospedeiro-parasita. Aqui nós descrevemos os procedimentos para infectar organóides com oocistos do Cryptosporidium e os sporozoites metacercárias, e isolando os ooocysts novos produzidos neste sistema da cultura do tecido.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>Basement membrane extract (extracellular matrix)</td>
<td>amsbio</td>
<td>3533-010-02</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody)</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>A400FLR-1X</td>
<td>Final Concentration = Use 2-3 drops/slide</td>
</tr>
<tr>
<td>Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>IMS400-20</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dynamag 15 rack</td>
<td>Thermofisher Scientific</td>
<td>12301D</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dynamag 2 rack</td>
<td>Thermofisher Scientific</td>
<td>12321D</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>EMD Millipore&nbsp;Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3&micro;m</td>
<td>EMD-Millipore</td>
<td>TSTP02500</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Fast green dye</td>
<td>SIGMA</td>
<td>F7252-5G&nbsp;&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Femtojet 4i Microinjector</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5252000013</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass capillaries of 1 mm diameter</td>
<td>WPI</td>
<td>TW100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Matrigel (extracellular matrix)</td>
<td>Corning</td>
<td>356237</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Microfuge tube 1.5ml</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>T9661-1000EA</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro-loader tips</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>612-7933</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Micropipette puller P-97</td>
<td>Shutter instrument</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Normal donkey Serum</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>C06SB</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Penstrep</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium hypoclorite (use 5%)</td>
<td>Clorox</td>
<td>50371478</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Super stick slides</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>S100-3</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Swinnex-25 47mm Polycarbonate filter holder</td>
<td>EMD-Millipore</td>
<td>SX0002500</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Taurocholic acid sodium salt hydrate</td>
<td>SIGMA</td>
<td>T4009-5G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Tween-20</td>
<td>Merck</td>
<td>8221840500</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Vectashield mounting agent</td>
<td>Vector Labs</td>
<td>H-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Vortex Genie 2</td>
<td>Scientific industries, Inc</td>
<td>SI0236</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Final amount</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12634-010</td>
<td>500ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Penstrep</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>5ml of stock in 500ml DMEM</td>
</tr>
<tr>
<td>Glutamax</td>
<td>Gibco</td>
<td>35050038</td>
<td>5ml of stock in 500ml DMEM</td>
</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
<td>Gibco</td>
<td>15630056</td>
<td>5ml of stock in 500ml DMEM</td>
</tr>
<tr>
<td> INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>A83-01</td>
<td>Tocris</td>
<td>2939-50mg</td>
<td>0.5&micro;M</td>
</tr>
<tr>
<td>Adv+++</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>make upto 100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>B27</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504044</td>
<td>1X</td>
</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
<td>Peprotech</td>
<td>AF-100-15</td>
<td>50ng/mL</td>
</tr>
<tr>
<td>Gastrin</td>
<td>Tocris</td>
<td>3006-1mg</td>
<td>10 nM</td>
</tr>
<tr>
<td>NAC</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9125-25G</td>
<td>1.25mM</td>
</tr>
<tr>
<td>NIC</td>
<td>Sigma</td>
<td>N0636-100G</td>
<td>10mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Noggin CM</td>
<td>In house*</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10%</td>
</tr>
<tr>
<td>P38 inhibitor (SB202190)</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7076-25 mg</td>
<td>10&micro;M</td>
</tr>
<tr>
<td>PGE2</td>
<td>Tocris</td>
<td>2296/10</td>
<td>10 nM</td>
</tr>
<tr>
<td>Primocin</td>
<td>InvivoGen</td>
<td>ant-pm-1</td>
<td>1ml/500ml media</td>
</tr>
<tr>
<td>RSpoI CM</td>
<td>In house*</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>20%</td>
</tr>
<tr>
<td>Wnt3a CM</td>
<td>In house*</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>50%</td>
</tr>
<tr>
<td>In house* - cell lines will be provided upon request</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME)</td>
</tr>
<tr>
<td>LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Adv+++</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>make upto 100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>ALK-I A83-01</td>
<td>Tocris</td>
<td>2939-50mg</td>
<td>500nM</td>
</tr>
<tr>
<td>B27</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504044</td>
<td>0.0763888889</td>
</tr>
<tr>
<td>FGF-10</td>
<td>Peprotech</td>
<td>100-26</td>
<td>100ng/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>FGF-7</td>
<td>Peprotech</td>
<td>100-19</td>
<td>25ng/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>N-Acetylcysteine</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9125-25G</td>
<td>1.25mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Nicotinamide</td>
<td>Sigma</td>
<td>N0636-100G</td>
<td>5mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Noggin UPE</td>
<td>U-Protein Express</td>
<td>Contact company directly</td>
<td>10%</td>
</tr>
<tr>
<td>p38 MAPK-I</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7076-25 mg</td>
<td>1&micro;M</td>
</tr>
<tr>
<td>Primocin</td>
<td>InvivoGen</td>
<td>ant-pm-1</td>
<td>1:500</td>
</tr>
<tr>
<td>RhoKI Y-27632</td>
<td>Abmole Bioscience</td>
<td>M1817_100 mg</td>
<td>2.5&micro;m</td>
</tr>
<tr>
<td>Rspo UPE</td>
<td>U-Protein Express</td>
<td>Contact company directly</td>
<td>10%</td>
</tr>
<tr>
<td>Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>L-Glutathione reduced</td>
<td>Sigma</td>
<td>G4251-10MG</td>
<td>0.5 &mu;g/&mu;l of OME/OMD/LOM</td>
</tr>
<tr>
<td>Betaine</td>
<td>Sigma</td>
<td>61962</td>
<td>0.5 &mu;g/&mu;l of OME/OMD/LOM</td>
</tr>
<tr>
<td>L-Cysteine</td>
<td>Sigma</td>
<td>168149-2.5G</td>
<td>0.5 &mu;g/&mu;l of OME/OMD/LOM</td>
</tr>
<tr>
<td>Linoleic acid</td>
<td>Sigma</td>
<td>L1376-10MG</td>
<td>6.8 &mu;g/ml of OME/OMD /LOM</td>
</tr>
<tr>
<td>Taurine</td>
<td>Sigma</td>
<td>T0625-10MG</td>
<td>0.5 &mu;g/&mu;l of OME/OMD/LOM</td>
</tr>
<tr>
<td>Blocking buffer (for immunoflourescence staining)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Donkey/Goat serum</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>C06SB</td>
<td>2%</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>70011044</td>
<td>Make upto 100ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>Merck</td>
<td>P1379</td>
<td>0.1%</td>
</tr>
<tr>
<td>List of Antibodies used </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa 568 goat anti-rabbit</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A-11011</td>
<td>Dilution-1:500; RRID: AB_143157</td>
</tr>
<tr>
<td>Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>A400FLK</td>
<td>Dilution- 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>IMS400-20</td>
<td>Dilution-1:500</td>
</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D1306</td>
<td>Dilution-1:1000; RRID : AB_2629482</td>
</tr>
<tr>
<td>Phalloidin-Alexa 674</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A22287</td>
<td>Dilution-1:1000; RRID: AB_2620155</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O'Connor (co-author).</td>
<td>Upon request</td>
<td>Upon request</td>
<td>Dilution-1:500</td>
</tr>
<tr>
<td>Sporo-Glo</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>A600FLR-1X</td>
<td>Dilution- 1:200</td>
</tr>
</tbody>
</table>

studying cryptosporidium infection in 3d tissue-derived human organoid culture systems by microinjection

O parvum de Cryptosporidium é uma das causas principais da doença diarreicas humana. Para compreender a patologia do parasita e desenvolver drogas eficientes, um sistema in vitro da cultura que recapitula as circunstâncias no anfitrião é necessário. Organóides, que se assemelham estreitamente aos tecidos de sua origem, são ideais para estudar interações hospedeiro-parasita. Os organóides são estruturas derivadas de tecido tridimensionais (3D) derivadas de células-tronco adultas e crescem em cultura por longos períodos de tempo sem sofrer qualquer aberração genética ou transformação. Têm a polaridade bem definida com superfícies apical e basolateral. Organóides têm várias aplicações em testes de drogas, biobancário, e modelagem de doenças e estudos de interação hospedeiro-micróbio. Aqui nós apresentamos um protocolo passo a passo de como preparar os oocistos e os esporozoítos do Cryptosporidium para infectar organoids intestinais e da via aérea humana. Nós demonstramos então como a microinjeção pode ser usada para injetar os micróbios no lúmen organoid. Existem três métodos principais pelos quais os organóides podem ser usados para estudos de interação hospedeiro-micróbe — microinjeção, cisalhamento mecânico e chapeamento, e fazendo monolayers. Microinjection permite a manutenção da estrutura 3D e permite o controle preciso de volumes do parasita e de contato lateral apical direto para os micróbios. Nós fornecemos detalhes para o crescimento ideal dos organóides para a produção da imagem latente ou do ooocyst. Finalmente, nós igualmente demonstramos como os ooocysts recentemente gerados podem ser isolados do organoid para um processamento e uma análise a jusante mais adicionais.

Os protocolos aqui apresentados resultam na purificação eficiente de oocistos e esporozoítos (Figura 1a) prontos para a microinjeção. O protocolo do excistação conduz à liberação dos esporozoítos de aproximadamente 70 – 80% dos ooocysts, conseqüentemente é essencial filtrar para fora os ooocysts e os escudos restantes através de um filtro de 3 μm. A filtração resulta em quase 100% de purificação de esporozoíta (Figura 1b). Além disso, a ad...

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Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection

Nós descrevemos protocolos para preparar ooocysts e purificar esporozoítos para estudar a infecção de organóides intestinais e da via aérea humanos pelo parvum de Cryptosporidium. Nós demonstramos os procedimentos para o microinjection dos parasita no lúmen organoid intestinal e na imunocoloração dos organoids. Finalmente, nós descrevemos o isolamento de ooocysts gerados dos organoids.

Estudando infecção por Cryptosporidium em sistemas de cultura Organóide humano derivado do tecido 3D por microinjeção

Cryptosporidium parvum is one of the major causes of human diarrheal disease. To understand the pathology of the parasite and develop efficient drugs, an ...

Usando este procedimento de purificação e microinjeção de sporozoita, essencialmente qualquer micróbio hospedeiro pode ser estudado em qualquer sistema de órgão derivado do tecido. Usando esta técnica, podemos controlar a quantidade de esporozoitas puros injetados no lúmen organoide ou no lado apical do organoide. Para purificar os esporozoites de C.parvum, transfira o oocisto para um tubo de 15 mililitros e resuspenque as células em uma única vez 10 a 7 vezes o oocito por concentração média de extivestação mililitro.Após 60 a 90 minutos a 37 graus Celsius, misture 14 mililitros de uma solução de lavagem apropriada com os oócitos, e sedimente as células por centrifugação. Aspire o supernatante cuidadosamente para evitar perder oocistos e resuspensar a pelota esozoica em um três vezes 10 para o sétimo oociista por um a dois mililitros de concentração de DMEM. Para remover quaisquer oocistos e conchas restantes, coloque um barril de seringa de 10 mililitros equipado com um aparelho de suporte de filtro de 47 mililitros equipado com um filtro de policarbonato de tamanho de três micrômetros em um tubo de 15 mililitros a quatro graus Celsius.Adicione 7,5 mililitros da suspensão do sporozoita ao conjunto do filtro. Quando todo o volume tiver passado pelo coador pela gravidade, lave todas as células restantes através do coador com outros 7,5 mililitros de DMEM. Quando toda a lavagem passar pelo filtro, colete a suspensão de sporozoita filtrada por centrifugação por 10 minutos e rotule a pelota em 50 a 100 microliters de um meio de cultura organoide apropriado, complementado com corante verde 0,05% rápido, e L-glutathione, betaine, L-cisteína, ácido linoleico e taurino contendo tampão redutor.Para microinjetar os parasitas no lado apical de um organoide 3D, primeiro use um puxador de micropipette para preparar capilares de injeção de vidro. Use fórceps para cortar a ponta do capilar para um diâmetro de nove a 12 micrômetros para permitir um fluxo fácil de esporozoites ou oocistos, se você optar por injetar oocistos diretamente, e usar dicas de micro-carregador para encher cada capilar com um corante verde rápido rotulado oocisto ou suspensão sporozoita. Em seguida, carregue o primeiro capilar preenchido com esporozoita em um microinjetor e use um microscópio invertido a uma ampliação de 5x e uma pressão constante para microinjetar 100 a 200 nanolitros da suspensão em cada organoide.O protocolo de excisão resulta na liberação de esporozoites de aproximadamente 70 a 80% dos oocistos. Portanto, é essencial filtrar as conchas oocistas restantes através de uma filtragem de três micrômetros. Remova quase 100% dos oocistos não excitados.Além disso, a adição de um corante verde ajuda a garantir a injeção de todos os organoides, e permite a visualização dos organoides injetados por pelo menos 24 horas após a injeção. Embora este seja um método bem praticado, a microscopia eletrônica de varredura pode ser usada para garantir que o processo de excisão não danifique os esporozoitas ou os oocistos. A injeção de quantidades iguais de oócitos no lúmen organoide pode ser confirmada visualmente por imagens microscópicas simples.Ensaios de imunofluorescência também podem ser usados para explorar os tipos de células que são infectadas pelo Cryptosporidium. Após os organoides diferenciados terem sido infectados por cinco dias, a presença de esporozoitas dentro dos oocistos pode ser confirmada secando uma porção dos oocistos em um slide adesivo, fixando os oócitos com metanol e combinando a coloração da DAPI com um anticorpo específico para oocistos adequados. Para obter resultados máximos, use oocistos frescos, use o mesmo capilar para todas as injeções e mude a mídia todos os dias após a injeção.Usando essa técnica, vários laboratórios estão começando a usar organoides para estudar interações hospedeira-micróbios. Estamos estudando commensais, bem como outros patógenos em configurações de microcultura organoide semelhante. Como o Cryptosporidium é um parasita humano, é importante realizar esses experimentos de acordo com as normas de segurança nível 2.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Ceratite herpética recorrente Estroma em camundongos, um modelo para estudar HSK Humanos

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

Imunologia e Infecção

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Avaliando a inata Sensing de HIV-1 CD4 Infected<sup&gt; +</sup&gt; As células T por células dendríticas plasmocitóides Usando um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura do sistema.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Organóides como modelo para Doenças Infecciosas: Cultura dos Direitos Humanos e Organóides e estômago murino Microinjection do Helicobacter pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

Mouse e humanos derivada de cultura de monocamada epitelial gástrica primária para o estudo da regeneração

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Quantificação de Efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

Dengue vírus RNA no sobrenadante de cultura de células infectadas por reação em cadeia da polimerase em tempo real de quantitativos de medição

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

Análise de interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana usando sistemas de fermentação de banho in vitro

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

Purificação de preparações de vesículas extracelulares de alto rendimento longe do vírus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Infecção pneumocócica de células endotélias humanas primárias em fluxo constante

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Medição de phagocitose de Aspergillus fumigatus Conidia por Leukocytes Humanos usando citometria flow

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...