Name: studying cryptosporidium infection in 3d tissue-derived human organoid culture systems by microinjection
Uploaded: 2019-09-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection at JoVE.com

Estamos agradecidos a Deborah A. Schaefer de la Escuela de Ciencias Biomédicas Animales y Comparadas, Facultad de Agricultura y Ciencias de la Vida, Universidad de Arizona, Tucson, AZ, EE. UU. por ayudarnos con la producción y análisis de ovocitos. También agradecemos a Franceschi Microscopy and Imaging Center y a D.L. Mullendore de la Universidad Estatal de Washington por la preparación de TEM y la toma de imágenes de ovocitos organoides aislados.
D.D. es beneficiario de una subvención VENI de la Organización Neerlandesa de Investigación Científica (NWO-ALW, 016.Veni.171.015). I.H. es galardonado con una beca VENI de la Organización Neerlandesa de Investigación Científica (NWO-ALW, 863.14.002) y recibió el apoyo de becas Marie Curie de la Comisión Europea (Propuesta 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF). La investigación que ha llevado a estos resultados ha recibido financiación del Consejo Europeo de Investigación en virtud del Acuerdo Avanzado de Subvenciones DEL ERC no 67013 y del NIH NIAIH en virtud de R21 AT009174 a RMO. Este trabajo es parte del Instituto Oncode, que es financiado en parte por la Sociedad Holandesa contra el Cáncer y fue financiado por una subvención de la Sociedad Holandesa contra el Cáncer.

Todo el manejo y resección de tejidos se realizó bajo protocolos aprobados por la Junta de Revisión Institucional (IRB) con el consentimiento del paciente.
1. Preparación de C. parvum Oocysts for Injection
NOTA: Los ovocitos de Cryptosporidium se compraron en una fuente comercial (ver la Tabla de Materiales). Estos ovocitos se producen en terneros y se almacenan en solución salina con fosfato tampón (PBS) con a...

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	<li>Checkley, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+global+burden,+novel+diagnostics,+therapeutics,+and+vaccine+targets+for+Cryptosporidium.">A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium.</a> The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).</li><li>Bones, A. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Bioengineered+Three-Dimensional+Human+Intestinal+Model+for+Long-Term+Infection+of+Cryptosporidium+parvum.">Novel Bioengineered Three-Dimensional Human Intestinal Model for Long-Term Infection of Cryptosporidium parvum.</a> Infection and Immunity. 85 (3), (2017).</li><li>Miller, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+culture+platform+for+Cryptosporidium+that+enables+long-term+cultivation+and+new+tools+for+the+systematic+investigation+of+its+biology.">A cell culture platform for Cryptosporidium that enables long-term cultivation and new tools for the systematic investigation of its biology.</a> International Journal for Parasitology. 48 (3-4), 197-201 (2018).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modelling.">Long-term expanding human airway organoids for disease modelling.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Dutta, D., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+to+study+host-pathogen+interactions.">Organoid culture systems to study host-pathogen interactions.</a> Current Opinion in Immunology. 48, 15-22 (2017).</li><li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+Cryptosporidium+infection+in+human+small+intestinal+and+lung+organoids.">Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids.</a> Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+Modeling+in+Stem+Cell-Derived+3D+Organoid+Systems.">Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>O'Hara, S. P., Chen, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+Cryptosporidium+infection.">The cell biology of Cryptosporidium infection.</a> Microbes and Infection. 13 (8-9), 721-730 (2011).</li><li>Lendner, M., Daugschies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptosporidium+infections:+molecular+advances.">Cryptosporidium infections: molecular advances.</a> Parasitology. 141 (11), 1511-1532 (2014).</li><li>Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acids+enhance+invasiveness+of+Cryptosporidium+spp.+into+cultured+cells.">Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells.</a> Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).</li><li>O'Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Cpgp40/15+in+Toxoplasma+gondii:+a+surrogate+system+for+the+study+of+Cryptosporidium+glycoprotein+antigens.">Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens.</a> Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).</li><li>Wilke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+Antibodies+to+Intracellular+Stages+of+Cryptosporidium+parvum+Define+Life+Cycle+Progression+In+Vitro.">Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro.</a> mSphere. 3 (3), (2018).</li><li>Vinayak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modification+of+the+diarrhoeal+pathogen+Cryptosporidium+parvum.">Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum.</a> Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).</li><li>Dijkstra, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Tumor-Reactive+T+Cells+by+Co-culture+of+Peripheral+Blood+Lymphocytes+and+Tumor+Organoids.">Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids.</a> Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).</li></ol>

Cultivo de parásitos Cryptosporidium en organoides intestinales y de las vías respiratorias proporciona un modelo preciso para estudiar las interacciones huésped-parásito10, pero también tiene muchas otras aplicaciones. Por ejemplo, los métodos actuales de selección y propagación de parásitos Cryptosporidium modificados genéticamente requieren el paso en ratones19 que no permite el aislamiento de parásitos que tienen modificaciones esenciales pa...

El desarrollo de fármacos o vacunas para el tratamiento y la prevención de la infección por Cryptosporidium se ha visto obstaculizado por la falta de sistemas in vitro que imitan con precisión la situación in vivo en los seres humanos1,2. Muchos de los sistemas disponibles actualmente sólo permiten la infección a corto plazo (<5 días) o no soportan el ciclo de vida completo del parásito3,4. Otros sistemas que permiten el desarrollo completo del parásito se basan en líneas celulares inmortalizadas o líneas celulares cancerosas que no recapitulan fielmente la situación fisiológica en los seres humanos5,6,7 . Los organoides o 'mini-órganos' son estructuras derivadas de tejido 3D que se cultivan en una matriz extracelular complementada con varios factores de crecimiento específicos del tejido. Los organoides se han desarrollado a partir de diversos órganos y tejidos. Son genéticamente estables y recapitulan la mayoría de las funciones de los órganos de su origen, y pueden mantenerse en cultivo durante largos períodos de tiempo. Hemos desarrollado un método para infectar los organoides intestinales y pulmonares humanos con Cryptosporidium que proporciona un modelo in vitro preciso para el estudio de las interacciones huésped-parásito relevantes para la criptosporidiosis intestinal y respiratoria8 ,9,10,11,12,13. A diferencia de otros modelos de cultivo publicados, el sistema organoide es representativo de las interacciones del parásito huésped de la vida real, permite completar el ciclo de vida para que se puedan estudiar todas las etapas del ciclo de vida del parásito y mantiene la propagación del parásito hasta 28 días10.
Cryptosporidium parvum es un parásito apicomplexiano que infecta el epitelio de las vías respiratorias e intestinales, causando una enfermedad diarreica prolongada. La etapa ambiental resistente es el ovocitos, que se encuentra en los alimentos contaminados y el agua14. Una vez ingeridos o inhalados, el ovocitos y libera cuatro esporozoitos que se unen a las células epiteliales. Los esporozoítos se deslizan sobre las células de los huésped y atraen a los receptores de células huésped, pero el parásito no invade completamente la célula, y parece inducir a la célula huésped a engullirla15. El parásito, que se internaliza dentro de un compartimento intracelular pero extractitoplasma, permanece en la superficie apical de la célula, replicando dentro de una vacuola parasitoforosa. Se somete a dos rondas de reproducción asexual, un proceso llamado merogonía. Durante la merogonía, se desarrollan merontas tipo I que contienen ocho merozoitas que se liberan para invadir nuevas células. Estos merozoítos invaden nuevas células para convertirse en merontas de tipo II que contienen cuatro merozoitas. Estos merozoítos, cuando se liberan, infectan las células y se convierten en macrogamontes y microgamontes. Los microgametos se liberan y fertilizan los macrogametos que producen cigotes que maduran en ovocitos. Los ovocitos maduros se liberan posteriormente en el lumen. Los ovocitos son de paredes delgadas que se exquistan inmediatamente para reinfectar el epitelio, o paredes gruesas que se liberan en el medio ambiente para infectar al siguiente huésped14. Todas las etapas del ciclo de vida de Cryptosporidium han sido identificadas en el sistema de cultivo organoide previamente desarrollado por nuestro grupo10.
Dado que los organoides humanos replican fielmente los tejidos humanos9,11,13, y apoyan todas las etapas replicativas de Cryptosporidium10,son el sistema de cultivo de tejido ideal para estudiar Biología criptosporidio e interacciones huésped-parásito. Aquí describimos los procedimientos para infectar organoides con ovocitos de Cryptosporidium y esporozoitos exquistes, y aislar los nuevos ovocitos producidos en este sistema de cultivo de tejidos.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>Basement membrane extract (extracellular matrix)</td>
<td>amsbio</td>
<td>3533-010-02</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody)</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>A400FLR-1X</td>
<td>Final Concentration = Use 2-3 drops/slide</td>
</tr>
<tr>
<td>Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>IMS400-20</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dynamag 15 rack</td>
<td>Thermofisher Scientific</td>
<td>12301D</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dynamag 2 rack</td>
<td>Thermofisher Scientific</td>
<td>12321D</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>EMD Millipore&nbsp;Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3&micro;m</td>
<td>EMD-Millipore</td>
<td>TSTP02500</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Fast green dye</td>
<td>SIGMA</td>
<td>F7252-5G&nbsp;&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Femtojet 4i Microinjector</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5252000013</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass capillaries of 1 mm diameter</td>
<td>WPI</td>
<td>TW100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Matrigel (extracellular matrix)</td>
<td>Corning</td>
<td>356237</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Microfuge tube 1.5ml</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>T9661-1000EA</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro-loader tips</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>612-7933</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Micropipette puller P-97</td>
<td>Shutter instrument</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Normal donkey Serum</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>C06SB</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Penstrep</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium hypoclorite (use 5%)</td>
<td>Clorox</td>
<td>50371478</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Super stick slides</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>S100-3</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Swinnex-25 47mm Polycarbonate filter holder</td>
<td>EMD-Millipore</td>
<td>SX0002500</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Taurocholic acid sodium salt hydrate</td>
<td>SIGMA</td>
<td>T4009-5G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Tween-20</td>
<td>Merck</td>
<td>8221840500</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Vectashield mounting agent</td>
<td>Vector Labs</td>
<td>H-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Vortex Genie 2</td>
<td>Scientific industries, Inc</td>
<td>SI0236</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Final amount</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12634-010</td>
<td>500ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Penstrep</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>5ml of stock in 500ml DMEM</td>
</tr>
<tr>
<td>Glutamax</td>
<td>Gibco</td>
<td>35050038</td>
<td>5ml of stock in 500ml DMEM</td>
</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
<td>Gibco</td>
<td>15630056</td>
<td>5ml of stock in 500ml DMEM</td>
</tr>
<tr>
<td> INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>A83-01</td>
<td>Tocris</td>
<td>2939-50mg</td>
<td>0.5&micro;M</td>
</tr>
<tr>
<td>Adv+++</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>make upto 100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>B27</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504044</td>
<td>1X</td>
</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
<td>Peprotech</td>
<td>AF-100-15</td>
<td>50ng/mL</td>
</tr>
<tr>
<td>Gastrin</td>
<td>Tocris</td>
<td>3006-1mg</td>
<td>10 nM</td>
</tr>
<tr>
<td>NAC</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9125-25G</td>
<td>1.25mM</td>
</tr>
<tr>
<td>NIC</td>
<td>Sigma</td>
<td>N0636-100G</td>
<td>10mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Noggin CM</td>
<td>In house*</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10%</td>
</tr>
<tr>
<td>P38 inhibitor (SB202190)</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7076-25 mg</td>
<td>10&micro;M</td>
</tr>
<tr>
<td>PGE2</td>
<td>Tocris</td>
<td>2296/10</td>
<td>10 nM</td>
</tr>
<tr>
<td>Primocin</td>
<td>InvivoGen</td>
<td>ant-pm-1</td>
<td>1ml/500ml media</td>
</tr>
<tr>
<td>RSpoI CM</td>
<td>In house*</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>20%</td>
</tr>
<tr>
<td>Wnt3a CM</td>
<td>In house*</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>50%</td>
</tr>
<tr>
<td>In house* - cell lines will be provided upon request</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME)</td>
</tr>
<tr>
<td>LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Adv+++</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>make upto 100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>ALK-I A83-01</td>
<td>Tocris</td>
<td>2939-50mg</td>
<td>500nM</td>
</tr>
<tr>
<td>B27</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504044</td>
<td>0.0763888889</td>
</tr>
<tr>
<td>FGF-10</td>
<td>Peprotech</td>
<td>100-26</td>
<td>100ng/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>FGF-7</td>
<td>Peprotech</td>
<td>100-19</td>
<td>25ng/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>N-Acetylcysteine</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9125-25G</td>
<td>1.25mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Nicotinamide</td>
<td>Sigma</td>
<td>N0636-100G</td>
<td>5mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Noggin UPE</td>
<td>U-Protein Express</td>
<td>Contact company directly</td>
<td>10%</td>
</tr>
<tr>
<td>p38 MAPK-I</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7076-25 mg</td>
<td>1&micro;M</td>
</tr>
<tr>
<td>Primocin</td>
<td>InvivoGen</td>
<td>ant-pm-1</td>
<td>1:500</td>
</tr>
<tr>
<td>RhoKI Y-27632</td>
<td>Abmole Bioscience</td>
<td>M1817_100 mg</td>
<td>2.5&micro;m</td>
</tr>
<tr>
<td>Rspo UPE</td>
<td>U-Protein Express</td>
<td>Contact company directly</td>
<td>10%</td>
</tr>
<tr>
<td>Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>L-Glutathione reduced</td>
<td>Sigma</td>
<td>G4251-10MG</td>
<td>0.5 &mu;g/&mu;l of OME/OMD/LOM</td>
</tr>
<tr>
<td>Betaine</td>
<td>Sigma</td>
<td>61962</td>
<td>0.5 &mu;g/&mu;l of OME/OMD/LOM</td>
</tr>
<tr>
<td>L-Cysteine</td>
<td>Sigma</td>
<td>168149-2.5G</td>
<td>0.5 &mu;g/&mu;l of OME/OMD/LOM</td>
</tr>
<tr>
<td>Linoleic acid</td>
<td>Sigma</td>
<td>L1376-10MG</td>
<td>6.8 &mu;g/ml of OME/OMD /LOM</td>
</tr>
<tr>
<td>Taurine</td>
<td>Sigma</td>
<td>T0625-10MG</td>
<td>0.5 &mu;g/&mu;l of OME/OMD/LOM</td>
</tr>
<tr>
<td>Blocking buffer (for immunoflourescence staining)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Donkey/Goat serum</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>C06SB</td>
<td>2%</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>70011044</td>
<td>Make upto 100ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>Merck</td>
<td>P1379</td>
<td>0.1%</td>
</tr>
<tr>
<td>List of Antibodies used </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa 568 goat anti-rabbit</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A-11011</td>
<td>Dilution-1:500; RRID: AB_143157</td>
</tr>
<tr>
<td>Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>A400FLK</td>
<td>Dilution- 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>IMS400-20</td>
<td>Dilution-1:500</td>
</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D1306</td>
<td>Dilution-1:1000; RRID : AB_2629482</td>
</tr>
<tr>
<td>Phalloidin-Alexa 674</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A22287</td>
<td>Dilution-1:1000; RRID: AB_2620155</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O'Connor (co-author).</td>
<td>Upon request</td>
<td>Upon request</td>
<td>Dilution-1:500</td>
</tr>
<tr>
<td>Sporo-Glo</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>A600FLR-1X</td>
<td>Dilution- 1:200</td>
</tr>
</tbody>
</table>

studying cryptosporidium infection in 3d tissue-derived human organoid culture systems by microinjection

Cryptosporidium parvum es una de las principales causas de la enfermedad diarreica humana. Para entender la patología del parásito y desarrollar fármacos eficientes, se necesita un sistema de cultivo in vitro que recapitula las condiciones en el huésped. Los organoides, que se asemejan mucho a los tejidos de su origen, son ideales para estudiar las interacciones huésped-parásito. Los organoides son estructuras tridimensionales (3D) derivadas del tejido que se derivan de células madre adultas y crecen en cultivo durante largos períodos de tiempo sin someterse a ninguna aberración o transformación genética. Tienen una polaridad bien definida con superficies apicales y basolaterales. Los organoides tienen varias aplicaciones en pruebas de drogas, biobanca, y modelado de enfermedades y estudios de interacción huésped-microbio. Aquí presentamos un protocolo paso a paso de cómo preparar los ovocitos y esporozoítos de Cryptosporidium para infectar los organoides intestinales y de las vías respiratorias humanas. A continuación, demostramos cómo se puede utilizar la microinyección para inyectar los microbios en el lumen organoide. Existen tres métodos principales por los que los organoides se pueden utilizar para los estudios de interacción huésped-microbio: microinyección, cizallamiento mecánico y chapado, y mediante la fabricación de monocapas. La microinyección permite el mantenimiento de la estructura 3D y permite un control preciso de los volúmenes del parásito y el contacto lateral apical directo para los microbios. Proporcionamos detalles para el crecimiento óptimo de organoides para la creación de imágenes u ovocitos. Por último, también demostramos cómo los ovocitos recién generados se pueden aislar del organoide para un mayor procesamiento y análisis aguas abajo.

Los protocolos presentados aquí dan como resultado la purificación eficiente de ovocitos y esporozoitos(Figura 1A)listos para la microinyección. El protocolo de excystation da como resultado la liberación de esporozoitos de aproximadamente el 70-80% de los ovocitos, por lo tanto, es esencial filtrar los ovocitos y conchas restantes a través de un filtro de 3 m. La filtración da como resultado una purificación de casi 100% esporozoita(Figura 1B). Además, ...

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Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection

Describimos protocolos para preparar ovocitos y purificar esporozoitos para el estudio de la infección de organoides intestinales y de las vías respiratorias humanas por Cryptosporidium parvum. Demostramos los procedimientos para la microinyección de parásitos en el lumen organoide intestinal y la inmunomancha ción de organoides. Por último, describimos el aislamiento de los ovocitos generados de los organoides.

Estudio de la infección por criptosporidio en sistemas de cultivo organoides humanos derivados del tejido 3D por microinyección

Cryptosporidium parvum is one of the major causes of human diarrheal disease. To understand the pathology of the parasite and develop efficient drugs, an ...

Usando este procedimiento de purificación y microinyección de esporozoíto, esencialmente cualquier microbio huésped puede ser estudiado en cualquier sistema de órganos derivados del tejido. Usando esta técnica, podemos controlar la cantidad de esporozoítos puros inyectados en el lumen organoide o en el lado apical del organoide. Para purificar los esporozoitos de C.parvum, transfiera el ócicle a un tubo de 15 mililitros y resuspendir las células a una multiplicación por 10 al séptimo ócicle por mililitro de concentración media.Después de 60 a 90 minutos a 37 grados Celsius, mezcle 14 mililitros de una solución de lavado adecuada con los ovocitos, y sedimente las células por centrifugación. Aspirar el sobrenadante cuidadosamente para evitar la pérdida de ovocitos y resuspender el pellet esporoico a tres veces 10 al séptimo ovocitos por uno a dos mililitros de concentración DMEM. Para eliminar los ovocitos y conchas restantes, coloque un barril de jeringa de 10 mililitros equipado con un aparato portafiltros de 47 mililitros equipado con un filtro de policarbonato de tres micrómetros de tamaño de poro en un tubo de 15 mililitros a cuatro grados centígrados.Añadir 7,5 mililitros de la suspensión de esporozoito al conjunto del filtro. Cuando todo el volumen haya pasado a través del colador por gravedad, lave las células restantes a través del colador con otros 7,5 mililitros de DMEM. Cuando todo el lavado haya pasado por el colador, recoja la suspensión de esporozoita filtrada por centrifugación durante 10 minutos y etiquete el pellet en 50 a 100 microlitros de un medio de cultivo organoide apropiado, complementado con un tinte verde 0.05% rápido, y L-glututeno, betaína, L-cisteína, ácido linoleico y tamina que contienenPara microinjecupar los parásitos en el lado apical de un organoide 3D, utilice primero un tirador de micropipetas para preparar capilares de inyección de vidrio. Utilice fórceps para cortar la punta del capilar a un diámetro de nueve a 12 micrómetros para permitir un flujo fácil de esporozoitos u ovocitos, si decide inyectar ovocitos directamente, y utilice puntas de micro-cargador para llenar cada capilar con un tinte verde rápido etiquetado como ovocitos o suspensión de espozoito. A continuación, cargue el primer capilar lleno de esporozoío en un microinyector y utilice un microscopio invertido con un aumento de 5x y una presión constante a microinyecyject 100 a 200 nanolitros de la suspensión en cada organoide.El protocolo de excilción da lugar a la liberación de esporozoítos de aproximadamente 70 a 80% de los ovocitos. Por lo tanto, es esencial filtrar las cáscaras de ovocitos restantes a través de una filtración de tres micrómetros. Retire casi el 100% de los ovocitos sin escudrencia.Además, la adición de un tinte verde ayuda a asegurar la inyección de todos los organoides, y permite la visualización de los organoides inyectados durante al menos 24 horas después de la inyección. Aunque se trata de un método bien practicado, la microscopía electrónica de barrido se puede utilizar para garantizar que el proceso de excistation no dañe a los esporozoítos o a los ovocitos. La inyección de cantidades iguales de ovocitos en el lumen organoide se puede confirmar visualmente mediante imágenes microscópicas simples.Los ensayos de inmunofluorescencia también se pueden utilizar para explorar los tipos de células infectadas por Cryptosporidium. Después de que los organoides diferenciados se hayan infectado durante cinco días, la presencia de esporozoítos dentro de los ovocitos puede confirmarse secando una porción de los ovocitos en un portaobjetos adhesivo, fijando los ovocitos con metanol y combinando la tinción DAPI con un anticuerpo específico para ovocitos adecuado. Para obtener los máximos resultados, utilice ovocitos frescos, utilice el mismo capilar para todas las inyecciones y cambie los medios todos los días después de la inyección.Usando esta técnica, varios laboratorios están empezando a usar organoides para estudiar las interacciones huésped-microbio. Estamos estudiando los commensales, así como otros patógenos en entornos de microcultivo organoides similares. Como Cryptosporidium es un parásito humano, es importante realizar estos experimentos de acuerdo con las regulaciones de seguridad de nivel 2.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection

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Queratitis herpética estromal recurrente en ratones, un modelo para el estudio HSK Humanos

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

Investigación

Inmunología e Infección

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

La evaluación de la innata de detección de VIH-1 CD4 infectados<sup&gt; +</sup&gt; Células T por las células dendríticas plasmocitoides Usando un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura del sistema.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Organoides como Modelo para Enfermedades Infecciosas: Cultura de Derechos Humanos y organoides estomacales murinos y microinyección de Helicobacter Pylori

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Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

Cultura de monocapa epitelial gástrico primario derivadas de ratón y humanos para el estudio de la regeneración

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Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

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Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

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Medición de ARN del Virus del Dengue en el sobrenadante de cultivo de las células infectadas por reacción en cadena de la polimerasa cuantitativo en tiempo real

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

Análisis de interacciones entre endobióticos y microbiota de tripa humana utilizando sistemas de fermentación de bañoin in vitro

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Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

Purificación de preparaciones de vesícula extracelular de alto rendimiento lejos del virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Infección por neumococo de células endoteliales humanas primarias en flujo constante

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Medición de la fagocitosis de Aspergillus fumigatus Conidia por leucocitos humanos utilizando citometría de flujo

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...